本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及用于引導(dǎo)外源蛋白質(zhì)(如抗體)在哺乳動物細(xì)胞中分泌表達(dá)的信號肽。技術(shù)背景2007年我國基因重組蛋白類藥物取得較快發(fā)展，在基因組技術(shù)的上游階段，利用大腸桿菌和畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，結(jié)合新的融合蛋白載體的構(gòu)建，有效的提高了現(xiàn)有重組蛋白藥物的半衰期和可溶性等特性，為工業(yè)化制備提供了新的工藝，從而提高了重組蛋白的回收率；但在下游的分離純化技術(shù)和哺乳細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)和純化能力方面仍存在較大不足。特別是現(xiàn)代生物醫(yī)藥的重要組成部分——抗體藥物，由于抗體針對相應(yīng)抗原具有高特異性和高親和力的特性，使得其在疾病的診斷和治療中顯示出其他類型藥物無可比擬的優(yōu)勢。抗體藥物經(jīng)歷了鼠源抗體、嵌合抗體、人源化抗體和全人源抗體的發(fā)展歷程，逐漸向低抗原性、高特異性方向發(fā)展?？贵w制備方法經(jīng)歷了常規(guī)血清技術(shù)、雜交瘤技術(shù)、基因工程抗體技術(shù)及抗體庫技術(shù)的不斷發(fā)展，目前使用體外篩選技術(shù)與轉(zhuǎn)基因動物篩選獲得全人源抗體成為抗體研究的主要方向。利用哺乳動物細(xì)胞表達(dá)蛋白質(zhì)(如抗體)成為蛋白類藥物生產(chǎn)的主流，但哺乳動物細(xì)胞外源蛋白表達(dá)效率低，且成本高，因此提高哺乳動物細(xì)胞外源蛋白表達(dá)效率，降低生產(chǎn)成本是當(dāng)前工作中的重中之重。工業(yè)上，蛋白質(zhì)(如抗體)的表達(dá)水平受很多因素影響，如表達(dá)載體、宿主、培養(yǎng)基、培養(yǎng)工藝等。而表達(dá)載體的表達(dá)能力又受啟動子、信號肽等因素影響，其中信號肽在蛋白質(zhì)(如抗體)的分泌表達(dá)過程中扮演著至關(guān)重要的作用，直接影響分泌蛋白質(zhì)的質(zhì)量。信號肽位于分泌蛋白的N端。一般由15～30個氨基酸組成。包括三個區(qū)：一個帶正電的N末端，稱為堿性氨基末端；一個中間疏水序列，以中性氨基酸為主，能夠形成一段α螺旋結(jié)構(gòu)，它是信號肽的主要功能區(qū)；一個較長的帶負(fù)電荷的C末端，含小分子氨基酸，是信號序列切割位點，也稱加工區(qū)。當(dāng)信號肽序列合成后，被信號識別顆粒(SRP)所識別，蛋白質(zhì)合成暫?；驕p緩，信號識別顆粒將核糖體攜帶至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，蛋白質(zhì)合成重新開始。在信號肽的引導(dǎo)下，新 合成的蛋白質(zhì)進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，而信號肽序列則在信號肽酶的作用下被切除。信號肽分泌外源蛋白的作用如下：1)信號肽能夠引導(dǎo)分泌蛋白或膜蛋白出胞。2)信號肽的疏水核心決定蛋白質(zhì)的分泌效率。3)信號肽能夠引導(dǎo)蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)不同區(qū)域或不同細(xì)胞器進(jìn)行正確的定位。4)信號肽能夠分泌增強子增強外源蛋白的分泌。5)短的信號肽有利于減少表達(dá)載體的分子量，提高整合到宿主染色體上外源基因表達(dá)盒的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄效率。信號肽沒有嚴(yán)格的專一性，因而可利用宿主細(xì)胞本身的信號肽序列，也可以在表達(dá)載體的啟動子后面加入一個編碼信號肽的序列，分泌外源蛋白。應(yīng)用信號肽序列來引導(dǎo)外源蛋白質(zhì)的分泌不僅方便純化操作，而且對于制備一些有特殊功用的基因工程產(chǎn)物(如抗體)來說，信號肽的應(yīng)用更顯示了其重要性。同一種蛋白在不同信號肽的作用下，即使都能分泌表達(dá)，其分泌效率也會相差甚遠(yuǎn)。適當(dāng)改造信號肽結(jié)構(gòu)可提高外源蛋白的分泌效率。對于外源蛋白(如抗體)，選擇合適的信號肽可以將其表達(dá)量成倍提高，無論對于工業(yè)生產(chǎn)還是科學(xué)研究，其意義都是非常深遠(yuǎn)的。