本發(fā)明涉及熒光性標(biāo)記單鏈核酸及其用途。本發(fā)明涉及能夠進(jìn)一步降低熒光背景的熒光性標(biāo)記單鏈核酸及其用途。

關(guān)聯(lián)申請(qǐng)的相互參照

本申請(qǐng)要求2014年3月31日申請(qǐng)的日本特愿2014-72280號(hào)的優(yōu)先權(quán)，其全部記載特別地作為公開(kāi)而援引于此。

背景技術(shù)：

在細(xì)胞的生命現(xiàn)象的解析及疾病因子的診斷中要求以分子水平的檢測(cè)、診斷。為了達(dá)成該檢測(cè)、診斷，需要檢測(cè)特定的蛋白質(zhì)、核酸序列，在該檢測(cè)中，熒光被廣泛利用。具體而言，已知有使用與靶蛋白質(zhì)、及靶核酸序列那樣的靶物質(zhì)鍵合而熒光強(qiáng)度增大那樣的熒光物質(zhì)的方法。作為上述熒光物質(zhì)，例如利用顯示福斯特共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)效應(yīng)的物質(zhì)、嵌入雙螺旋結(jié)構(gòu)中并通過(guò)激發(fā)光的照射而發(fā)出熒光的物質(zhì)。

例如，在非專利文獻(xiàn)1中記載的Molecular Beacon法中，使用在單獨(dú)采取莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的核酸序列的5’末端、3’末端分別導(dǎo)入了不同的色素的核酸。在沒(méi)有雜交時(shí)通過(guò)FRET效應(yīng)而消光，若產(chǎn)生特異性雜交則發(fā)出熒光。在該方法中，存在序列需要采取莖-環(huán)結(jié)構(gòu)、需要將熒光色素導(dǎo)入末端等制約。

因此，作為代替上述那樣的現(xiàn)有技術(shù)的其它的消光機(jī)制，提出了采用由于兩個(gè)以上的色素分子并列地集合而產(chǎn)生的激子效應(yīng)的方法(非專利文獻(xiàn)2～5、專利文獻(xiàn)1)。其是使用復(fù)合體標(biāo)記物質(zhì)的方法，所述復(fù)合體標(biāo)記物質(zhì)在同一分子內(nèi)具有以下的兩個(gè)以上的色素分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)，即，在單鏈時(shí)通過(guò)激子效應(yīng)而不顯示熒光發(fā)光，但若這些分子與核酸嵌入或進(jìn)行溝槽鍵合(groove binding)，則通過(guò)上述集合狀態(tài)解開(kāi)而產(chǎn)生熒光發(fā)光。

使用將該標(biāo)記物質(zhì)導(dǎo)入低聚核苷酸而得到的引物或探針(有時(shí)稱為激子低聚物)，可以用于靶核酸的擴(kuò)增、檢測(cè)。該激子低聚物等能夠以一種色素實(shí)現(xiàn)雜交前后的熒光的開(kāi)關(guān)，此外，在利用于擴(kuò)增反應(yīng)的實(shí)時(shí)監(jiān)控中的情況下，能夠給予序列特有的熒光信號(hào)。因此，能夠克服在使用SYBR Green I等嵌人劑時(shí)非特異性擴(kuò)增也被檢測(cè)這樣的現(xiàn)有技術(shù)的問(wèn)題。進(jìn)而，由于能夠?qū)晒鈭F(tuán)導(dǎo)入dT或dC，所以也基本能夠避免序列的制約。

專利文獻(xiàn)1：日本特開(kāi)2009-171935號(hào)公報(bào)(日本專利第4370385號(hào)公報(bào))

專利文獻(xiàn)2：日本特開(kāi)2013-183736號(hào)公報(bào)

專利文獻(xiàn)1及2的全部記載特別地作為公開(kāi)而援引于此。

非專利文獻(xiàn)1：Tyagi,S.,Kramer,F.R.(1996)Nat.Biotechnol.14,303-308.

非專利文獻(xiàn)2：Ikeda S,Kubota T,Kino K,Okamoto A.,Bioconjug Chem.2008.19.1719-1725.

非專利文獻(xiàn)3：Ikeda S,Kubota T,Yuki M,Okamoto A.,Angew Chem Int Ed Engl.2009.48.6480-6484.

非專利文獻(xiàn)4：Ikeda S,Yuki M,Yanagisawa H,Okamoto A.,Tetrahedron Lett.2009,51,7191-7195

非專利文獻(xiàn)5：Takeshi Hanami,Diane Delobel,Hajime Kanamori,Yuki Tanaka,Yasumasa Kimura,Ayako Nakasone,Takahiro Soma,Yoshihide Hayashizaki,Kengo Usui,Matthias Harbers,PLOS ONE,August 2013,volume8,Issue 8,e70942

非專利文獻(xiàn)1～5的全部記載特別地作為公開(kāi)而援引于此。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

發(fā)明所要解決的課題

但是，本發(fā)明人們進(jìn)一步進(jìn)行了研究，結(jié)果判明：即使是使用上述激子低聚物的情況下，在高靈敏度的測(cè)定中，也存在一定的背景。進(jìn)而，還判明：該背景在使用激子低聚物作為探針，且在與微量的靶鍵合時(shí)產(chǎn)生的微弱的熒光的檢測(cè)的方法等中，有時(shí)阻礙熒光的檢測(cè)。

因此，本發(fā)明的目的在于，提供進(jìn)一步降低了上述激子低聚物所具有的背景的新型熒光性標(biāo)記單鏈核酸、及提供該熒光性標(biāo)記單鏈核酸的新用途。

以往的激子低聚物是導(dǎo)入了兩個(gè)熒光色素(噻唑橙或其類似物)的標(biāo)記單鏈核酸，在單鏈的狀態(tài)下通過(guò)兩個(gè)熒光色素形成激發(fā)復(fù)合體的激子效應(yīng)，基本不發(fā)出熒光。但是，例如具有以下熒光開(kāi)關(guān)的性質(zhì)：若與靶DNA雜交，則兩個(gè)色素彼此分離，通過(guò)消除激子效應(yīng)而發(fā)揮熒光色素本來(lái)所具有的熒光性。

但是，本發(fā)明人進(jìn)行了研究，結(jié)果判明：由激子效應(yīng)產(chǎn)生的熒光的消光機(jī)制也不完美，無(wú)法將熒光色素本來(lái)所具有的熒光性完全消光，因此，單鏈時(shí)的熒光來(lái)源的背景雖然少但存在。因此，以激子低聚物作為基本骨架，為了進(jìn)一步降低熒光的背景的目的而反復(fù)進(jìn)行了研究。其結(jié)果發(fā)現(xiàn)：通過(guò)將由激子效應(yīng)產(chǎn)生的熒光開(kāi)關(guān)與FRET效應(yīng)組合，能夠進(jìn)一步降低熒光的背景，從而完成本發(fā)明。

用于解決課題的方案

本發(fā)明如下所述。

[1]一種標(biāo)記單鏈核酸，其特征在于，其是具有至少兩個(gè)顯示激子效應(yīng)的一對(duì)熒光性原子團(tuán)的標(biāo)記單鏈核酸，

上述一對(duì)熒光性原子團(tuán)中的一個(gè)(以下，稱為一對(duì)熒光性原子團(tuán)A)所具有的發(fā)光峰值波長(zhǎng)比一對(duì)熒光性原子團(tuán)中的另一個(gè)(以下，稱為一對(duì)熒光性原子團(tuán)B)所具有的激發(fā)峰值波長(zhǎng)短，

上述一對(duì)熒光性原子團(tuán)A與上述一對(duì)熒光性原子團(tuán)B具有福斯特共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)效應(yīng)。

[2]根據(jù)[1]所述的標(biāo)記單鏈核酸，其中，具有上述一對(duì)熒光性原子團(tuán)A的堿基和具有上述一對(duì)熒光性原子團(tuán)B的堿基以上述一對(duì)熒光性原子團(tuán)A與上述一對(duì)熒光性原子團(tuán)B具有FRET效應(yīng)那樣的距離被包含于上述標(biāo)記單鏈核酸中。

[3]根據(jù)[2]所述的標(biāo)記單鏈核酸，其中，

具有上述一對(duì)熒光性原子團(tuán)A的堿基與具有上述一對(duì)熒光性原子團(tuán)B的堿基之間的距離為1個(gè)堿基～11個(gè)堿基。

[4]根據(jù)[1]～[3]中任一項(xiàng)所述的標(biāo)記單鏈核酸，其中，

具有上述顯示激子效應(yīng)的一對(duì)熒光性原子團(tuán)的堿基具有下述式(16)、(16b)、(17)、或(17b)所表示的結(jié)構(gòu)。

[化學(xué)式1]

[化學(xué)式2]

[化學(xué)式3]

[化學(xué)式4]

式(16)、(16b)、(17)、及(17b)中，

B為具有天然核酸堿基(腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶)骨架或人工核酸堿基骨架的原子團(tuán)，

E為(i)具有脫氧核糖骨架、核糖骨架、或由它們中的任一者衍生的結(jié)構(gòu)的原子團(tuán)、或者(ii)具有肽結(jié)構(gòu)或類肽結(jié)構(gòu)的原子團(tuán)，

