本發(fā)明涉及顯微成像技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種光學(xué)顯微成像系統(tǒng)及其成像方法。

背景技術(shù)：

顯微成像技術(shù)作為觀測微生物形態(tài)結(jié)構(gòu)的有力手段之一，已在微生物檢測領(lǐng)域獲得廣泛關(guān)注和應(yīng)用。對于光學(xué)顯微成像技術(shù)，按其工作原理的不同，可以分為傳統(tǒng)光學(xué)顯微成像、遠(yuǎn)場生物熒光顯微成像和相差對比顯微成像。傳統(tǒng)光學(xué)顯微成像技術(shù)主要是利用光學(xué)透鏡對物體起到放大或者成像的作用，通過透鏡組合可以把物體放大近千倍。然而，光衍射效應(yīng)的存在，限制了傳統(tǒng)光學(xué)顯微成像技術(shù)中透鏡無限放大的可能。遠(yuǎn)場生物熒光顯微成像主要是通過熒光染料標(biāo)記物體，利用短波長的光源去激發(fā)物體內(nèi)部的標(biāo)記，使其發(fā)射出熒光，從而提高物體在成像中的對比度，同時(shí)還提供了特異性標(biāo)記，便于在大規(guī)模族群中的追蹤和識(shí)別。相差對比顯微成像是利用光學(xué)干涉的原理，將入射光通過透明物體產(chǎn)生的光程差轉(zhuǎn)變?yōu)楣鈴?qiáng)差，體現(xiàn)在ccd檢測器中，突出透明物體的內(nèi)部細(xì)節(jié)，便于觀測物體內(nèi)部的細(xì)微結(jié)構(gòu)。

大多數(shù)微生物都是透明的，傳統(tǒng)顯微成像技術(shù)主要依賴其自身的透鏡，而透鏡對于透明的微小物體成像能力有限，所以成的像對比度差、不清晰，不利于觀測。采用熒光標(biāo)記的方法，雖然可以提高成像分辨率，但是操作繁瑣，耗時(shí)長，而且由這種方法導(dǎo)致光漂白和光毒性反應(yīng)，對微生物或者活細(xì)胞造成無法恢復(fù)的損傷。相差對比顯微技術(shù)利用干涉的原理，將相位差轉(zhuǎn)變?yōu)閺?qiáng)度差，這種方法避免了熒光標(biāo)記，在一定程度上保證了微生物樣品的完整性。由于只能拍攝強(qiáng)度圖像而得不到相位圖像，有一定的局限性。同時(shí)暈輪和漸暗效應(yīng)的存在，穩(wěn)定性差，使得所成圖像效果大大降低。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決上述問題，本發(fā)明提出一種光學(xué)顯微成像系統(tǒng)及其成像方法，能夠提高圖像分辨率，穩(wěn)定性好。

本發(fā)明提出的具體技術(shù)方案為：提供一種光學(xué)顯微成像系統(tǒng)，所述光學(xué)顯微成像系統(tǒng)包括光源、依次遠(yuǎn)離所述光源并設(shè)置于所述光源的出射光路上的第一擴(kuò)束準(zhǔn)直器、顯微鏡、分光器、第二擴(kuò)束準(zhǔn)直器及圖像獲取裝置，所述光源出射的光束依次經(jīng)過所述第一擴(kuò)束準(zhǔn)直器、顯微鏡后形成具有樣品信息的樣品光，所述樣品光經(jīng)過所述分光器分光后形成兩個(gè)光束，所述兩個(gè)光束經(jīng)過所述第二擴(kuò)束準(zhǔn)直器后成像在所述圖像獲取裝置上。

進(jìn)一步地，所述第一擴(kuò)束準(zhǔn)直器包括第一透鏡、第二透鏡及設(shè)置于所述第一透鏡與所述第二透鏡之間的第一濾波器，所述第二透鏡位于所述第一濾波器與所述顯微鏡之間，所述第一濾波器位于所述第一透鏡的后焦平面處，所述第一透鏡的后焦平面與所述第二透鏡的前焦平面重合。

進(jìn)一步地，所述第二擴(kuò)束準(zhǔn)直器包括第三透鏡、第四透鏡及設(shè)置于所述第三透鏡與所述第四透鏡之間的第二濾波器，所述第四透鏡位于所述圖像獲取裝置與所述第二濾波器之間，所述圖像獲取裝置位于所述第四透鏡的后焦平面處，所述第二濾波器位于所述第三透鏡的后焦平面處，所述第三透鏡的后焦平面與所述第四透鏡的前焦平面重合。