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的發(fā)明人在對信號肽的長期研究中，提供了一種可以引導(dǎo)外源蛋白質(zhì)(如抗體)高效表達(dá)的信號肽，以降低外源蛋白的生產(chǎn)成本。因此，本發(fā)明的第一個目的在于提供一種用于蛋白質(zhì)表達(dá)的信號肽。本發(fā)明的第二個目的在于提供所述信號肽的應(yīng)用。本發(fā)明的第三個目的在于提供編碼所述信號肽的多核苷酸。本發(fā)明的第四個目的在于提供包含編碼所述信號肽的多核苷酸的哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體。本發(fā)明的第五個目的在于提供轉(zhuǎn)染所述哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體的哺乳動物宿主細(xì)胞。本發(fā)明的第六個目的在于提供一種外源蛋白的生產(chǎn)方法。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案：本發(fā)明的第一個方面提供了一種用于蛋白質(zhì)表達(dá)的信號肽，所述信號肽的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。本發(fā)明的第二個方面提供了所述信號肽用于在哺乳動物宿主細(xì)胞中引導(dǎo)外源蛋白(如抗體)的分泌表達(dá)的應(yīng)用。本發(fā)明的第三個方面提供了一種多核苷酸，所述多核苷酸編碼如上所述的信號肽。進(jìn)一步的，所述多核甘酸的核苷酸序列如SEQIDNO:7所示。本發(fā)明的第四個方面提供了一種哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體，所述哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體含有編碼如上所述的信號肽的多核苷酸及編碼外源蛋白的多核苷酸。進(jìn)一步的，編碼如上所述的信號肽的多核苷酸緊接在所述編碼外源蛋白的多核苷酸前端。進(jìn)一步的，所述哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體的啟動子可以是EF-1α(humanelongationfactor-1α，人延伸因子-1α)啟動子、hCMV(humancytomegalovirus，人巨細(xì)胞病毒)啟動子、SV40(Simianvacuolatingvirus40，猴空泡病毒)晚期啟動子、SV40早期啟動子或者EF-1α與hCMV啟動子的雜合啟動子等。進(jìn)一步的，所述外源蛋白可以為任意蛋白質(zhì)，如抗體等。優(yōu)選的，所述表達(dá)載體為pCHO1.0。本發(fā)明的第五個方面提供了一種哺乳動物宿主細(xì)胞，所述哺乳動物宿主細(xì)胞被如上所述的哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體所轉(zhuǎn)染。進(jìn)一步的，所述哺乳動物細(xì)胞可以是CHO(Chinesehamsterovary，中國倉鼠卵巢細(xì)胞)、BHK(babyhamsterkidney，幼年倉鼠腎細(xì)胞)、SP2/0(小鼠骨髓瘤細(xì)胞)、C127(小鼠乳腺腫瘤細(xì)胞)、HEK293(humanembryonickidney293，人胚腎293細(xì)胞)等。優(yōu)選的，所述細(xì)胞為CHO細(xì)胞。本發(fā)明的第六個方面提供了一種外源蛋白的生產(chǎn)方法，包括以下步驟：在適合表達(dá)外源蛋白的條件下，培養(yǎng)如上所述的哺乳動物宿主細(xì)胞，然后從培養(yǎng)物中分離出所述的外源蛋白。有益效果：本發(fā)明提供了一種人工合成的新型信號肽，將其與天然抗體信號肽進(jìn)行比較，外源蛋白表達(dá)量的測定結(jié)果表明，本發(fā)明的信號肽特別適用于CHO細(xì)胞的外源蛋白表達(dá)，與現(xiàn)有信號肽相比，在哺乳動物細(xì)胞中的外源蛋白(如抗 體)表達(dá)量獲得大幅提升，表達(dá)水平提高了2.3倍以上，顯著提高了外源蛋白的分泌表達(dá)量，其應(yīng)用有利于篩選到高表達(dá)單克隆細(xì)胞株，并可以降低生產(chǎn)成本，具有廣泛的工業(yè)應(yīng)用前景。