本申請(qǐng)涉及全基因組選擇育種技術(shù)。具體而言，本申請(qǐng)涉及利用全基因組選擇育種技術(shù)選育含有重組核酸片段的水稻植株，以及由此而獲得的重組核酸片段及其檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

長(zhǎng)期以來(lái)，傳統(tǒng)育種的選擇方法主要依賴(lài)于田間表現(xiàn)型的評(píng)價(jià)，根據(jù)育種家個(gè)人經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行取舍，其最大的缺點(diǎn)在于耗時(shí)長(zhǎng)，效率較低。要提高選擇的效率，最理想的方法應(yīng)是能夠直接對(duì)基因型進(jìn)行選擇。隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，分子標(biāo)記為實(shí)現(xiàn)對(duì)基因型的直接選擇提供了可能。近年來(lái)，已開(kāi)始應(yīng)用分子標(biāo)記輔助選擇方法來(lái)改良個(gè)別目標(biāo)性狀，能夠顯著的縮短育種年限。

稻瘟病是水稻最嚴(yán)重的病害之一，全球每年由稻瘟病引起的水稻產(chǎn)量損失占11％～30％，因此稻瘟病及其抗性的研究顯得尤為重要。隨著對(duì)稻瘟病研究的逐步深入，許多水稻抗稻瘟病基因DNA片段相繼被定位和克隆。其中，Pi1及Pik簇等位基因定位于水稻第11染色體長(zhǎng)臂近末端區(qū)域(Hua等，Theoretical and Applied Genetics.2012,125:1047-1055；Li等，Molecular Breeding.2007,20:179-188；Alok等，F(xiàn)unctional&Integrative Genomics.2012,12:215-228；Yuan等，Theoretical and Applied Genetics.2011,122:1017-1028)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

一方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝酥亟M核酸片段，其選自：i)包含SEQ ID NO:1所示序列331-462位核苷酸的序列或其片段或其變體或其互補(bǔ)序列；ii)包含SEQ ID NO:1所示序列的序列或其片段或其變體或其互補(bǔ)序列；iii)包含SEQ ID NO:2所示序列487-513位核苷酸的序列或其片 段或其變體或其互補(bǔ)序列；iv)包含SEQ ID NO:2所示序列的序列或其片段或其變體或其互補(bǔ)序列；以及以上片段的組合。在一實(shí)施方案中，所述重組核酸片段為基因組重組核酸片段。

此外，本申請(qǐng)?zhí)峁┝藱z測(cè)所述重組核酸片段的引物，其選自：(I)特異性識(shí)別SEQ ID NO:1所示序列1-331位核苷酸的序列的正向引物和特異性識(shí)別SEQ ID NO:1所示序列462-1042位核苷酸的序列的反向引物；(II)以下第一組引物對(duì)與第二組引物對(duì)的組合，其包含(a)第一組引物對(duì)：特異性識(shí)別SEQ ID NO:1所示序列第1-331位核苷酸的序列的正向引物和特異性識(shí)別SEQ ID NO:1所示序列第332-461位核苷酸的序列的反向引物；和(b)第二組引物對(duì)：特異性識(shí)別SEQ ID NO:1所示序列第332-461位核苷酸的序列的正向引物和特異性識(shí)別SEQ ID NO:1所示序列第462-1042位核苷酸的序列的反向引物；(III)特異性識(shí)別包含SEQ ID NO:1所示序列第331-332位核苷酸的序列的正向引物和特異性識(shí)別包含SEQ ID NO:1所示序列第461-462位核苷酸的序列的反向引物；(IV)特異性識(shí)別包含SEQ ID NO:1所示序列第331-332位核苷酸的序列的正向引物和特異性識(shí)別SEQ ID NO:1所示序列第462-1042位核苷酸的序列的反向引物；(V)特異性識(shí)別SEQ ID NO:1所示序列第1-331位核苷酸的序列的正向引物和特異性識(shí)別包含SEQ ID NO:1所示序列第461-462位核苷酸的序列的反向引物；和/或任選地，(VI)特異性識(shí)別SEQ ID NO:2所示序列1-487位核苷酸的序列的正向引物和特異性識(shí)別SEQ ID NO:2所示序列513-1174位核苷酸的序列的反向引物；(VII)以下第三組引物對(duì)與第四組引物對(duì)的組合，其包含(c)第三組引物對(duì)：特異性識(shí)別SEQ ID NO:2所示序列第1-487位核苷酸的序列的正向引物和特異性識(shí)別SEQ ID NO:2所示序列第488-512位核苷酸的序列的反向引物；和(d)第四組引物對(duì)：特異性識(shí)別SEQ ID NO:2所示序列第488-512位核苷酸的序列的正向引物和特異性識(shí)別SEQ ID NO:2所示序列第513-1174位核苷酸的序列的反向引物；(VIII)特異性識(shí)別包含SEQ ID NO:2所示序列第487-488位核苷酸的序列的正向引物和特異性識(shí)別包含SEQ ID NO:2所示序列第512-513位核苷酸的序列的反向引物；(IX)特異性識(shí)別包 含SEQ ID NO:2所示序列第487-488位核苷酸的序列的正向引物和特異性識(shí)別SEQ ID NO:2所示序列第513-1174位核苷酸的序列的反向引物；(X)特異性識(shí)別SEQ ID NO:2所示序列第1-487位核苷酸的序列的正向引物和特異性識(shí)別包含SEQ ID NO:2所示序列第512-513位核苷酸的序列的反向引物。