Z¹¹及Z¹²分別為顯示激子效應(yīng)的熒光性原子團(tuán)，可以相同，也可以不同，

L¹、L²及L³分別為連接片段(交聯(lián)原子或原子團(tuán))，主鏈長(zhǎng)(主鏈原子數(shù))任意，主鏈中可以分別包含或不包含C、N、O、S、P及Si，主鏈中可以分別包含或不包含單鍵、雙鍵、三鍵、酰胺鍵、酯鍵、二硫鍵、亞氨基、醚鍵、硫醚鍵及硫酯鍵，L¹、L²及L³彼此可以相同，也可以不同，

D為CR、N、P、P＝O、B或SiR，R為氫原子、烷基或任意的取代基，

b為單鍵、雙鍵或三鍵，

或者，上述式(16)及(16b)中，L¹及L²為上述連接片段，L³、D及b不存在，L¹及L²也可以與B直接鍵合，

其中，式(16)、及(17)中，E為上述(i)的原子團(tuán)，磷酸交聯(lián)中的至少一個(gè)O原子也可以被S原子取代，

式(16b)、及(17b)中，E為上述(ii)的原子團(tuán)，

式(17)及(17b)中，各B可以相同，也可以不同，各E可以相同，也可以不同。

[5]根據(jù)[4]所述的標(biāo)記單鏈核酸，其中，

上述式(16)所表示的結(jié)構(gòu)為下述式(16-1)或(16-2)所表示的結(jié)構(gòu)，

上述式(16b)所表示的結(jié)構(gòu)為下述式(16b-1)或(16b-2)所表示的結(jié)構(gòu)，

上述式(17)所表示的結(jié)構(gòu)為下述式(17-1)所表示的結(jié)構(gòu)，

上述式(17b)所表示的結(jié)構(gòu)為下述式(17b-1)所表示的結(jié)構(gòu)。

[化學(xué)式5]

[化學(xué)式6]

[化學(xué)式7]

[化學(xué)式8]

[化學(xué)式9]

[化學(xué)式10]

式(16-1)、(16-2)、(16b-1)、(16b-2)、(17-1)及(17b-1)中，

l、m及n為任意的正整數(shù)，可以相同，也可以不同，主鏈中可以分別包含或不包含C、N、O、S、P及Si，主鏈中可以分別包含或不包含單鍵、雙鍵、三鍵、酰胺鍵、酯鍵、二硫鍵、亞氨基、醚鍵、硫醚鍵及硫酯鍵，

B、E、Z¹¹、Z¹²及b與上述式(16)、(16b)、(17)及(17b)相同，

上述式(16-1)、(16-2)及(17-1)中，磷酸交聯(lián)中的O原子的一個(gè)以上也可以被S原子取代。

[6]根據(jù)[4]或[5]所述的標(biāo)記單鏈核酸，其中，

具有上述顯示激子效應(yīng)的一對(duì)熒光性原子團(tuán)的堿基具有上述式(16)所表示的結(jié)構(gòu)。

[7]根據(jù)[4]～[6]中任一項(xiàng)所述的標(biāo)記單鏈核酸，其中，

Z¹¹及Z¹²分別獨(dú)立地為下述式(7)～(10)中的任一者所表示的原子團(tuán)。

[化學(xué)式11]

[化學(xué)式12]

[化學(xué)式13]

[化學(xué)式14]

式(7)～(9)中，

X¹及X²為S或O，

n為0或正整數(shù)，

R¹～R¹⁰、R¹³～R²¹分別獨(dú)立地為氫原子、鹵素原子、低級(jí)烷基、低級(jí)烷氧基、硝基、或氨基，

R¹¹及R¹²中的一者為與上述式(16)、(17)、(16b)、及(17b)中的L¹或L²鍵合的連結(jié)基團(tuán)，另一者為氫原子或低級(jí)烷基，

R¹⁵在式(7)、(8)或(9)中存在多個(gè)時(shí)，可以相同，也可以不同，

R¹⁶在式(7)、(8)或(9)中存在多個(gè)時(shí)，可以相同，也可以不同，

Z¹¹中的X¹、X²及R¹～R²¹與Z¹²中的X¹、X²及R¹～R²¹彼此可以相同，也可以不同，

式(10)中，

E為S或O，

R²～R¹²分別獨(dú)立地為氫原子、鹵素原子、低級(jí)烷基、低級(jí)烷氧基、硝基、或氨基，

R¹為與上述式(16)、(17)、(16b)、及(17b)中的L¹或L²鍵合的連結(jié)基團(tuán)，

R³在式(10)中存在多個(gè)時(shí)，可以相同，也可以不同，

R⁴在式(10)中存在多個(gè)時(shí)，可以相同，也可以不同。

[8]根據(jù)[7]所述的標(biāo)記單鏈核酸，其中，

Z¹¹及Z¹²分別獨(dú)立地為上述式(7)或(8)所表示的原子團(tuán)，

上述式(7)或(8)所表示的Z¹¹及Z¹²為下述式(19)或(20)所示的基團(tuán)。

[化學(xué)式15]

[化學(xué)式16]

式(19)及(20)中，

X¹、R¹至R¹⁰、R¹³及R¹⁴、R¹¹以及R¹²與式(7)～(9)相同。

[9]根據(jù)[1]～[8]中任一項(xiàng)所述的標(biāo)記單鏈核酸，

其作為用于擴(kuò)增靶核酸的引物或用于與靶核酸雜交的探針使用。

[10]一種靶核酸的檢測(cè)方法，其中，

以[1]～[8]中任一項(xiàng)所述的標(biāo)記單鏈核酸作為探針，在能夠與靶核酸雜交的條件下，通過(guò)測(cè)定熒光而求出有無(wú)與探針的雜交。

[11]一種靶核酸的擴(kuò)增方法，

其包括以下工序：使用[1]～[8]中任一項(xiàng)所述的標(biāo)記單鏈核酸作為引物，將靶核酸進(jìn)行擴(kuò)增。

發(fā)明效果

根據(jù)本發(fā)明，能夠提供以激子低聚物作為基本骨架的標(biāo)記單鏈核酸、即能夠進(jìn)一步降低熒光的背景的標(biāo)記單鏈核酸。

附圖說(shuō)明

圖1A表示實(shí)施例1中得到的本發(fā)明的導(dǎo)入了兩個(gè)具有激子效應(yīng)的熒光色素的熒光核酸探針的光譜測(cè)定結(jié)果。這里表示使用低聚核苷酸(EX16-12TOTP)的結(jié)果，其中所述低聚核苷酸在自3’末端起第12個(gè)堿基上具有噻唑粉(TP)、且在自3’末端起第16個(gè)堿基上具有噻唑橙(TO)。

圖1B表示實(shí)施例1中得到的導(dǎo)入了一個(gè)具有激子效應(yīng)的熒光色素的熒光核酸探針(現(xiàn)有技術(shù))的光譜測(cè)定結(jié)果。這里表示使用具有與EX16-12TOTP相同的序列、且在自3’末端起第16個(gè)堿基上具有噻唑橙(TO)的低聚核苷酸(EX16.TO)的結(jié)果。

圖1C表示實(shí)施例1中得到的導(dǎo)入了一個(gè)具有激子效應(yīng)的熒光色素的熒光核酸探針(現(xiàn)有技術(shù))的光譜測(cè)定結(jié)果。這里表示使用具有與EX16-12TOTP相同的序列、且在自3’末端起第12個(gè)堿基上具有噻唑粉(TP)的低聚核苷酸(EX16.TP)的結(jié)果。

圖2A表示實(shí)施例1中得到的導(dǎo)入了兩個(gè)具有激子效應(yīng)的熒光色素的熒光核酸探針(EX8-12TOTP)的熔化曲線解析結(jié)果(噻唑橙(TO、自3’末端起第8個(gè)堿基)與噻唑粉(TP、自3’末端起第12個(gè)堿基)間的距離：3個(gè)堿基)。作為比較，還示出在與上述相同的位置僅導(dǎo)入了噻唑橙(TO)的熒光核酸探針的熔化曲線解析結(jié)果。

圖2B表示實(shí)施例1中得到的導(dǎo)入了兩個(gè)具有激子效應(yīng)的熒光色素的熒光核酸探針(EX10-12TOTP)的熔化曲線解析結(jié)果(噻唑橙(TO、自3’末端起第10個(gè)堿基)與噻唑粉(TP、自3’末端起第12個(gè)堿基)間的距離：1個(gè)堿基)。作為比較，還示出在與上述相同的位置僅導(dǎo)入了噻唑橙(TO)的熒光核酸探針的熔化曲線解析結(jié)果。

圖2C表示實(shí)施例1中得到的導(dǎo)入了兩個(gè)具有激子效應(yīng)的熒光色素的熒光核酸探針(EX14-12TOTP)的熔化曲線解析結(jié)果(噻唑橙(TO、自3’末端起第14個(gè)堿基)與噻唑粉(TP、自3’末端起第12個(gè)堿基)間的距離：1個(gè)堿基)。作為比較，還示出在與上述相同的位置僅導(dǎo)入了噻唑橙(TO)的熒光核酸探針的熔化曲線解析結(jié)果。