附圖說明圖1為FreedompCHO1.0表達(dá)載體圖。圖2為本發(fā)明信號肽與天然抗體信號肽引導(dǎo)的外源蛋白表達(dá)量對比圖。圖3為利用本發(fā)明信號肽制備的貝伐單抗的SEC-HPLC純度檢測結(jié)果圖。圖4為利用本發(fā)明信號肽制備的貝伐單抗的重鏈的完整分子量圖譜。圖5為利用本發(fā)明信號肽制備的貝伐單抗的輕鏈的完整分子量圖譜。具體實施方式下述實施例詳細(xì)說明本發(fā)明，但并不對其發(fā)明范圍進(jìn)行限制。利用本發(fā)明的信號肽在哺乳動物細(xì)胞中分泌表達(dá)蛋白質(zhì)(如抗體)的方法為：將編碼本發(fā)明信號肽的多核苷酸與編碼表達(dá)蛋白質(zhì)(如抗體)的多核苷酸連接后克隆入哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體，然后將該重組哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞后表達(dá)目的蛋白。本發(fā)明的多核苷酸可通過常規(guī)的合成方法制備。本發(fā)明實施例所列舉的表達(dá)載體為FreedompCHO1.0(購自Invitrogen)。實施例1信號肽的合成本發(fā)明設(shè)計了人工合成的新型信號肽1，同時引用了天然抗體信號肽2-6進(jìn)行對比。信號肽1-6的氨基酸序列如下。信號肽1：MKWVKVLFALICIAVAHS(本發(fā)明設(shè)計，SEQIDNO:1)信號肽2：METPAQLLFLLLLWLP(GenBank：AAA36085.1，Homosapiens，SEQIDNO:2)信號肽3：MGWSCIILFLVATATGVHS(GenBank:CAA25967.1,Musmusculus，SEQIDNO:3)信號肽4：MGWSCIILFLVATATG(GenBank:AAA38605.1,Musmusculus， SEQIDNO:4)信號肽5：MSVPTQVLGLLLLWLTDARC(GenBank:CAB46315.1,Musmusculus，SEQIDNO:5)信號肽6：MDMRVPAQLLGLLLLWLPG(GenBank:AAA58934.1,Homosapiens，SEQIDNO:6)信號肽1-6的核苷酸序列如下。信號肽1：5’-ATGAAGTGGGTGAAGGTGCTGTTCGCCCTGATCTGCATCGCCGTGGCCCATAGC-3’(SEQIDNO:7)信號肽2：5’-ATGGAAACCCCTGCTCAGCTCCTCTTCCTGCTCCTCCTCTGGCTCCCA-3’(SEQIDNO:8)信號肽3：5’-ATGGGATGGTCCTGTATTATTCTGTTTCTCGTGGCTACTGCAACTGGCGTCCACAGC-3’(SEQIDNO:9)信號肽4：5’-ATGGGATGGTCCTGTATTATTCTGTTTCTCGTGGCTACTGCAACTGGA-3’(SEQIDNO:10)信號肽5：5’-ATGAGCGTCCCAACACAAGTGCTGGGTCTGCTGCTGCTGTGGCTGACTGACGCAAGGTGC-3’(SEQIDNO:11)信號肽6：5’-ATGGATATGAGGGTGCCCGCTCAACTGCTGGGACTGCTGCTGCTGTGGCTGCCAGGC-3’(SEQIDNO:12)因信號肽較短，將以上信號肽的核苷酸序列按引物合成方式合成。每條信號肽5’端都分別添加AvrII、EcoRV酶切位點，即同一條信號肽合成兩條序列(一條含有AvrII，另一條含有EcoRV)；每條信號肽3’端添加部分與目的基因序列相同的片段，便于拼接。實施例2重組pCHO1.0表達(dá)載體的構(gòu)建將經(jīng)過密碼子優(yōu)化的貝伐單抗基因重鏈(WO2004/065417，SEQIDNO:25， 3’端添加BstZ171酶切位點)分別與信號肽1-6(5’端含有AvrII)進(jìn)行拼接，并分別經(jīng)AvrII/BstZ171雙酶切處理后，連接至AvrII/BstZ171雙酶切后的質(zhì)粒pCHO1.0(購自Invitrogen)，所獲得的重組質(zhì)粒分別命名為pCHO-LC8、pCHO-LC2、pCHO-LC3、pCHO-LC4、pCHO-LC5、pCHO-LC6。