在一實(shí)施方案中，用于擴(kuò)增SEQ ID NO:1所示序列的引物對(duì)為，例如，5’-TGCCGAACGGTGAATAATGTAA-3’，和5’-GCCTTGATCTAGGAGGGAATGT-3’。用于檢測(cè)SEQ ID NO:1所示序列的測(cè)序引物為，例如，5’-TGCCGAACGGTGAATAATGTAA-3’，和5’-GCCTTGATCTAGGAGGGAATGT-3’。

在另一實(shí)施方案中，用于擴(kuò)增SEQ ID NO:2所示序列的引物對(duì)為，例如，5’-CCTATGTCTAGTCGCTGAAATCC-3’，和5’-GAGAACGAATCCCTGTCTAACTG-3’。用于檢測(cè)SEQ ID NO:2所示序列的測(cè)序引物為，例如，5’-CCTATGTCTAGTCGCTGAAATCC-3’，5’-GTACTCGGGCGATGCTTTAC-3’，和5’-GAGAACGAATCCCTGTCTAACTG-3’。

另一方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝诉x育含有重組核酸片段的水稻植株的方法，其包括以不含目的基因組片段的水稻受體植物親本作為輪回親本，將其與含有目的基因組片段的水稻供體植物進(jìn)行雜交，然后將所得到的雜交種與輪回親本進(jìn)行回交，再將所得到的回交種進(jìn)行自交的步驟，其中利用分子標(biāo)記對(duì)重組水稻植株進(jìn)行前景選擇和背景選擇。例如，所述重組核酸片段如前所述。

在上述方法中，用于所述前景選擇的分子標(biāo)記選自PiC11ID17、PiC11S122和PiC11S166中的一種或多種；和/或利用水稻全基因組育種芯片進(jìn)行所述背景選擇。

在一實(shí)施方案中，本申請(qǐng)?zhí)峁┑倪x育含有抗稻瘟病基因組重組核酸片段的水稻植株的方法，其包括以下步驟：1)將輪回親本與供體植物進(jìn)行雜交，將所得到的雜交種與輪回親本進(jìn)行回交，獲得回交一代，利用正向選擇標(biāo)記PiC11ID17和負(fù)向選擇標(biāo)記PiC11S122、PiC11S166對(duì)其進(jìn)行抗稻瘟病基因組片段的單側(cè)同源重組片段篩選，并利用水稻全基因組育種芯片，例如RICE6K，對(duì)其進(jìn)行背景選擇；2)選擇背景回 復(fù)較好的重組單株(此世代背景回復(fù)值超過(guò)75％)與輪回親本再次進(jìn)行回交，獲得回交二代，利用正向選擇標(biāo)記PiC11ID17對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，選擇含有抗稻瘟病基因組片段的重組單株，然后利用水稻全基因組育種芯片，例如RICE6K，對(duì)其進(jìn)行背景選擇；3)選擇背景回復(fù)好的重組單株(此世代背景回復(fù)值超過(guò)87.5％)與輪回親本又一次進(jìn)行回交，獲得回交三代，利用正向選擇標(biāo)記PiC11ID17和負(fù)向標(biāo)記PiC11S122、PiC11S166對(duì)其進(jìn)行抗稻瘟病基因組片段的另一側(cè)同源重組片段篩選，并利用水稻全基因組育種芯片，例如RICE60K，對(duì)其進(jìn)行背景選擇；以及4)選擇導(dǎo)入片段小，且背景回復(fù)好的重組單株(背景回復(fù)值超過(guò)93.75％)，將選中的重組單株自交一次，獲得自交種，利用正向選擇標(biāo)記PiC11ID17對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，并利用水稻全基因組育種芯片，例如RICE60K，對(duì)其進(jìn)行背景選擇，最終獲得含抗稻瘟病基因組重組核酸片段純合且背景回復(fù)(背景回復(fù)值超過(guò)99％)的水稻植株。