圖2D表示實(shí)施例1中得到的導(dǎo)入了兩個(gè)具有激子效應(yīng)的熒光色素的熒光核酸探針(EX16-12TOTP)的熔化曲線解析結(jié)果(噻唑橙(TO、自3’末端起第16個(gè)堿基)與噻唑粉(TP、自3’末端起第12個(gè)堿基)間的距離：4個(gè)堿基)。作為比較，還示出在與上述相同的位置僅導(dǎo)入了噻唑橙(TO)的熒光核酸探針的熔化曲線解析結(jié)果。

圖2E表示實(shí)施例1中得到的導(dǎo)入了兩個(gè)具有激子效應(yīng)的熒光色素的熒光核酸探針(EX18-12TOTP)的熔化曲線解析結(jié)果(噻唑橙(TO、自3’末端起第18個(gè)堿基)與噻唑粉(TP、自3’末端起第12個(gè)堿基)間的距離：8個(gè)堿基)。作為比較，還示出在與上述相同的位置僅導(dǎo)入了噻唑橙(TO)的熒光核酸探針的熔化曲線解析結(jié)果。

具體實(shí)施方式

<標(biāo)記單鏈核酸>

本發(fā)明為具有至少兩個(gè)顯示激子效應(yīng)的一對(duì)熒光性原子團(tuán)的標(biāo)記單鏈核酸。并且，該本發(fā)明的標(biāo)記單鏈核酸的特征在于，

(a)上述一對(duì)熒光性原子團(tuán)中的一個(gè)(一對(duì)熒光性原子團(tuán)A)所具有的發(fā)光峰值波長(zhǎng)比一對(duì)熒光性原子團(tuán)中的另一個(gè)(一對(duì)熒光性原子團(tuán)B)所具有的激發(fā)峰值波長(zhǎng)短，并且，

(b)上述一對(duì)熒光性原子團(tuán)A與上述一對(duì)熒光性原子團(tuán)B具有福斯特共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)效應(yīng)。

關(guān)于顯示激子效應(yīng)的一對(duì)熒光性原子團(tuán)，以及關(guān)于具有該顯示激子效應(yīng)的一對(duì)熒光性原子團(tuán)的標(biāo)記單鏈核酸，在專利文獻(xiàn)1及2、以及非專利文獻(xiàn)2～5中有記載。但是，具有上述(a)及(b)的特征的具有至少兩個(gè)顯示激子效應(yīng)的一對(duì)熒光性原子團(tuán)的標(biāo)記單鏈核酸在專利文獻(xiàn)1及2、以及非專利文獻(xiàn)2～5中沒(méi)有記載。

本發(fā)明的標(biāo)記單鏈核酸是具有至少兩個(gè)顯示激子效應(yīng)的一對(duì)熒光性原子團(tuán)的單鏈核酸。

單鏈核酸可以是DNA或RNA或其混成物、進(jìn)而部分或全部具有非天然的核酸堿基的核酸。此外，本發(fā)明的標(biāo)記單鏈核酸只要是可以與靶核酸雜交，則也可以部分地包含雙鏈結(jié)構(gòu)。詳細(xì)情況在后面敘述。

對(duì)于標(biāo)記單鏈核酸的堿基長(zhǎng)度沒(méi)有特別限制，但由于主要用途為探針或引物，進(jìn)而為具有至少兩個(gè)顯示激子效應(yīng)的一對(duì)熒光性原子團(tuán)的單鏈核酸，并且為滿足上述(b)的單鏈核酸，所以單鏈核酸的堿基長(zhǎng)度例如為4～100個(gè)堿基長(zhǎng)的范圍，優(yōu)選為10～50個(gè)堿基長(zhǎng)的范圍，更優(yōu)選為10～40個(gè)堿基長(zhǎng)的范圍，進(jìn)一步優(yōu)選為10～30個(gè)堿基長(zhǎng)的范圍。堿基長(zhǎng)度可以根據(jù)用途而適當(dāng)選擇。例如在用于mRNA的捕獲劑的情況下適宜使用約80個(gè)堿基長(zhǎng)的單鏈核酸，在作為PCR引物使用的情況下，適宜使用約40個(gè)堿基長(zhǎng)的單鏈核酸，在作為探針使用的情況下，適宜使用約30個(gè)堿基長(zhǎng)的單鏈核酸。

標(biāo)記單鏈核酸所具有的顯示激子效應(yīng)的一對(duì)熒光性原子團(tuán)的數(shù)目至少為2個(gè)，可以為2個(gè)、及3個(gè)以上。在實(shí)用上，為了發(fā)揮FRET效應(yīng)，顯示激子效應(yīng)的一對(duì)熒光性原子團(tuán)的數(shù)目只要為兩個(gè)即可。但是，考慮標(biāo)記單鏈核酸的用途、熒光性原子團(tuán)的種類、一對(duì)熒光性原子團(tuán)的距離、FRET效應(yīng)的程度等，也可以為3個(gè)，進(jìn)而也可以為4個(gè)以上。

根據(jù)激子效應(yīng)，例如能夠抑制單鏈狀態(tài)下的熒光強(qiáng)度，有效地檢測(cè)雙螺旋結(jié)構(gòu)。所謂激子效應(yīng)(exciton coupling)例如是通過(guò)多個(gè)色素并列地集合并形成H聚集體(H-aggregate)，從而變得基本不顯示熒光發(fā)光的效應(yīng)。認(rèn)為該效應(yīng)是因色素的激發(fā)狀態(tài)通過(guò)Davydov splitting而分裂成兩個(gè)能級(jí)，向高能級(jí)的激發(fā)→向低能級(jí)的內(nèi)部轉(zhuǎn)換(internal conversion)→發(fā)光發(fā)生熱禁戒這樣的理由而產(chǎn)生的。但是，這些說(shuō)明不對(duì)本發(fā)明作任何限制。所謂可以引起激子效應(yīng)可以通過(guò)形成H聚集體的色素的吸收帶在比單一色素的吸收帶短的波長(zhǎng)處出現(xiàn)來(lái)確認(rèn)。作為顯示這樣的效應(yīng)的色素，例如可列舉出上述的噻唑橙和其衍生物、噻唑粉和其衍生物、噁唑黃和其衍生物、花青和其衍生物、半菁和其衍生物、甲基紅和其衍生物、另外一般被稱為花青色素、偶氮色素的色素組。

這些色素通過(guò)嵌入雙鏈而容易鍵合，所述雙鏈?zhǔn)怯尚纬闪穗p螺旋的DNA-DNA雙鏈或DNA-RNA雙鏈、或者硫代磷酸酯核酸或PNA(肽核酸)或鎖核酸(LNA)(BNA)那樣的人工核酸、與DNA或RNA形成的。若將多個(gè)這樣的色素導(dǎo)入單鏈核酸中，則在通常的單鏈狀態(tài)(例如雜交前的僅探針或引物的狀態(tài))下通過(guò)激子效應(yīng)被強(qiáng)烈消光，但若與靶DNA或RNA雜交則聚集體被解除，各色素分散地嵌入雙鏈中。由于此時(shí)在色素間沒(méi)有電子的相互作用，所以不產(chǎn)生激子效應(yīng)，顯示強(qiáng)的熒光發(fā)光。此時(shí)的色素的吸收帶與單一色素的吸收帶相同，顯示在色素間沒(méi)有產(chǎn)生激子效應(yīng)。此外，在色素嵌入雙鏈中時(shí)，由于色素本來(lái)所具有的結(jié)構(gòu)上的扭曲被消除，所以有時(shí)進(jìn)一步增強(qiáng)熒光發(fā)光。

特征(a)