將經(jīng)過密碼子優(yōu)化的貝伐單抗基因輕鏈(WO2004/065417，SEQIDNO:25，3’端添加PacI酶切位點)分別與信號肽1-6(5’端含有EcoRV)進(jìn)行拼接，并分別經(jīng)EcoRV/PacI雙酶切處理后，連接至分別經(jīng)EcoRV/PacI雙酶切后的質(zhì)粒pCHO-LC8、pCHO-LC2、pCHO-LC3、pCHO-LC4、pCHO-LC5、pCHO-LC6，所獲得的重組質(zhì)粒分別命名為pCHO-A8、pCHO-A2、pCHO-A3、pCHO-A4、pCHO-A5、pCHO-A6。其中，重組質(zhì)粒pCHO-A8采用本發(fā)明的信號肽1分泌表達(dá)貝伐單抗的輕、重鏈，重組質(zhì)粒pCHO-A2、pCHO-A3、pCHO-A4、pCHO-A5、pCHO-A6分別采用天然信號肽2-6分泌表達(dá)貝伐單抗的輕、重鏈。實施例3重組表達(dá)載體瞬時轉(zhuǎn)染表達(dá)研究采用脂質(zhì)體法(freestyleMAX，購自Invitrogen)將質(zhì)粒pCHO-A2、pCHO-A3、pCHO-A4、pCHO-A5、pCHO-A6、pCHO-A8分別轉(zhuǎn)染至CHO-S細(xì)胞(購自Lifetechnologies)中，檢測抗體瞬時表達(dá)水平。具體地說，按照freestyleMAX操作說明書，將5μgpCHO-A2、pCHO-A3、pCHO-A4、pCHO-A5、pCHO-A6、pCHO-A8質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染培養(yǎng)于6孔板(3ml/孔)的CHO-S細(xì)胞(約3×106個細(xì)胞)中。轉(zhuǎn)染細(xì)胞在8％CO2，37℃的細(xì)胞震蕩培養(yǎng)箱(品牌Infors)中搖動培養(yǎng)48小時后，收集培養(yǎng)液上清，使用ELISA法檢測人貝伐單抗表達(dá)量。結(jié)果如圖2和表1所示。表1、質(zhì)粒編號信號肽抗體表達(dá)量(μg/ml)pCHO-A2SEQIDNO:21pCHO-A3SEQIDNO:31.1pCHO-A4SEQIDNO:41.41pCHO-A5SEQIDNO:51.28pCHO-A6SEQIDNO:61.2pCHO-A8SEQIDNO:13.3結(jié)果顯示，本發(fā)明信號肽相對于天然抗體信號肽，在相同條件下，抗體分泌表達(dá)量提高了2.3倍以上，說明本發(fā)明的信號肽能夠顯著提高CHO細(xì)胞中外源蛋白的分泌表達(dá)量。實施例4小量抗體的制備按照FreedomCHO-SKit(購自Lifetechnologies)操作說明書，將50μgpCHO-A8質(zhì)粒轉(zhuǎn)染于搖瓶培養(yǎng)的30mlCHO-S細(xì)胞(1×106cells/ml)中。轉(zhuǎn)染細(xì)胞在8％CO2，37℃的細(xì)胞震蕩培養(yǎng)箱中搖動培養(yǎng)48小時后，加入甲氨蝶呤(MTX)和嘌呤霉素進(jìn)行加壓篩選。待細(xì)胞活力上升至90％，進(jìn)行簡單流加(SimpleFed-batch)(3×105細(xì)胞密度接種，第3天和第5天補入4g/L糖，第7天補入6g/L糖；37℃/130rpm/8％CO2)以生產(chǎn)小量抗體。培養(yǎng)14天后，收集簡單流加培養(yǎng)上清，用ProteinA純化柱(MabSelectSuRe，購自GEHealthcare)進(jìn)行親和純化(結(jié)合緩沖液：NaCl0.5M，Na2HPO420mM，PH8.0；洗脫液：50mM檸檬酸緩沖液PH3.5)，最終獲得高純度的貝伐單抗。實施例5表達(dá)抗體質(zhì)量的鑒定將實施例4制備的貝伐單抗進(jìn)行SEC-HPLC(DIONEX，UItimate3000-VWD1)純度分析，結(jié)果如圖3所示，純度大于97％。利用Q-TOF(Waters，XEVOG2Q-TOF)對制備的貝伐單抗進(jìn)行完整分子量分析，結(jié)果如圖4和5所示，輕鏈和重鏈的分子量測定結(jié)果與原研藥一致。根據(jù)以上檢測結(jié)果表明本發(fā)明信號肽所引導(dǎo)分泌的抗體為目標(biāo)抗體，可以用于引導(dǎo)外源蛋白(如抗體)的正確表達(dá)。按照上述方法，本發(fā)明的發(fā)明人還對依那西普、曲妥珠單抗、利妥昔單抗(Rituximab、MabThera)等等蛋白質(zhì)進(jìn)行類似實驗，結(jié)果表明，本發(fā)明信號肽引導(dǎo)的蛋白質(zhì)在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)量均獲得大幅提升。當(dāng)前第1頁1 2 3