在另一實(shí)施方案中，利用分子標(biāo)記對(duì)重組植株進(jìn)行前景選擇時(shí)采用的擴(kuò)增引物，包括：用于擴(kuò)增分子標(biāo)記PiC11ID17的引物對(duì)，其中正向引物為5’-GTACTGGAGGATCAGGACTGG-3’，反向引物為5’-CTGTTGCCTTGTGACTGTGAG-3’；用于擴(kuò)增分子標(biāo)記PiC11S122的引物對(duì)，其中正向引物為5’-TACGACCGTGACATGTCCTT-3’，反向引物為5’-ATTAACCACCATGCTCACCA-3’；以及用于擴(kuò)增分子標(biāo)記PiC11S166的引物對(duì)，其中正向引物為5’-TTAGCCCCTCTCTCTCTCCA-3’，反向引物為5’-GCCAGATCTAGCAGAGGTGA-3’。

又一方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝藱z測(cè)重組核酸片段的方法，其包括根據(jù)如前所述的重組核酸片段設(shè)計(jì)特異性引物，以待測(cè)基因組為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，并分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的步驟。具體地，例如，所述引物如前所述。可選擇地，利用Sanger測(cè)序法分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

具體而言，本申請(qǐng)?zhí)峁┑臋z測(cè)重組核酸片段的方法中，用于擴(kuò)增及檢測(cè)SEQ ID NO:1所示序列的引物組合如下：擴(kuò)增引物，包括正向引物：5’-TGCCGAACGGTGAATAATGTAA-3’，和反向引物：5’-GCCTTGATCTAGGAGGGAATGT-3’；測(cè)序引物，包括正向引物：5’-TGCCGAACGGTGAATAATGTAA-3’，和反向引物：5’-GCCTTGATCTAGGAGGGAATGT-3’。所述方法以待測(cè)樣品基因組DNA為模板， 利用上述擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后利用上述測(cè)序引物對(duì)獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，若測(cè)序結(jié)果與SEQ ID NO:1序列一致或互補(bǔ)，則待測(cè)樣品中含有SEQ ID NO:1所示同源重組片段。

另外，在本申請(qǐng)?zhí)峁┑臋z測(cè)重組核酸片段的方法中，用于擴(kuò)增及檢測(cè)SEQ ID NO:2所示序列的引物組合如下：擴(kuò)增引物，包括正向引物：5’-CCTATGTCTAGTCGCTGAAATCC-3’，反向引物：5’-GAGAACGAATCCCTGTCTAACTG-3’；測(cè)序引物，包括正向引物：5’-CCTATGTCTAGTCGCTGAAATCC-3’，反向引物：5’-GTACTCGGGCGATGCTTTAC-3’，和反向引物5’-GAGAACGAATCCCTGTCTAACTG-3’。所述方法以待測(cè)樣品基因組DNA為模板，利用上述擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后利用上述測(cè)序引物對(duì)獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，若測(cè)序結(jié)果與SEQ ID NO:2序列一致或互補(bǔ)，則待測(cè)樣品中含有SEQ ID NO:2所示同源重組片段。

通過(guò)檢測(cè)確定了待測(cè)樣品中含有SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2所示序列的重組核酸片段，即可確定待測(cè)樣品中包含含有抗性基因的重組核酸片段。

此外，本申請(qǐng)還提供了檢測(cè)重組核酸片段的試劑盒，其包括如前述的引物。

進(jìn)一步地，本申請(qǐng)還提供了篩選含有重組核酸片段的水稻植株或種子的方法，其包括檢測(cè)待測(cè)水稻植株的基因組中是否含有如前所述的重組核酸片段的步驟。在一實(shí)施方案中，采用如前所述的引物來(lái)檢測(cè)待測(cè)水稻植株的基因組中是否含有如前所述的重組核酸片段。在另一實(shí)施方案中，采用如前所述的檢測(cè)重組核酸片段的方法來(lái)檢測(cè)待測(cè)水稻植株的基因組中是否含有如前所述的重組核酸片段。在又一實(shí)施方案中，采用如前所述的試劑盒來(lái)檢測(cè)待測(cè)水稻植株的基因組中是否含有如前所述的重組核酸片段。

在又一方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝送ㄟ^(guò)所述方法篩選得到的含有本申請(qǐng)公開(kāi)的重組核酸片段的水稻植株或其種子。