一對(duì)熒光性原子團(tuán)中的一個(gè)(一對(duì)熒光性原子團(tuán)A)所具有的發(fā)光峰值波長(zhǎng)比剩余的一對(duì)熒光性原子團(tuán)中的一個(gè)(一對(duì)熒光性原子團(tuán)B)所具有的激發(fā)峰值波長(zhǎng)短。發(fā)光峰值波長(zhǎng)是指一對(duì)熒光性原子團(tuán)A被照射激發(fā)光時(shí)產(chǎn)生的發(fā)光光譜的峰值波長(zhǎng)，根據(jù)熒光性原子團(tuán)A的種類而發(fā)生變化。激發(fā)峰值波長(zhǎng)是指一對(duì)熒光性原子團(tuán)B可以吸收的激發(fā)光光譜的峰值波長(zhǎng)，根據(jù)熒光性原子團(tuán)B的種類而發(fā)生變化。對(duì)于一對(duì)熒光性原子團(tuán)A所具有的發(fā)光峰值波長(zhǎng)及一對(duì)熒光性原子團(tuán)B所具有的激發(fā)峰值波長(zhǎng)分別沒(méi)有限制。但是，在本發(fā)明的標(biāo)記單鏈核酸作為探針或引物使用，并將熒光標(biāo)記用于檢測(cè)的情況下，由于熒光發(fā)光為來(lái)自熒光性原子團(tuán)B的發(fā)光，所以可以選擇具有適于檢測(cè)的發(fā)光強(qiáng)度及波長(zhǎng)的熒光性原子團(tuán)B，在考慮熒光性原子團(tuán)B所具有的激發(fā)峰值波長(zhǎng)的基礎(chǔ)上，選擇熒光性原子團(tuán)A。此外，熒光性原子團(tuán)A所具有的發(fā)光峰值波長(zhǎng)與熒光性原子團(tuán)B所具有的激發(fā)峰值波長(zhǎng)的關(guān)系可以考慮在兩者之間得到的FRET效應(yīng)而決定。另外，一對(duì)熒光性原子團(tuán)A所具有的兩個(gè)熒光性原子團(tuán)可以相同，也可以不同，一對(duì)熒光性原子團(tuán)B所具有的兩個(gè)熒光性原子團(tuán)也可以相同，也可以不同。一對(duì)熒光性原子團(tuán)A所具有的兩個(gè)熒光性原子團(tuán)及一對(duì)熒光性原子團(tuán)B所具有的兩個(gè)熒光性原子團(tuán)中的任一者不同時(shí)，關(guān)于各熒光性原子團(tuán)，一對(duì)熒光性原子團(tuán)A所具有的兩個(gè)熒光性原子團(tuán)中的至少一個(gè)熒光性原子團(tuán)的發(fā)光峰值波長(zhǎng)比一對(duì)熒光性原子團(tuán)B所具有的兩個(gè)熒光性原子團(tuán)中的至少一個(gè)熒光性原子團(tuán)的激發(fā)峰值波長(zhǎng)短。優(yōu)選一對(duì)熒光性原子團(tuán)A所具有的兩個(gè)熒光性原子團(tuán)的發(fā)光峰值波長(zhǎng)比一對(duì)熒光性原子團(tuán)B所具有的兩個(gè)熒光性原子團(tuán)的激發(fā)峰值波長(zhǎng)短。

特征(b)

一對(duì)熒光性原子團(tuán)A與一對(duì)熒光性原子團(tuán)B顯示FRET效應(yīng)。福斯特共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)效應(yīng)也稱為熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescence resonance energy transfer)，是指在接近的兩個(gè)發(fā)色團(tuán)之間激發(fā)能量沒(méi)有變成電磁波而通過(guò)電子的共振直接轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象。能量通過(guò)被一個(gè)發(fā)色團(tuán)(給予體)吸收的光的能量向另一個(gè)發(fā)色團(tuán)(受體)轉(zhuǎn)移，在受體為熒光分子的情況下由受體放射熒光。在本發(fā)明的標(biāo)記單鏈核酸中，將具有比一對(duì)熒光性原子團(tuán)B所具有的激發(fā)峰值波長(zhǎng)短的發(fā)光峰值波長(zhǎng)的一對(duì)熒光性原子團(tuán)A按照與一對(duì)熒光性原子團(tuán)B顯示FRET效應(yīng)的方式配置。所謂一對(duì)熒光性原子團(tuán)A與一對(duì)熒光性原子團(tuán)B顯示FRET效應(yīng)的配置例如是具有一對(duì)熒光性原子團(tuán)A的堿基與具有一對(duì)熒光性原子團(tuán)B的堿基以一對(duì)熒光性原子團(tuán)A與上述一對(duì)熒光性原子團(tuán)B具有FRET效應(yīng)那樣的距離被包含于上述標(biāo)記單鏈核酸中的情況。一對(duì)熒光性原子團(tuán)A與一對(duì)熒光性原子團(tuán)B具有FRET效應(yīng)那樣的距離(堿基長(zhǎng))根據(jù)熒光性原子團(tuán)A及B的種類、組合而不同，例如為1個(gè)堿基～11個(gè)堿基，優(yōu)選為2～8個(gè)堿基，進(jìn)一步優(yōu)選為2～7個(gè)堿基，更優(yōu)選為2～6個(gè)堿基，進(jìn)一步更優(yōu)選為2～5個(gè)堿基，更進(jìn)一步優(yōu)選為2～4個(gè)堿基。另外，這里，所謂1個(gè)堿基的距離是指在一對(duì)熒光性原子團(tuán)A與一對(duì)熒光性原子團(tuán)B之間，存在一個(gè)不具有熒光性原子團(tuán)的核酸。作為熒光性原子團(tuán)A與熒光性原子團(tuán)B的組合，例如可列舉出噻唑橙(D514)與噻唑粉(D570)或D640的組合、D436與噻唑橙(D514)、噻唑粉(D570)或D640的組合。

本發(fā)明的標(biāo)記單鏈核酸除了滿足上述特征(a)及(b)以外，任意，且一對(duì)熒光性原子團(tuán)A及一對(duì)熒光性原子團(tuán)B中的任一原子團(tuán)均位于從該標(biāo)記單鏈核酸的兩末端起數(shù)位于兩個(gè)堿基以上內(nèi)側(cè)的堿基上。通過(guò)滿足該特征，能夠發(fā)揮激子效應(yīng)和FRET效應(yīng)這兩者。

具有顯示激子效應(yīng)的一對(duì)熒光性原子團(tuán)的堿基可例示出專利文獻(xiàn)1及2、以及非專利文獻(xiàn)2～5中記載的堿基。以下具體地進(jìn)行記載。

具有顯示激子效應(yīng)的一對(duì)熒光性原子團(tuán)的堿基可以具有下述式(16)、(16b)、(17)、或(17b)所表示的結(jié)構(gòu)。

[化學(xué)式17]

[化學(xué)式18]

[化學(xué)式19]

[化學(xué)式20]

式(16)、(16b)、(17)、及(17b)中，

B為具有天然核酸堿基(腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶)骨架或人工核酸堿基骨架的原子團(tuán)，

E為(i)具有脫氧核糖骨架、核糖骨架、或由它們中的任一者衍生的結(jié)構(gòu)的原子團(tuán)、或(ii)具有肽結(jié)構(gòu)或類肽結(jié)構(gòu)的原子團(tuán)，

Z¹¹及Z¹²分別為顯示熒光性的原子團(tuán)，可以相同，也可以不同，

L¹、L²及L³分別為連接片段(交聯(lián)原子或原子團(tuán))，主鏈長(zhǎng)(主鏈原子數(shù))任意，主鏈中可以分別包含或不包含C、N、O、S、P及Si，主鏈中可以分別包含或不包含單鍵、雙鍵、三鍵、酰胺鍵、酯鍵、二硫鍵、亞氨基、醚鍵、硫醚鍵及硫酯鍵，L¹、L²及L³彼此可以相同，也可以不同，

D為CR、N、P、P＝O、B或SiR，R為氫原子、烷基或任意的取代基，

b為單鍵、雙鍵或三鍵，

或者，在上述式(16)及(16b)中，L¹及L²為上述連接片段，L³、D及b不存在，L¹及L²也可以與B直接鍵合，

其中，式(16)、及(17)中，E為上述(i)的原子團(tuán)，磷酸交聯(lián)中的至少一個(gè)O原子也可以被S原子取代，

式(16b)、及(17b)中，E為上述(ii)的原子團(tuán)，

式(17)及(17b)中，各B可以相同，也可以不同，各E可以相同，也可以不同。

上述式(16)、(17)、(16b)、及(17b)中，L¹、L²及L³的主鏈長(zhǎng)(主鏈原子數(shù))分別優(yōu)選為2以上的整數(shù)。L¹、L²及L³的主鏈長(zhǎng)(主鏈原子數(shù))的上限沒(méi)有特別限制，但例如為100以下，更優(yōu)選為30以下，特別優(yōu)選為10以下。

優(yōu)選上述式(16)所表示的結(jié)構(gòu)為下述式(16-1)或(16-2)所表示的結(jié)構(gòu)，上述式(16b)所表示的結(jié)構(gòu)為下述式(16b-1)或(16b-2)所表示的結(jié)構(gòu)，上述式(17)所表示的結(jié)構(gòu)為下述式(17-1)所表示的結(jié)構(gòu)，上述式(17b)所表示的結(jié)構(gòu)為下述式(17b-1)所表示的結(jié)構(gòu)。

[化學(xué)式21]

[化學(xué)式22]

[化學(xué)式23]

[化學(xué)式24]

[化學(xué)式25]

[化學(xué)式26]

式(16-1)、(16-2)、(16b-1)、(16b-2)、(17-1)及(17b-1)中，

l、m及n為任意的正整數(shù)，可以相同，也可以不同，主鏈中可以分別包含或不包含C、N、O、S、P及Si，主鏈中可以分別包含或不包含單鍵、雙鍵、三鍵、酰胺鍵、酯鍵、二硫鍵、亞氨基、醚鍵、硫醚鍵及硫酯鍵，B、E、Z¹¹、Z¹²及b與上述式(16)、(16b)、(17)及(17b)相同。

上述式(16-1)、(16-2)及(17-1)中，磷酸交聯(lián)中的O原子的一個(gè)以上也可以被S原子取代。

Z¹¹及Z¹²為顯示激子效應(yīng)的具有熒光性的原子團(tuán)。由此，例如變成雙螺旋結(jié)構(gòu)時(shí)的熒光的增大較大，能夠進(jìn)一步有效地檢測(cè)雙螺旋結(jié)構(gòu)。