進(jìn)一步地，所述光學(xué)顯微成像系統(tǒng)還包括設(shè)置于所述光源的出射光路上的光闌，所述光闌位于所述顯微鏡與所述分光器之間。

進(jìn)一步地，所述光學(xué)顯微成像系統(tǒng)還包括設(shè)置于所述光源的出射光路上的第三擴(kuò)束準(zhǔn)直器，所述第三擴(kuò)束準(zhǔn)直器位于所述分光器與所述第二擴(kuò)束準(zhǔn)直器之間。

進(jìn)一步地，所述第三擴(kuò)束準(zhǔn)直器包括第五透鏡和第六透鏡，所述第五透鏡位于所述分光器與所述第六透鏡之間，所述分光器位于所述第五透鏡的前焦平面處，所述第五透鏡的后焦平面與所述第六透鏡的前焦平面重合。

進(jìn)一步地，所述光學(xué)顯微成像系統(tǒng)還包括設(shè)置于所述光源的出射光路上的光路調(diào)整器，所述光路調(diào)整器位于所述第三擴(kuò)束準(zhǔn)直器與所述第二擴(kuò)束準(zhǔn)直器之間。

進(jìn)一步地，所述光路調(diào)整器包括第一反射鏡和第二反射鏡，所述第一反射鏡位于所述第三擴(kuò)束準(zhǔn)直器與所述第二反射鏡之間。

進(jìn)一步地，所述光源為激光器，和/或所述分光器為光柵，和/或所述圖像獲取裝置為ccd。

本發(fā)明還提供了一種如上所述的光學(xué)顯微成像系統(tǒng)的成像方法，所述成像方法包括：

開啟激光器，所述圖像獲取裝置獲取第一干涉圖；

將所述分光器移動(dòng)預(yù)定距離，所述圖像獲取裝置獲取第二干涉圖；

將所述第二干涉圖像與所述第一干涉圖像作差，獲得第三干涉圖像；

提取所述第三干涉圖像的相位信息，獲得相位圖。

本發(fā)明提供的光學(xué)顯微成像系統(tǒng)，光源出射的光束被所述分光器分光后形成兩個(gè)光束，所述兩個(gè)光束經(jīng)過所述第二擴(kuò)束準(zhǔn)直器后發(fā)生干涉并成像在所述圖像獲取裝置上，兩個(gè)光束經(jīng)過了相同的光程，避免了噪聲的影響，通過第一擴(kuò)束準(zhǔn)直器、顯微鏡和第二擴(kuò)束準(zhǔn)直器對圖像進(jìn)行放大，提高了圖像分辨率。本發(fā)明提供的成像方法通過第二干涉圖像與第一干涉圖像作差得到第三干涉圖像，這樣使得第三干涉圖像中不包括直流分量，大大提高了信號(hào)功率譜的帶寬占有量，避免了信號(hào)在空間傳播上的損失。

附圖說明

通過結(jié)合附圖進(jìn)行的以下描述，本發(fā)明的實(shí)施例的上述和其它方面、特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)將變得更加清楚，附圖中：

圖1為光學(xué)顯微成像系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2為光學(xué)顯微成像系統(tǒng)的成像方法的流程圖；

圖3a為第一干涉圖像的示意圖；

圖3b為第二干涉圖像的示意圖；

圖4a為第一干涉圖像的功率譜圖；

圖4b為第三干涉圖像的功率譜圖。

具體實(shí)施方式

以下，將參照附圖來詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例。然而，可以以許多不同的形式來實(shí)施本發(fā)明，并且本發(fā)明不應(yīng)該被解釋為局限于這里闡述的具體實(shí)施例。相反，提供這些實(shí)施例是為了解釋本發(fā)明的原理及其實(shí)際應(yīng)用，從而使本領(lǐng)域的其他技術(shù)人員能夠理解本發(fā)明的各種實(shí)施例和適合于特定預(yù)期應(yīng)用的各種修改。

參照圖1，本實(shí)施例提供的光學(xué)顯微成像系統(tǒng)包括光源1、依次遠(yuǎn)離光源1并設(shè)置于光源1的出射光路上的第一擴(kuò)束準(zhǔn)直器2、顯微鏡3、分光器4、第二擴(kuò)束準(zhǔn)直器5及圖像獲取裝置6。光源1出射的光束依次經(jīng)過第一擴(kuò)束準(zhǔn)直器2、顯微鏡3后形成具有樣品信息的樣品光，樣品光經(jīng)過分光器4分光后形成兩個(gè)光束，分別為信號(hào)光和參考光，信號(hào)光和參考光經(jīng)過第二擴(kuò)束準(zhǔn)直器5后產(chǎn)生干涉并成像在圖像獲取裝置6上。