本申請(qǐng)?zhí)峁┑幕谌蚪M選擇育種技術(shù)的選育含有抗稻瘟病基因組重組核酸片段的水稻植株的方法，具有快速、準(zhǔn)確、穩(wěn)定的優(yōu)勢(shì)。 僅通過(guò)五世代轉(zhuǎn)育，即可僅將目標(biāo)基因組片段導(dǎo)入受體材料，并同時(shí)實(shí)現(xiàn)背景的回復(fù)。本申請(qǐng)改良的受體材料為‘盛世B’，是優(yōu)質(zhì)早秈不育系‘盛世A’的保持系，具有米質(zhì)好的突出特點(diǎn)。利用上述方法，可以在保留‘盛世B’原有優(yōu)點(diǎn)的情況下，導(dǎo)入稻瘟病抗性基因組片段，提高其稻瘟病抗性。進(jìn)一步的，通過(guò)至少一代雜交、一代回交即可獲得穩(wěn)定的含有稻瘟病抗性片段的‘盛世A’，再通過(guò)配組實(shí)現(xiàn)雜交種稻瘟病抗性的大幅度提高。本申請(qǐng)?zhí)峁┑幕蚪M重組核酸片段與稻瘟病抗性緊密相關(guān)，可作為抗性資源應(yīng)用于其他品種的培育。

附圖說(shuō)明

圖1為本申請(qǐng)實(shí)施例1中CR010066水稻RICE60K全基因組育種芯片檢測(cè)結(jié)果；其中，橫坐標(biāo)數(shù)字所指示方框依次表示水稻12條染色體，縱坐標(biāo)數(shù)字為水稻基因組上的物理位置[以兆堿基(Mb)為單位]，灰色線條代表受體親本‘盛世B’基因型，黑色線條代表供體親本‘華2048B’基因型，白色線條代表兩親本基因型一致即無(wú)多態(tài)性區(qū)段。圖中第11號(hào)染色體黑色圓點(diǎn)處線條顯示區(qū)段即為導(dǎo)入的抗稻瘟病基因組重組核酸片段RecCR010066。

圖2為本申請(qǐng)實(shí)施例2中RecCR010066上游同源重組片段測(cè)序比對(duì)結(jié)果；圖中所示星號(hào)代表比對(duì)結(jié)果中相同堿基，圖中CR010066為獲得的新品系，T003為受體親本‘盛世B’，R006為供體親本‘華2048B’。

圖3為本申請(qǐng)實(shí)施例2中RecCR010066下游同源重組片段測(cè)序比對(duì)結(jié)果。

圖4為本申請(qǐng)實(shí)施例2中RecCR010066兩側(cè)同源重組片段的結(jié)構(gòu)圖；其中，(A)為上游同源重組片段結(jié)構(gòu)圖；(B)為下游同源重組片段結(jié)構(gòu)圖，上方堿基為供體‘華2048B’的SNP或InDel標(biāo)記，下方堿基為受體‘盛世B’的SNP或InDel標(biāo)記。灰色區(qū)段為來(lái)源于‘盛世B’基因組區(qū)段，黑色區(qū)段為來(lái)源于‘華2048B’基因組區(qū)段，白色區(qū)段為同源重組區(qū)段，橫坐標(biāo)為片段長(zhǎng)度，以堿基對(duì)數(shù)目(bp)為單位。

圖5為本申請(qǐng)實(shí)施例3中CR010066稻瘟病抗性室內(nèi)鑒定結(jié)果； 圖中所示葉片依次為：(A)稻瘟病感病品種麗江新團(tuán)黑谷；(B)原品種‘盛世B’；(C)改良新品系CR010066；(D)稻瘟病抗病品種谷梅4號(hào)。

具體實(shí)施方式

提供以下定義和方法用以更好地界定本申請(qǐng)以及在本申請(qǐng)實(shí)踐中指導(dǎo)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員。除非另作說(shuō)明，術(shù)語(yǔ)按照相關(guān)領(lǐng)域普通技術(shù)人員的常規(guī)用法理解。

如本文所用，“核苷酸序列”包括涉及單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸多聚物，并且除非另有限制，核苷酸序列以5’至3’方向從左向右書(shū)寫(xiě)，包括具有天然核苷酸基本性質(zhì)的已知類(lèi)似物(例如，肽核酸)，所述類(lèi)似物以與天然存在的核苷酸類(lèi)似的方式與單鏈核酸雜交。

在一些實(shí)施方案中，可以對(duì)本申請(qǐng)的核苷酸序列進(jìn)行改變，以進(jìn)行保守氨基酸替換。在某些實(shí)施方案中，可以依照單子葉密碼子偏好性對(duì)本申請(qǐng)的核苷酸序列進(jìn)行不改變氨基酸序列的替換，例如可以用單子葉植物偏好的密碼子替換編碼同一氨基酸序列的密碼子，而不改變?cè)摵塑账嵝蛄兴幋a的氨基酸序列。