Z¹¹及Z¹²只要是顯示激子效應(yīng)的具有熒光性的原子團(tuán)即可，上述具有熒光性的原子團(tuán)沒(méi)有特別限制。從顯示激子效應(yīng)的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選使用具有芳香族性的原子團(tuán)。Z¹¹及Z¹²例如分別獨(dú)立地更優(yōu)選為由噻唑橙、噻唑粉、噁唑黃、花青、半菁、其他的花青色素、甲基紅、偶氮色素或它們的衍生物衍生的基團(tuán)。此外，也可以適宜使用由其他的公知的色素衍生的基團(tuán)。通過(guò)與DNA等核酸鍵合而使熒光強(qiáng)度變化的熒光色素被報(bào)道有許多。典型的例子中，已知溴化乙錠嵌入DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)中而顯示強(qiáng)的熒光，經(jīng)常被用于DNA檢測(cè)。此外，還已知有芘羧酰胺、氟硅酸鈉那樣的能夠根據(jù)微觀的極性來(lái)控制熒光強(qiáng)度的熒光色素。此外，上述噻唑橙是將苯并噻唑環(huán)與喹啉環(huán)以次甲基連結(jié)而成的熒光色素，通常顯示微弱的熒光，但通過(guò)嵌入具有雙螺旋結(jié)構(gòu)的DNA中而給予強(qiáng)的熒光發(fā)光。此外，例如還可列舉出熒光素、Cy3等色素。

Z¹¹及Z¹²分別獨(dú)立地更優(yōu)選為下述式(7)至(10)中的任一者所表示的原子團(tuán)。

[化學(xué)式27]

[化學(xué)式28]

[化學(xué)式29]

[化學(xué)式30]

式(7)～(9)中，

X¹及X²為S或O，

n為0或正整數(shù)，

R¹～R¹⁰、R¹³～R²¹分別獨(dú)立地為氫原子、鹵素原子、低級(jí)烷基、低級(jí)烷氧基、硝基、或氨基，

R¹¹及R¹²中的一者為與上述式(16)、(17)、(16b)、及(17b)中的L¹或L²鍵合的連結(jié)基團(tuán)，另一者為氫原子或低級(jí)烷基，

R¹⁵在式(7)、(8)或(9)中存在多個(gè)時(shí)，可以相同，也可以不同，

R¹⁶在式(7)、(8)或(9)中存在多個(gè)時(shí)，可以相同，也可以不同，

Z¹¹中的X¹、X²及R¹～R²¹與Z¹²中的X¹、X²及R¹～R²¹彼此可以相同，也可以不同。

式(10)中，

E為S或O，

R²～R¹²分別獨(dú)立地為氫原子、鹵素原子、低級(jí)烷基、低級(jí)烷氧基、硝基、或氨基，

R¹為與上述式(16)、(17)、(16b)、及(17b)中的L¹或L²鍵合的連結(jié)基團(tuán)，

R³在式(10)中存在多個(gè)時(shí)，可以相同，也可以不同，

R⁴在式(10)中存在多個(gè)時(shí)，可以相同，也可以不同。

上述式(7)～(9)中，在R¹～R²¹中，上述低級(jí)烷基為碳原子數(shù)為1～6的直鏈或支鏈烷基，上述低級(jí)烷氧基進(jìn)一步優(yōu)選為碳原子數(shù)為1～6的直鏈或支鏈烷氧基。上述式(10)中，在R²～R¹²中，上述低級(jí)烷基為碳原子數(shù)為1～6的直鏈或支鏈烷基，上述低級(jí)烷氧基進(jìn)一步優(yōu)選為碳原子數(shù)為1～6的直鏈或支鏈烷氧基。

上述式(7)～(9)中，在R¹¹及R¹²中，此外，上述式(10)中，在R¹中，上述連結(jié)基團(tuán)為碳原子數(shù)為2以上的聚亞甲基羰基，進(jìn)一步優(yōu)選以羰基部分與上述式(16)、(16b)、(17)、及(17b)中的L¹或L²鍵合。上述聚亞甲基羰基的碳原子數(shù)其上限沒(méi)有特別限制，但例如為100以下，優(yōu)選為50以下，更優(yōu)選為30以下，特別優(yōu)選為10以下。

Z¹¹及Z¹²以上述式(7)～(9)表示時(shí)，例如分別獨(dú)立地更優(yōu)選為式(19)或(20)所示的基團(tuán)。

[化學(xué)式31]

[化學(xué)式32]

式(19)及(20)中，X¹表示-S-或-O-。R¹到R¹⁰、R¹³及R¹⁴分別獨(dú)立地表示氫原子、鹵素原子、低級(jí)烷基、低級(jí)烷氧基、硝基、或氨基。R¹¹及R¹²中的一者表示與上述式(16)、(17)、(16b)、及(17b)中的L¹及L²鍵合的連結(jié)基團(tuán)，R¹¹及R¹²中的另一者表示氫原子、或低級(jí)烷基。

優(yōu)選的方式如下。

(i)Z¹¹及Z¹²分別獨(dú)立地為上述式(19)所表示的原子團(tuán)，上述式(19)中，X¹為S，R¹到R¹⁰為氫原子，R¹¹及R¹²中的一者為與上述式(16)、(17)、(16b)及(17b)中的L¹或L²鍵合的連結(jié)基團(tuán)，另一者為甲基。

(ii)Z¹¹及Z¹²分別獨(dú)立地為上述式(19)所表示的原子團(tuán)，上述式(19)中，X¹為S，R¹、R⁴、R⁵、R⁶、R⁷、R⁹及R¹⁰為氫原子，R²、R³及R¹²為甲基，R⁸為鹵素原子，R¹¹為與上述式(16)、(17)、(16b)及(17b)中的L¹或L²鍵合的連結(jié)基團(tuán)。

(iii)Z¹¹及Z¹²分別獨(dú)立地為上述式(7)所表示的原子團(tuán)，上述式(7)中，X¹為S，n為1，R¹到R¹⁰、R¹⁵、R¹⁶及R¹⁷為氫原子，R¹¹為與上述式(16)、(17)、(16b)及(17b)中的L¹或L²鍵合的連結(jié)基團(tuán)，R¹²為甲基。

Z¹¹及Z¹²分別獨(dú)立地可以為下述的各化學(xué)式中的任一者所表示的原子團(tuán)。它們依次為噻唑橙(D514)、D640、D436、D534、D543、及噻唑粉(D570)。另外，關(guān)于以原子團(tuán)D開(kāi)頭的名稱，參照非專利文獻(xiàn)3。

[化學(xué)式33]

[化學(xué)式34]

[化學(xué)式35]

[化學(xué)式36]

[化學(xué)式37]

[化學(xué)式38]

上述各化學(xué)式中，n為正整數(shù)。

上述式(16)、(17)、(16b)、及(17b)中，B可以具有天然核酸堿基骨架，但如上所述，也可以具有人工核酸堿基骨架。例如，B優(yōu)選為Py(嘧啶環(huán))、Py der.、Pu(嘌呤環(huán))、或Pu der.所表示的結(jié)構(gòu)。其中，上述所謂Py是以下述式(11)表示的6元環(huán)中的在1位具有與E鍵合的共價(jià)鍵、在5位具有與連接片段部鍵合的共價(jià)鍵的原子團(tuán)，上述所謂Py der.是上述Py的6元環(huán)的全部原子的至少一個(gè)被N、C、S或O原子取代的原子團(tuán)，上述N、C、S或O原子也可以適當(dāng)具有電荷、氫原子或取代基，上述所謂Pu是以下述式(12)表示的稠合環(huán)中的在9位具有與E鍵合的共價(jià)鍵、在8位具有與連接片段部鍵合的共價(jià)鍵的原子團(tuán)，上述所謂Pu der.是上述Pu的5元環(huán)的全部原子的至少一個(gè)被N、C、S或O原子取代的原子團(tuán)，上述N、C、S或O原子也可以適當(dāng)具有電荷、氫原子或取代基。

[化學(xué)式39]

本發(fā)明的標(biāo)記單鏈核酸中，核酸的基本骨架沒(méi)有特別限制，例如可以是低聚核苷酸、修飾低聚核苷酸、低聚核苷、修飾低聚核苷、聚核苷酸、修飾聚核苷酸、聚核苷、修飾聚核苷、DNA、修飾DNA、RNA、修飾DNA、LNA、PNA(肽核酸)、或這些嵌合體分子中的任一者，也可以是其他的結(jié)構(gòu)。此外，上述核酸的基本骨架可以是天然的，也可以是人工合成的。上述核酸在本發(fā)明的引物或引物對(duì)的情況下，例如只要是可以形成堿基對(duì)鍵的核酸即可，在核酸試樣或靶核酸序列的情況下，例如只要是作為用于合成互補(bǔ)鏈的模板發(fā)揮功能即可。因此，上述核酸例如也可以是部分地、或整體完全由人工的結(jié)構(gòu)構(gòu)成的核苷酸衍生物。作為構(gòu)成上述核酸的人工堿基，例如可以從2-氨基-6-(N,N-二甲基氨基)嘌呤吡啶-2-酮、5-甲基吡啶-2-酮、2-氨基-6-(2-噻嗯基)嘌呤、吡咯-2-甲醛、9-甲基咪唑并[(4,5)-b]吡啶、5-碘-2-氧代(1H)吡啶、2-氧代-(1H)吡啶、2-氨基-6-(2-噻唑基)嘌呤、7-(2-噻嗯基)-咪唑并[4,5-b]吡啶、溴胸腺嘧啶、氮雜腺嘌呤或氮雜鳥(niǎo)嘌呤中選擇。