顯微鏡3包括依次遠(yuǎn)離光源1并設(shè)置于光源1的出射光路上的第三反射鏡31、聚光鏡32、物鏡33、第四反射鏡34及筒鏡35。其中，樣品放置于顯微鏡3的聚光鏡32與物鏡33之間。光源1發(fā)射的光束經(jīng)過第一擴(kuò)束準(zhǔn)直器2后從第三反射鏡31反射至聚光鏡32，聚光鏡32將光線匯聚到樣品上，經(jīng)過樣品后形成攜帶有樣品信號(hào)的樣品光，樣品光入射至物鏡33，樣品光被物鏡33放大后經(jīng)第四反射鏡34反射至筒鏡35，從筒鏡35出射的樣品光再被分光器4分成兩個(gè)光束即信號(hào)光和參考光。

本實(shí)施例中的分光器4為光柵，光源1為激光器，圖像獲取裝置6為電荷藕合器件圖像傳感器(charge-coupleddevice，ccd)。光柵能夠?qū)悠饭夥殖蓛蓚€(gè)衍射光束即信號(hào)光和參考光。本實(shí)施例通過將激光器作為光源1可以避免光暈，提高了分光器4分成的兩個(gè)光束的相干性，降低了空間噪聲的影響。

具體的，第一擴(kuò)束準(zhǔn)直器2包括第一透鏡21、第二透鏡22及設(shè)置于第一透鏡21與第二透鏡22之間的第一濾波器23。第二透鏡22位于第一濾波器23與顯微鏡3之間即第二透鏡22位于第一濾波器23與第三反射鏡31之間，第一濾波器23位于第一透鏡21的后焦平面處，第一透鏡21的后焦平面與第二透鏡22的前焦平面重合。本實(shí)施例中的第一濾波器23為針孔濾波器，第一濾波器23上設(shè)置有一個(gè)孔，該孔的孔徑d通過下式計(jì)算：

其中，λ表示的是光源1出射光束的波長，r表示的是光源1出射光束的半徑，f表示的是第一透鏡21的焦距。

光源1發(fā)射的光束經(jīng)過第一透鏡21匯聚后入射至第一濾波器23，第一濾波器23對入射到其上的光束進(jìn)行濾波即濾除雜散光，經(jīng)過第一濾波器23濾波后的光束再經(jīng)第二透鏡22進(jìn)行光束擴(kuò)展，擴(kuò)展后的光束從第三反射鏡31入射至顯微鏡3中?？梢愿鶕?jù)實(shí)際需要改變第一透鏡21和第二透鏡22的焦距，從而獲得所需要的擴(kuò)展光束。

第二擴(kuò)束準(zhǔn)直器5包括第三透鏡51、第四透鏡52及設(shè)置于第三透鏡51與第四透鏡52之間的第二濾波器53。第四透鏡52位于圖像獲取裝置6與第二濾波器53之間，圖像獲取裝置6位于第四透鏡52的后焦平面處，第二濾波器53位于第三透鏡51的后焦平面處，第三透鏡51的后焦平面與第四透鏡52的前焦平面重合。本實(shí)施例中的第二濾波器53為針孔濾波器，第二濾波器53上設(shè)置有兩個(gè)孔，一個(gè)大孔和一個(gè)小孔，大孔是為了保證信號(hào)光完整無損的通過并且只通過信號(hào)光，小孔起到對參考光進(jìn)行濾波的作用，兩孔的距離即入射到第三透鏡51上的0級衍射光和1級衍射光之間的距離δx通過下式計(jì)算：