具體地，本申請(qǐng)涉及對(duì)SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2進(jìn)一步優(yōu)化所得的核苷酸序列。該方法的更多細(xì)節(jié)描述于Murray等(1989)Nucleic Acids Res.17:477-498。優(yōu)化核苷酸序列可用于提高抗稻瘟病基因組重組核酸片段在水稻中的表達(dá)。

在一些實(shí)施方案中，本申請(qǐng)還涉及SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示序列的變體。一般來(lái)講，特定核苷酸序列的變體將與該特定核苷酸序列具有至少約70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％或更高的序列同一性，或以上的互補(bǔ)序列。這樣的變體序列包括一個(gè)或多個(gè)核酸殘基的添加、缺失或替換，從而可以導(dǎo)致相應(yīng)的氨基酸殘基的添加、移除或替換。通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)已知的序列比對(duì)程序包括雜交技術(shù)確定序列同一性。實(shí)施方案的核苷酸序列變體與本申請(qǐng)的序列的差異可以少至1-15個(gè)核苷酸、少至1-10個(gè)(例如6-10個(gè))， 少至5個(gè)，少至4、3、2或甚至1個(gè)核苷酸。

本申請(qǐng)還涉及包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示序列中特定位點(diǎn)的序列或其片段或其變體或其互補(bǔ)序列，例如，包含SEQ ID NO:1所示序列的331-462位核苷酸的序列或其片段或其變體或其互補(bǔ)序列，或者包含SEQ ID NO:2所示序列的序列或其487-513位核苷酸的序列或其片段或其變體或其互補(bǔ)序列。根據(jù)包含上述特定位點(diǎn)的片段，能夠特異性地鑒定出相應(yīng)的SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示序列。進(jìn)一步地，通過(guò)鑒定出含有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示序列的重組核酸片段，即可確定待測(cè)樣品中包含含有抗性基因的重組核酸片段。

如本文所用，“水稻”是任何水稻植株并包括可以與水稻育種的所有植物品種。如本文所用，“植株”或“植物”，包括整株植物、植物細(xì)胞、植物器官、植物原生質(zhì)體、植物可以從中再生的植物細(xì)胞組織培養(yǎng)物、植物愈傷組織、植物叢和植物或植物部分中完整的植物細(xì)胞，所述植物部分例如胚、花粉、胚珠、種子、葉、花、枝、果實(shí)、莖桿、根、根尖、花藥等。

在本申請(qǐng)的方法可以適用于任何需要選育的水稻品種。也就是說(shuō)，可以將任何缺少某種有利性狀的優(yōu)良品種(即綜合性狀較好，預(yù)計(jì)有發(fā)展前途的品種)用作輪回親本。用另一具有該受體所缺少的有利性狀的品種作為供體親本，并且所提供的有利性狀最好是顯性單基因控制的。在本申請(qǐng)的實(shí)施方案中，采用水稻‘盛世B’作為輪回親本，采用已被證實(shí)具有良好的稻瘟病抗性的水稻‘華2048B’作為供體。

在本申請(qǐng)所提供的重組植株的選育方法中，利用分子標(biāo)記對(duì)重組植株進(jìn)行前景選擇。前景選擇的可靠性主要取決于標(biāo)記與目標(biāo)基因間連鎖的緊密程度，為提高選擇的準(zhǔn)確率，一般同時(shí)用兩側(cè)相鄰的兩個(gè)標(biāo)記對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行跟蹤選擇。

在本申請(qǐng)的實(shí)施方案中，采用的前景選擇標(biāo)記包括正向選擇標(biāo)記和負(fù)向選擇標(biāo)記。在具體實(shí)施方案中，經(jīng)優(yōu)化篩選使用的正向前景選擇標(biāo)記是與目標(biāo)基因組DNA片段緊密連鎖的標(biāo)記PiC11ID17，負(fù)向選擇標(biāo)記是位于目標(biāo)片段上游的標(biāo)記PiC11S122，以及位于目標(biāo)片段下 游的標(biāo)記PiC11S166。

在本申請(qǐng)的實(shí)施方案中，利用上述前景選擇標(biāo)記進(jìn)行同源重組的檢測(cè)時(shí)，一側(cè)或單側(cè)同源重組的判斷標(biāo)準(zhǔn)是PiC11ID17檢出與‘華2048B’相同帶型，且PiC11S122或PiC11S166檢出與‘盛世B’相同帶型；兩側(cè)或雙側(cè)同源重組的判斷標(biāo)準(zhǔn)是PiC11ID17檢出與‘華2048B’相同帶型，且PiC11S122和PiC11S166檢出與‘盛世B’相同帶型。