作為本發(fā)明的標(biāo)記單鏈核酸，優(yōu)選基本骨架為例如低聚核苷酸、聚核苷酸、DNA、它們的修飾體。本發(fā)明中，所謂“核苷酸”例如可以是脫氧核苷酸及核糖核苷酸中的任一者，“低聚核苷酸”及“聚核苷酸”例如可以由脫氧核苷酸及核糖核苷酸中的任一者構(gòu)成，也可以包含兩者。本發(fā)明中，核酸的構(gòu)成堿基數(shù)沒(méi)有特別限制。所謂核酸的用語(yǔ)一般與所謂聚核苷酸的用語(yǔ)含義相同。所謂低聚核苷酸的用語(yǔ)一般作為表示聚核苷酸中的特別是構(gòu)成堿基數(shù)少的核苷酸的用語(yǔ)使用。一般將例如2～100個(gè)堿基長(zhǎng)、更一般將2～50個(gè)堿基長(zhǎng)左右的聚核苷酸稱為“低聚核苷酸”，但并不限定于這些數(shù)值。所謂聚核苷酸的用語(yǔ)在本發(fā)明中，例如也包含聚核苷酸及低聚核苷酸、以及肽核酸、嗎啉代核酸、甲基膦酸酯核酸、S-低聚核酸等人工合成核酸。

上述肽核酸(PNA)一般具有低聚核苷酸的脫氧核糖主鏈被肽主鏈取代的結(jié)構(gòu)。作為上述肽主鏈，例如可列舉出通過(guò)酰胺鍵而鍵合的N-(2-氨基乙基)甘氨酸的重復(fù)單元。作為與PNA的肽主鏈鍵合的堿基，例如可列舉出胸腺嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤、鳥(niǎo)嘌呤、次黃嘌呤核苷、尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、硫代尿嘧啶及2,6-二氨基嘌呤等天然存在的堿基、溴胸腺嘧啶、氮雜腺嘌呤及氮雜鳥(niǎo)嘌呤等人工堿基，但并不限定于此。

LNA一般是在糖-磷酸骨架中，核糖的2'位的氧原子與4'位的碳原子之間以亞甲基交聯(lián)鍵合的具有兩個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)的核酸。若包含LNA的低聚核苷酸與DNA進(jìn)行退火，則雙鏈的構(gòu)象發(fā)生變化，熱穩(wěn)定性上升。由于LNA與通常的低聚核苷酸相比，對(duì)于核酸的鍵合力較強(qiáng)，所以例如通過(guò)低聚核苷酸的設(shè)計(jì)條件，能夠?qū)崿F(xiàn)更可靠、牢固的雜交。

本發(fā)明的標(biāo)記單鏈核酸是包含具有至少兩個(gè)上述的一對(duì)熒光性原子團(tuán)的標(biāo)記結(jié)構(gòu)的核酸，其結(jié)果是，與例如不包含上述熒光性原子團(tuán)的未標(biāo)記核酸相比，對(duì)于靶的特異性高，有時(shí)雜交變強(qiáng)。即，本發(fā)明的標(biāo)記單鏈核酸例如與基本骨架為相同的堿基序列且為相同的核酸片段長(zhǎng)的未標(biāo)記核酸相比，有時(shí)熔化溫度(Tm值)提高。因此，與上述未標(biāo)記核酸相比，有時(shí)能夠更牢固地與靶進(jìn)行雜交。因此，在具有這樣的性質(zhì)的本發(fā)明的標(biāo)記單鏈核酸的情況下，例如能夠?qū)崿F(xiàn)高效、特異性高的檢測(cè)。

本發(fā)明的標(biāo)記單鏈核酸由于還具有這樣的特征，所以例如與以往的PNA或LNA等同樣地，可以成為通過(guò)提高Tm值而使擴(kuò)增的特異性提高這樣的應(yīng)用技術(shù)。此外，通過(guò)使本發(fā)明的標(biāo)記引物的基本骨架為PNA或LNA，與未標(biāo)記的PNA或LNA相比，有時(shí)能夠進(jìn)一步提高Tm值，所以有可能能夠更進(jìn)一步提高雜交的效率。特別是如后述那樣，在識(shí)別1個(gè)堿基到幾個(gè)堿基的突變的情況、或檢測(cè)插入、缺失的情況下，通過(guò)使用本發(fā)明的標(biāo)記單鏈核酸(例如也包含標(biāo)記PNA、標(biāo)記LNA等)，能夠?qū)崿F(xiàn)高效、特異性高的檢測(cè)。若將本發(fā)明的標(biāo)記單鏈核酸作為例如引物或探針使用，則根據(jù)對(duì)于靶序列的完全匹配或錯(cuò)配而Tm值的差大，有時(shí)雜交效率不同。因此，有可能1個(gè)堿基識(shí)別等突變的檢測(cè)進(jìn)一步變得容易。此外，本發(fā)明中的標(biāo)記單鏈核酸由于與未標(biāo)記核酸相比Tm值變高，所以還有可能實(shí)現(xiàn)例如與特定區(qū)域牢固地鍵合并將該區(qū)域掩蔽而不成為擴(kuò)增的模板那樣的PCR clamp法、PNA PCR clamp法、LNA PCR clamp法、PNA-LNA PCR clamp法中的作為引物的應(yīng)用。

若示出式(1)所表示的結(jié)構(gòu)的具體例子，則為下式(1-3)～(1-10)所表示的核苷酸結(jié)構(gòu)、或它們的幾何異構(gòu)體、立體異構(gòu)體或作為鹽的結(jié)構(gòu)。

[化學(xué)式40-1]

[化學(xué)式40-2]

[化學(xué)式40-3]

[化學(xué)式40-4]

上述式(1-3)～(1-10)中，n為正整數(shù)。

作為本發(fā)明的標(biāo)記單鏈核酸特別優(yōu)選為具有上述的(1-1)～(1-10)所示的一對(duì)熒光性原子團(tuán)的標(biāo)記單鏈核酸。

接著，本發(fā)明的標(biāo)記單鏈核酸中的一對(duì)熒光性原子團(tuán)的特征在于，

(i)為一個(gè)分子內(nèi)的兩個(gè)平面化學(xué)結(jié)構(gòu)不為同一平面內(nèi)，以某一定的角度而存在，但在該分子與核酸嵌入或進(jìn)行溝槽鍵合(groove binding)時(shí)通過(guò)兩個(gè)平面化學(xué)結(jié)構(gòu)按照在同一平面內(nèi)排列的方式配置而產(chǎn)生熒光發(fā)光的原子團(tuán)，或者

(ii)為由通過(guò)由于兩個(gè)以上的色素分子并列地集合而產(chǎn)生的激子效應(yīng)而不顯示熒光發(fā)光，但在這些分子與核酸嵌入或進(jìn)行溝槽鍵合(groove binding)時(shí)，通過(guò)上述集合狀態(tài)解開(kāi)而產(chǎn)生熒光發(fā)光的兩個(gè)以上的色素分子組構(gòu)成的原子團(tuán)，或者

(iii)在同一分子內(nèi)具有兩個(gè)以上的色素分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)，該化學(xué)結(jié)構(gòu)不會(huì)因用于兩個(gè)以上的色素分子并列地集合而產(chǎn)生的激子效應(yīng)而顯示熒光發(fā)光，但在這些分子嵌入或溝槽鍵合(groove binding)于核酸時(shí)，通過(guò)上述集合狀態(tài)解開(kāi)而產(chǎn)生熒光發(fā)光。

在上述(ii)或(iii)的情況下，上述色素分子優(yōu)選為上述(i)記載的分子。

[標(biāo)記單鏈核酸的合成]

本發(fā)明中的標(biāo)記單鏈核酸可以參照專利文獻(xiàn)1及2中記載的方法來(lái)制備。例如，上述式(1-1)～(1-10)中所示的化合物也可以參照專利文獻(xiàn)1及2中記載的方法來(lái)合成。

作為本發(fā)明的標(biāo)記單鏈核酸的制造中能夠應(yīng)用的制造方法(合成方法)，例如有以下的方法。即，首先，作為DNA的簡(jiǎn)便的標(biāo)記化法，廣泛采用使DNA中的活性氨基與標(biāo)記化劑中的經(jīng)活化的羧基在緩沖溶液中反應(yīng)的方法。該方法特別是能夠應(yīng)用于連接片段或色素的導(dǎo)入。作為氨基的導(dǎo)入法，有利用GLEN RESEARCH公司銷售的氨基修飾亞磷酰胺的方法等。