其中，f1表示的是第三透鏡51的焦距，λ表示是光源1出射光束的波長，λ表示分光器4的光柵周期。

通過第二濾波器53上小孔的參考光的亮斑的半徑ρ通過下式計(jì)算：

其中，f2表示的是第四透鏡52的焦距，d表示的是小孔的孔徑。

為了使得從第四透鏡52出射的光束能夠覆蓋圖像獲取裝置6的入射面，參考光的亮斑的半徑ρ需要滿足以下條件：

即小孔的孔徑d需要滿足以下條件：

其中，d表示的是圖像獲取裝置6的入射面的對角線長度。

分光器4將樣品光分成信號(hào)光和參考光，信號(hào)光和參考光分別入射至第三透鏡51并經(jīng)過第三透鏡51匯聚后入射至第二濾波器53，第二濾波器53分別對入射到其上的兩個(gè)光束進(jìn)行濾波，其中，信號(hào)光經(jīng)過大孔后完整出射，參考光經(jīng)過小孔過濾后形成均勻的球面波，經(jīng)第二濾波器53濾波后的兩個(gè)光束再經(jīng)第四透鏡52進(jìn)行光束擴(kuò)展，擴(kuò)展后的兩個(gè)光束發(fā)生干涉并成像在圖像獲取裝置6上。

本實(shí)施例中的光學(xué)顯微成像系統(tǒng)還包括設(shè)置于光源1的出射光路上的光闌7，光闌7位于顯微鏡3與分光器4之間。光闌7可以控制從顯微鏡3中出射的光束的光斑大小。

光學(xué)顯微成像系統(tǒng)還包括設(shè)置于光源1的出射光路上的第三擴(kuò)束準(zhǔn)直器8，第三擴(kuò)束準(zhǔn)直器8位于分光器4與第二擴(kuò)束準(zhǔn)直器5之間。第三擴(kuò)束準(zhǔn)直器8包括第五透鏡81和第六透鏡82。第五透鏡81位于分光器4與第六透鏡82之間，分光器4位于第五透鏡81的前焦平面處，第五透鏡81的后焦平面與第六透鏡82的前焦平面重合。通過第三擴(kuò)束準(zhǔn)直器8可以對光束進(jìn)行準(zhǔn)直，減少像差的影響，以提升圖像分辨率。

為了對整個(gè)光學(xué)顯微成像系統(tǒng)的光路進(jìn)行調(diào)整，光學(xué)顯微成像系統(tǒng)還包括設(shè)置于光源1的出射光路上的光路調(diào)整器9，光路調(diào)整器9位于第三擴(kuò)束準(zhǔn)直器8與第二擴(kuò)束準(zhǔn)直器5之間。光路調(diào)整器9包括第一反射鏡91和第二反射鏡92，第一反射鏡91位于第六透鏡82與第二反射鏡92之間。第一反射鏡91將經(jīng)過第六透鏡82的光束反射至第二反射鏡92，第二反射鏡92再將入射到其上的光束反射至第三透鏡51上。

本實(shí)施例還提供了一種如上所述的光學(xué)顯微成像系統(tǒng)的成像方法，所述成像方法包括：

步驟s1、開啟激光器，圖像獲取裝置6獲取第一干涉圖，如圖3a所示。其中，第一干涉圖像是由兩個(gè)光束即信號(hào)光和參考光干涉后形成，其中，兩個(gè)衍射光束會(huì)產(chǎn)生一個(gè)互相關(guān)函數(shù)分量，即功率譜圖中的直流分量，圖4a表示的是第一干涉圖像的功率譜圖，功率譜圖中的中間部分為直流分量，從中可以看出直流分量占了很大的帶寬。

步驟s2、將分光器4移動(dòng)預(yù)定距離，圖像獲取裝置6獲取第二干涉圖，如圖3b所示。

其中，本實(shí)施例中的分光器為光柵，經(jīng)過分光器分光后的兩個(gè)光束即信號(hào)光和參考光的頻率為λ是光柵周期，即一個(gè)光柵周期對應(yīng)2π。通過相移角度α便可以得到分光器4需要移動(dòng)的預(yù)定距離x，其中，例如，第一干涉圖像為相位為0°時(shí)的干涉圖像，第二干涉圖像為相位為π時(shí)的干涉圖像，則分光器4需要移動(dòng)的預(yù)定距離

步驟s3、將第二干涉圖像與第一干涉圖像作差，獲得第三干涉圖像。圖4b表示的是第三干涉圖像的功率譜圖，從中可以看出，通過將第二干涉圖像與第一干涉圖像作差可以去除直流分量，濾波器的濾波半徑變大，使得第三干涉圖中的一級頻譜分量增加，在整個(gè)頻帶寬度不變的情況下，大大提高了一級頻譜的帶寬占有量，一級頻譜分量攜帶的信息會(huì)更多，避免了信號(hào)在空間傳播上的損失。

步驟s4、提取第三干涉圖像的相位信息，獲得相位圖。

以上所述僅是本申請的具體實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本申請?jiān)淼那疤嵯拢€可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本申請的保護(hù)范圍。