在本申請(qǐng)中，可以使用任何一種可利用的芯片進(jìn)行本申請(qǐng)所提供的育種方法中的背景選擇。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以采用本申請(qǐng)人在中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)CN102747138A中公開(kāi)的水稻全基因組育種芯片RICE6K，或者在PCT國(guó)際申請(qǐng)WO/2014/121419中公開(kāi)的水稻全基因組育種芯片RICE60K。這兩份申請(qǐng)文件中的全部?jī)?nèi)容整體并入本文作為參考。

以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明而非限制本申請(qǐng)范圍的目的。若未特別指明，實(shí)施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造廠商說(shuō)明書(shū)建議的條件。

本申請(qǐng)中所使用的水稻植株材料信息均可參見(jiàn)中國(guó)水稻品種及其系譜數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ricedata.cn/variety/index.htm)。

本申請(qǐng)中所提到的水稻基因組物理位置均參照水稻日本晴基因組MSU/TIGR注釋第6.1版(http://rice.plantbiology.msu.edu/)。

實(shí)施例1選育導(dǎo)入抗稻瘟病基因組片段的重組植株

本實(shí)施例中使用的材料為水稻‘盛世B’及水稻‘華2048B’。

水稻‘華2048B’具有良好的稻瘟病抗性，并推測(cè)可能是第11號(hào)染色體的Pi1及Pik簇等位基因所在區(qū)域?qū)υ摬牧系牡疚敛】剐云鸬搅岁P(guān)鍵作用。

在重組植株的選育過(guò)程中，利用分子標(biāo)記對(duì)重組植株進(jìn)行前景選擇，對(duì)所采用的前景選擇分子標(biāo)記進(jìn)行了篩選。參照水稻日本晴基因組MSU/TIGR注釋第6.1版，下載第11染色體27,155,000至28,495,000 DNA序列。使用SSRLocator軟件對(duì)上述序列中的SSR位點(diǎn)進(jìn)行掃描。利用Primer Premier 3.0軟件對(duì)尋找出的SSR位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，共設(shè)計(jì)引物385對(duì)。通過(guò)PCR的方法，篩選上述引物對(duì)在‘華2048B’及‘盛世B’中的多態(tài)性，最終挑選出在兩份材料中具有多態(tài)性、擴(kuò)增效率高的前景選擇分子標(biāo)記，分別是正向選擇標(biāo)記PiC11ID17和負(fù)向選擇標(biāo)記PiC11S122、PiC11S166。用于PCR擴(kuò)增上述分子標(biāo)記的具體引物信息見(jiàn)表1。

表1 前景選擇分子標(biāo)記引物信息

將水稻‘華2048B’中前述基因所在的基因組片段導(dǎo)入到水稻‘盛世B’中，具體過(guò)程如下：

以‘盛世B’為輪回親本，‘華2048B’為供體親本進(jìn)行雜交，將所得到的雜交種與輪回親本‘盛世B’進(jìn)行回交一代，獲得BC₁F₁種子，育苗后利用正向選擇標(biāo)記PiC11ID17和負(fù)向選擇標(biāo)記PiC11S122、PiC11S166進(jìn)行重組單株選擇，篩選出7個(gè)在目標(biāo)基因組DNA片段一側(cè)同源重組的單株，即PiC11ID17檢出與‘華2048B’相同帶型，且PiC11S122或PiC11S166檢出與‘盛世B’相同帶型，并利用水稻全基因組育種芯片RICE6K(CN102747138A)對(duì)其進(jìn)行背景選擇(Yu等,Plant Biotechnology Journal.2014,12:28-37)。

在篩選出的7個(gè)單側(cè)同源重組單株中比較芯片結(jié)果，選擇背景回復(fù)最好的重組單株(此世代背景回復(fù)值超過(guò)75％)，使其與輪回親本‘盛世B’再次進(jìn)行回交，獲得BC₂F₁種子，育苗后利用正向選擇標(biāo)記PiC11ID17對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，選擇含有目標(biāo)基因組片段的重組單株，即PiC11ID17檢出與‘華2048B’相同帶型，利用水稻全基因組育種芯片RICE6K對(duì)其進(jìn)行背景選擇。

選擇背景回復(fù)較好的單株(此世代背景回復(fù)值超過(guò)87.5％)，使其與 輪回親本‘盛世B’又一次進(jìn)行回交，獲得BC₃F₁種子，育苗后利用正向選擇標(biāo)記PiC11ID17和負(fù)向標(biāo)記PiC11S122、PiC11S166對(duì)收獲的種子進(jìn)行目標(biāo)基因組片段另一側(cè)同源重組片段的篩選，獲得8個(gè)在目標(biāo)片段兩側(cè)重組的單株，即PiC11ID17檢出與‘華2048B’相同帶型，且PiC11S122和PiC11S166檢出與‘盛世B’相同帶型。