熟知有以修飾DNA作為基本骨架的核酸的合成方法，例如可以通過(guò)所謂的亞磷酰胺法等來(lái)合成。成為其原料的亞磷酰胺試劑也可以通過(guò)公知的方法簡(jiǎn)便地合成。在本發(fā)明的核酸為DNA、特別是短的低聚DNA的情況下，例如可以利用DNA自動(dòng)合成機(jī)等簡(jiǎn)便地進(jìn)行合成。此外，例如通過(guò)PCR等，還可以合成長(zhǎng)鏈狀的核酸(DNA)等。DNA與色素分子的鍵合部位如上所述沒(méi)有特別限制，例如特別優(yōu)選胸苷的5位。已知從胸苷的5位延長(zhǎng)了各種取代基的核苷酸衍生物的三磷酸利用DNA聚合酶的導(dǎo)入效率比較良好。由此，例如不僅是在本發(fā)明的核酸為短的低聚DNA的情況下，在為長(zhǎng)鏈DNA的情況下也能夠簡(jiǎn)便地合成。

例如，利用了噻唑橙的單鏈DNA即本發(fā)明的熒光引物(標(biāo)記核酸)例如具有以下等優(yōu)點(diǎn)：(1)僅通過(guò)使以DNA自動(dòng)合成機(jī)合成的DNA在緩沖溶液中接觸色素就可以制備，合成容易；(2)通過(guò)使以酶制備的長(zhǎng)鏈DNA與色素反應(yīng)，還能夠制作長(zhǎng)鏈的熒光引物。此外，例如能夠以500nm附近的比較長(zhǎng)波長(zhǎng)的光來(lái)激發(fā)。

本發(fā)明的標(biāo)記單鏈核酸作為用于與靶核酸雜交的探針或用于擴(kuò)增靶核酸的引物使用。

本發(fā)明包含一種靶核酸的檢測(cè)方法，以本發(fā)明的標(biāo)記單鏈核酸作為探針，在可以與靶核酸雜交的條件下，通過(guò)測(cè)定熒光而求出有無(wú)與探針的雜交。可以用于靶核酸的檢測(cè)方法的核酸擴(kuò)增方法具體而言如下。

該核酸擴(kuò)增方法是擴(kuò)增核酸試樣中的靶核酸序列的方法，包含下述(A)工序和下述(B')工序。

(A)準(zhǔn)備上述核酸試樣的工序；

(B')包含下述(B1')工序及(B2')工序的工序；

(B1')使用引物、或包含一對(duì)引物的引物對(duì)，擴(kuò)增核酸試樣中的靶核酸序列的工序，

(B2')進(jìn)行上述(B1')工序中擴(kuò)增的單鏈的核酸序列與由本發(fā)明的標(biāo)記單鏈核酸構(gòu)成的探針的雜交的工序。

由上述本發(fā)明的標(biāo)記單鏈核酸構(gòu)成的探針例如可以為包含至少一個(gè)上述式(16)、(16b)、(17)、或(17b)所表示的結(jié)構(gòu)的探針。

上述的核酸擴(kuò)增方法中的引物及引物對(duì)沒(méi)有特別限制，例如可以根據(jù)目標(biāo)靶核酸序列、核酸擴(kuò)增反應(yīng)的種類等而適當(dāng)設(shè)定。此外，本發(fā)明中的核酸擴(kuò)增方法的種類沒(méi)有特別限制，可列舉出上述那樣的SMAP法或LAMP法等各種等溫?cái)U(kuò)增法或PCR法等，可以與上述第一核酸擴(kuò)增方法同樣地進(jìn)行。

作為探針使用的本發(fā)明的標(biāo)記單鏈核酸的堿基序列可以根據(jù)靶核酸序列而適當(dāng)設(shè)計(jì)，按照在嚴(yán)格的條件下與上述靶核酸雜交的方式設(shè)計(jì)?！皣?yán)格的條件”例如依賴于本發(fā)明的探針與其互補(bǔ)鏈的雙鏈的熔化溫度Tm(℃)、及雜交溶液的鹽濃度等而決定。作為具體例子，可以參照J(rèn).Sambrook,E.F.Frisch,T.Maniatis；Molecular Cloning 2nd edition,Cold Spring Harbor Laboratory(1989)(其全部記載特別地作為公開(kāi)而援引于此)等。

根據(jù)上述的核酸擴(kuò)增方法，由于將本發(fā)明的標(biāo)記單鏈核酸作為探針使用，所以例如僅通過(guò)檢測(cè)核酸擴(kuò)增反應(yīng)液的熒光強(qiáng)度，例如能夠判斷有無(wú)靶核酸序列的擴(kuò)增。這例如基于以下那樣的理由。若探針與互補(bǔ)的核酸序列雜交，則由于形成雙鏈核酸，所以上述標(biāo)記引物的原子團(tuán)(色素)嵌入或溝槽鍵合于上述雙鏈核酸。此時(shí)，由于不產(chǎn)生例如上述那樣的上述原子團(tuán)(色素)的激子效應(yīng)，所以上述原子團(tuán)產(chǎn)生熒光發(fā)光。另一方面，在沒(méi)有雜交的情況下，由于產(chǎn)生激子效應(yīng)，所以上述原子團(tuán)不產(chǎn)生熒光發(fā)光。因此，例如在探針沒(méi)有與通過(guò)核酸擴(kuò)增反應(yīng)而得到的擴(kuò)增產(chǎn)物雜交時(shí)、或沒(méi)有引起擴(kuò)增時(shí)，見(jiàn)不到產(chǎn)生熒光發(fā)光的原子團(tuán)、或者沒(méi)有增加。因此，若檢測(cè)熒光強(qiáng)度，則在增加的情況下，能夠判斷靶核酸序列擴(kuò)增，在未增加的情況下，可以判斷靶核酸序列沒(méi)有擴(kuò)增。特別是本發(fā)明的標(biāo)記單鏈核酸具有以下優(yōu)點(diǎn)：沒(méi)有雜交時(shí)的熒光背景與使用以往的具有激子效應(yīng)的標(biāo)記探針的情況相比，檢測(cè)靈敏度變高。

上述標(biāo)記單鏈核酸探針例如可以在上述(B1')工序的核酸擴(kuò)增反應(yīng)之前添加到反應(yīng)液中，也可以在上述(B1')工序的核酸擴(kuò)增反應(yīng)之后添加到反應(yīng)液中。在前者的情況下，熒光強(qiáng)度的檢測(cè)例如與上述(B1')工序的核酸擴(kuò)增反應(yīng)同時(shí)連續(xù)地或間歇地進(jìn)行，也可以在上述(B1')工序結(jié)束后進(jìn)行。在上述(B1')工序的反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行的情況下，作為背景，優(yōu)選也一并在上述(B1')工序的反應(yīng)開(kāi)始前進(jìn)行檢測(cè)。另一方面，在分別進(jìn)行上述(B1')工序和(B2')工序的情況下，例如優(yōu)選在上述(B1')工序的核酸擴(kuò)增反應(yīng)之后將上述標(biāo)記單鏈核酸探針添加到反應(yīng)液中。這種情況下，熒光強(qiáng)度的檢測(cè)例如在(B1')工序之后進(jìn)行。此時(shí)，作為背景，例如優(yōu)選一并檢測(cè)上述(B1')工序之后、且上述標(biāo)記單鏈核酸探針的添加前或剛添加后的熒光強(qiáng)度。檢測(cè)方法的具體例子如上所述。

(1)本發(fā)明中的標(biāo)記單鏈核酸探針可以以液相的同源分析(使用96孔微板或毛細(xì)管等)來(lái)使用。

(2)本發(fā)明的標(biāo)記單鏈核酸探針可以作為PCR探針使用?？梢宰鳛镈NA擴(kuò)增反應(yīng)中的擴(kuò)增曲線的檢測(cè)(實(shí)時(shí)PCR)、代替TaqMan探針的廉價(jià)的方法應(yīng)用?？梢宰鳛橐锏臉?biāo)記、或內(nèi)部標(biāo)記探針使用。

(3)本發(fā)明的標(biāo)記單鏈核酸探針可以作為DNA芯片中的捕捉探針或標(biāo)記探針使用。為高通量且不需要試劑的系統(tǒng)，不需要標(biāo)記過(guò)程·清洗過(guò)程。能夠大大地避免人為產(chǎn)生的誤差。能夠?qū)崿F(xiàn)玻璃或代替其的固相載體原材料(金、ITO、銅等基板、金剛石或塑料等能夠貼附多檢體的原材料)中的同時(shí)多項(xiàng)目(高通量)的解析。

(4)本發(fā)明的標(biāo)記單鏈核酸探針可以在珠子、纖維、或水凝膠上固定化。能夠在半液體·半固體的環(huán)境下檢測(cè)基因。能夠具有液體那樣的測(cè)定環(huán)境，并且像固體那樣搬運(yùn)。

(5)本發(fā)明的標(biāo)記單鏈核酸探針可以作為印跡(Southern blot、Northern Blot、dot blot等)用的探針使用。能夠使僅目標(biāo)基因片段發(fā)光而進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)本發(fā)明的方法，在雜交操作之后，不需要清洗。