利用水稻全基因組育種芯片R ICE60K(WO/2014/121419)對(duì)上述8個(gè)雙側(cè)交換單株進(jìn)行背景和目標(biāo)片段選擇(Chen等，Molecular Plant.2014,7:541-553)，篩選到導(dǎo)入目標(biāo)片段較小，且背景回復(fù)好的目標(biāo)單株一個(gè)(此世代背景回復(fù)值超過(guò)93.75％)。

將選中的單株自交一次，獲得BC₃F₂，育苗后利用正向選擇標(biāo)記PiC11ID17對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，選擇含有目標(biāo)基因組DNA片段的單株，即PiC11ID17檢出與‘華2048B’相同帶型，利用水稻全基因組育種芯片RICE60K對(duì)其進(jìn)行背景選擇。

最終獲得目標(biāo)片段純合，且背景回復(fù)(背景回復(fù)值超過(guò)99％)的株系一個(gè)，命名為CR010066。芯片檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。

實(shí)施例2導(dǎo)入稻瘟病抗性基因組片段后同源重組片段的確定

為了確定導(dǎo)入的稻瘟病抗性基因組片段大小，對(duì)‘盛世B’導(dǎo)入片段的純合單株進(jìn)行了目標(biāo)基因組片段兩側(cè)同源重組片段的測(cè)序。將CR010066所含的抗稻瘟病基因組重組核酸片段命名為RecCR010066。

通過(guò)水稻全基因組育種芯片RICE60K檢測(cè)結(jié)果初步確定，RecCR010066位于兩個(gè)SNP標(biāo)記F1127345466CT和F1128121185GA之間。

同時(shí)，使用Miseq測(cè)序技術(shù)對(duì)‘盛世B’、‘華2048B’和CR010066三個(gè)樣本進(jìn)行全基因組測(cè)序。使用TruSeq Nano DNA LT Kit(illumina)試劑盒進(jìn)行文庫(kù)建立，使用Library Quantification Kit–Universal(KAPA Biosystems)試劑盒進(jìn)行定量，使用MiSeq V2 Reagent Kit(illumina)試劑盒進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)。使用Miseq臺(tái)式測(cè)序儀(illumina)進(jìn)行檢測(cè)。具體步驟及方法參見(jiàn)各試劑盒及測(cè)序儀使用說(shuō)明書(shū)。

根據(jù)前述SNP芯片及Miseq測(cè)序結(jié)果，將RecCR010066上游同 源重組片段定位在第11染色體的27353258bp到27354300bp區(qū)間，下游同源重組片段定位于28117029bp到28118200bp區(qū)間。

在此基礎(chǔ)上，參照水稻日本晴基因組MSU/TIGR注釋第6.1版，下載對(duì)應(yīng)區(qū)段DNA序列。使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增及測(cè)序引物，設(shè)計(jì)要求為引物長(zhǎng)22nt左右、GC含量40-60％且沒(méi)有錯(cuò)配。

以受體親本‘盛世B’和供體親本‘華2048B’為對(duì)照，對(duì)RecCR010066上游和下游同源重組片段分別設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，使用高保真酶KOD FX Neo(TOYOBO)進(jìn)行擴(kuò)增，使用兩步法或三步法尋找最佳擴(kuò)增條件，確保擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)中顯示為單一明亮條帶。其中確定的上游同源重組片段擴(kuò)增引物反應(yīng)條件為：94℃2min；98℃10sec，60℃30sec，68℃60sec，37個(gè)循環(huán)；20℃1min。下游同源重組片段擴(kuò)增引物反應(yīng)條件為：94℃2min；98℃10sec，61℃30sec，68℃60sec，37個(gè)循環(huán)；20℃1min。由此，最終篩選出兩對(duì)擴(kuò)增引物分別用于上游和下游同源重組片段的擴(kuò)增。

另外，以擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，利用Sanger測(cè)序法進(jìn)行測(cè)序，根據(jù)實(shí)際測(cè)序效果，最終各自篩選出2條測(cè)序引物分別用于上游和下游同源重組片段的測(cè)序。具體的擴(kuò)增引物及測(cè)序引物序列見(jiàn)表2，測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖2和圖3。

RecCR010066上游同源重組片段測(cè)序長(zhǎng)度為1042bp(SEQ ID NO:1)。1-331bp為受體‘盛世B’的基因組區(qū)段，與供體‘華2048B’比較，存在8個(gè)SNP，1個(gè)Indel。332-461bp這一130bp區(qū)段為同源重組區(qū)段。462-1042bp為供體‘華2048B’基因組片段，與‘盛世B’比較，存在8個(gè)SNP，3個(gè)Indel。

RecCR010066下游同源重組片段測(cè)序長(zhǎng)度為1174bp(SEQ ID NO:2)。1-487bp為供體‘華2048B’的基因組區(qū)段，與‘盛世B’比較，存在2個(gè)SNP，1個(gè)Indel。488-512bp這一25bp區(qū)段為同源重組區(qū)段。513-1174bp為受體‘盛世B’的基因組區(qū)段，與供體‘華2048B’比較，存在3個(gè)SNP。

圖4為RecCR010066兩側(cè)同源重組片段的結(jié)構(gòu)圖。其中，(A)為上游同源重組片段結(jié)構(gòu)圖；(B)為下游同源重組片段結(jié)構(gòu)圖。上方堿 基為供體‘華2048B’的SNP或InDel標(biāo)記，下方堿基為受體‘盛世B’的SNP或InDel標(biāo)記?；疑珔^(qū)段為來(lái)源于‘盛世B’基因組區(qū)段，黑色區(qū)段為來(lái)源于‘華2048B’基因組區(qū)段，白色區(qū)段為同源重組區(qū)段。橫坐標(biāo)為片段長(zhǎng)度，以堿基對(duì)數(shù)目(bp)為單位。

表2 抗稻瘟病基因組重組核酸片段擴(kuò)增及測(cè)序引物信息

實(shí)施例3‘盛世B’導(dǎo)入抗稻瘟病基因組片段后的抗性鑒定

為了鑒定抗性效果，對(duì)本申請(qǐng)選育的新品系CR010066、輪回親本‘盛世B’、稻瘟病抗病品種谷梅4號(hào)(作為陽(yáng)性對(duì)照)，以及稻瘟病感病品種麗江新團(tuán)黑谷(作為陰性對(duì)照)進(jìn)行室內(nèi)種植，將其培養(yǎng)至3-4葉期后采用如下方法進(jìn)行鑒定：

選取2013年從江西病圃稻瘟病病葉上分離的5121-1，廣東病圃稻瘟病病葉上分離的1124-1，共2株稻瘟病菌株作為接種菌株。菌株采用高粱粒法-20℃保存，使用前將保存的高粱粒取出至馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)平板活化(PDA：去皮馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂粉15g，蒸餾水定容至1L)，28℃光照培養(yǎng)5天后取直徑5mm的新鮮菌絲塊轉(zhuǎn)接至高粱粒培養(yǎng)基中(高粱粒500g加入1.5L蒸餾水，煮至沸騰后濾去液體，將高粱粒撈出裝入250ml三角瓶，100ml/瓶，濕熱滅菌20分鐘)，10塊/瓶，接菌2天后每天將高粱粒搖散，28℃黑暗培養(yǎng)至菌絲長(zhǎng)滿高粱粒。然后將高粱粒攤在無(wú)菌紗布上，蓋上無(wú)菌的潮濕紗布，在25℃，RH≥95％，12h光照條件下培養(yǎng)4-5天至大量孢子產(chǎn)生，用無(wú)菌水(含0.02％吐溫20)洗下孢子，等孢子量混合接種菌株，調(diào)整濃度至5×10⁵ 個(gè)/ml。

用混合分生孢子懸浮液噴霧接種CR010066、‘盛世B’、谷梅4號(hào)及麗江新團(tuán)黑谷，接種三個(gè)重復(fù)。接種后罩上透明罩子，28℃黑暗培養(yǎng)24h，然后16h光照培養(yǎng)5天后調(diào)查。

調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)為0級(jí)(高抗，HR)：沒(méi)有癥狀；1級(jí)(抗，R)：很小的褐色病斑；2級(jí)(中抗，MR)：直徑約為1mm的褐色病斑；3級(jí)(MS，中感)：直接約為2-3mm的帶圓形病斑，中央灰白色，邊緣褐色；4級(jí)(感，S)：長(zhǎng)約1-3cm的橢圓形病斑，中央灰白色，邊緣褐色；5級(jí)(高感，HS)：長(zhǎng)且寬的大橢圓形病斑，病斑融合成片，至葉片枯死。其中0-2級(jí)為抗病，3-5級(jí)為感病。接種結(jié)果見(jiàn)表3和圖5。

表3 接種稻瘟菌后的抗性表現(xiàn)

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本申請(qǐng)作了詳盡的描述，但在本申請(qǐng)基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因此，在不偏離本申請(qǐng)精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本申請(qǐng)要求保護(hù)的范圍。