(6)本發(fā)明的標(biāo)記單鏈核酸探針可以作為用于細(xì)胞內(nèi)核酸的檢測(cè)·追蹤的探針使用。由此，能夠進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)的DNA/RNA的時(shí)空間的解析?？梢允褂脽晒怙@微鏡或細(xì)胞分類計(jì)。能夠應(yīng)用于DNA的標(biāo)記、向RNA的轉(zhuǎn)印·剪接的追蹤、RNAi的功能解析等。在本發(fā)明的方法中，由于不需要清洗，所以適于活細(xì)胞的功能追蹤。

(7)本發(fā)明的標(biāo)記單鏈核酸探針可以作為熒光原位雜交(FISH)的探針使用。通過(guò)本發(fā)明的方法，可以進(jìn)行組織的染色等。本發(fā)明的方法中，由于不需要清洗，所以人為產(chǎn)生的誤差小。即，本發(fā)明的標(biāo)記單鏈核酸探針由于作為在沒(méi)有識(shí)別靶生物分子時(shí)不發(fā)出熒光的熒光色素起作用，所以若使用其，則能夠建立不需要復(fù)雜的清洗工序的生物成像。這關(guān)系到高可靠性、低勞力且實(shí)時(shí)的熒光觀測(cè)。

(8)本發(fā)明的標(biāo)記核酸探針由于能夠利用多個(gè)波長(zhǎng)的色素團(tuán)，所以在以1分子水平進(jìn)行檢測(cè)·追蹤時(shí)，能夠容易地構(gòu)筑大大避免這些激發(fā)光的背景光、散射光的波長(zhǎng)的設(shè)計(jì)。例如，在以1分子水平觀測(cè)生物分子的情況下，變成激發(fā)光的泄漏等背景光、散射光擾亂的狀態(tài)，避免此的方法成為各種必須。在這樣的情況下本發(fā)明特別有用。

本發(fā)明的標(biāo)記單鏈核酸探針的熒光強(qiáng)度例如通過(guò)所鍵合的色素部分的激子相互作用的控制，能夠有效地發(fā)生變化。本發(fā)明中，特別是根據(jù)利用激子相互作用的接近，作為on-off探針發(fā)揮功能，所以能夠得到充分高的消光性能。這樣的on-off熒光核苷酸的設(shè)計(jì)例如對(duì)于建立不需要清洗的生物成像分析是非常重要的。利用激子效應(yīng)的探針?biāo)@示的光物理性質(zhì)不僅非常具有特征性，而且適合于用于DNA測(cè)序(序列確定)、基因分型(基因型解析)、DNA結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變的監(jiān)測(cè)及基因表達(dá)觀測(cè)的新型熒光DNA探針的設(shè)計(jì)。

此外，若將本發(fā)明的標(biāo)記單鏈核酸作為探針使用，則例如通過(guò)對(duì)靶核酸序列進(jìn)行定量，能夠立刻檢測(cè)該序列的擴(kuò)增·分解·蛋白鍵等現(xiàn)象的產(chǎn)生，并且對(duì)這些現(xiàn)象量進(jìn)行定量。該檢測(cè)及定量可以通過(guò)以下的說(shuō)明來(lái)進(jìn)行，該說(shuō)明為例示，并不限定本發(fā)明。即，首先，本發(fā)明的探針(核酸)與上述靶核酸序列以一定的物質(zhì)量比進(jìn)行雜交，形成雙鏈。由于所形成的雙鏈的物質(zhì)量與上述靶核酸序列的物質(zhì)量成正比例，所以通過(guò)測(cè)定上述雙鏈的熒光強(qiáng)度，能夠檢測(cè)靶核酸序列，并且對(duì)其物質(zhì)量進(jìn)行定量。這種情況下，本發(fā)明的標(biāo)記單鏈核酸由于背景的熒光發(fā)光進(jìn)一步得到抑制，所以不會(huì)妨礙上述雙鏈的熒光強(qiáng)度測(cè)定，能夠進(jìn)行更準(zhǔn)確的測(cè)定。

包含一種靶核酸的擴(kuò)增方法，其包含將本發(fā)明的標(biāo)記單鏈核酸作為引物使用，將靶核酸進(jìn)行擴(kuò)增。將本發(fā)明的標(biāo)記單鏈核酸作為引物使用的靶核酸的擴(kuò)增方法可例示出以往公知的各種核酸擴(kuò)增方法，其反應(yīng)形式?jīng)]有任何限制。作為上述核酸擴(kuò)增方法，例如可列舉出等溫?cái)U(kuò)增法、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法等。上述等溫?cái)U(kuò)增法一般是在等溫下進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)的方法。作為這樣的方法，例如可列舉出日本特公平7-114718號(hào)公報(bào)(其全部記載特別地作為公開(kāi)而援引于此)等中公開(kāi)的鏈置換型擴(kuò)增(SDA；strand displacement amplification)法；美國(guó)專利第5824517號(hào)說(shuō)明書(shū)(其全部記載特別地作為公開(kāi)而援引于此)、國(guó)際公開(kāi)第99/09211號(hào)小冊(cè)子(其全部記載特別地作為公開(kāi)而援引于此)或國(guó)際公開(kāi)第95/25180號(hào)小冊(cè)子(其全部記載特別地作為公開(kāi)而援引于此)等中公開(kāi)的改良SDA法；日本專利第2650159號(hào)公報(bào)(其全部記載特別地作為公開(kāi)而援引于此)等中公開(kāi)的核酸序列擴(kuò)增(NASBA；nucleic acid sequence based amplification)法；國(guó)際公開(kāi)第00/28082號(hào)小冊(cè)子(其全部記載特別地作為公開(kāi)而援引于此)等中公開(kāi)的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法(LAMP；Loop-Mediated Isothermal Amplification)法；國(guó)際公開(kāi)第02/16639號(hào)小冊(cè)子(其全部記載特別地作為公開(kāi)而援引于此)等中公開(kāi)的ICAN法(Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids)；自主序列復(fù)制(3SR；self-sustainedsequence replication)法；TMA(transcription-mediated amplification，轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增)法；日本國(guó)專利第2710159號(hào)公報(bào)(其全部記載特別地作為公開(kāi)而援引于此)中公開(kāi)的Qβ復(fù)制酶法；日本國(guó)專利第389726號(hào)公報(bào)(其全部記載特別地作為公開(kāi)而援引于此)、日本專利第3942627號(hào)公報(bào)(其全部記載特別地作為公開(kāi)而援引于此)及NATURE METHODS(Vol.4，No.3，March 2007，pp.257-262)(其全部記載特別地作為公開(kāi)而援引于此)、Mitani Y.,等2007.,Nat.Methods 4(3)：257-262.(其全部記載特別地作為公開(kāi)而援引于此)等中公開(kāi)的方法(以下，稱為“SmartAmp(Smart Amplification Process，智能擴(kuò)增檢測(cè))法”)、Invader法、RCA(rolling cycle amplification，滾環(huán)擴(kuò)增)法等。

實(shí)施例

通過(guò)以下的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步進(jìn)行具體說(shuō)明，但本發(fā)明不受以下的實(shí)施例的限定。

[實(shí)施例1]

導(dǎo)入了噻唑橙(TO)與噻唑粉(TP)的骨架(日文：足場(chǎng))的低聚DNA鏈的合成通過(guò)專利文獻(xiàn)2中記載的酰胺法(例如參照實(shí)施例2)來(lái)進(jìn)行合成。TO的導(dǎo)入通過(guò)在目標(biāo)位置導(dǎo)入NHS-Carboxy-dT后立即與TO2二酰胺反應(yīng)，之后的序列通過(guò)以往那樣的方法來(lái)進(jìn)行合成。從CPG的切出及脫保護(hù)在28％氨水中，在55℃下用4小時(shí)來(lái)進(jìn)行。純化利用裝備有反相(RP-18)柱的HPLC來(lái)進(jìn)行。

[化學(xué)式41]

TO2二酰胺

TO2二酰胺

之后，按照專利文獻(xiàn)1中記載的方法(例如參照實(shí)施例6(在1分子中導(dǎo)入了兩處由噻唑橙衍生的結(jié)構(gòu)的化合物的合成))，使純化而得到的核酸與TP-酯在碳酸氫鈉緩沖液下反應(yīng)，利用裝備有反相(RP-18)柱的HPLC進(jìn)行純化，得到目標(biāo)物。

[化學(xué)式42]

TP-酯

TP-酯

通過(guò)上述方法制備的導(dǎo)入了噻唑橙(TO)和噻唑粉(TP)的低聚DNA鏈(序列號(hào)1(5個(gè)均堿基序列共同))如下。

20-mer.EX16-12TOTP：5'-TGTGZATCtTTCTCTTTCTC-3'

20-mer.EX8-12TOTP：5'-TGTGTATCtTTCZCTTTCTC-3'

20-mer.EX10-12TOTP：5'-TGTGTATCtTZCTCTTTCTC-3'

20-mer.EX14-12TOTP：5'-TGTGTAZCtTTCTCTTTCTC-3'

20-mer.EX18-12TOTP：5'-TGZGTATCtTTCTCTTTCTC-3'

(Z表示TO標(biāo)記的T，t表示TP標(biāo)記的T)

[實(shí)施例2]

(導(dǎo)入了兩個(gè)具有激子效應(yīng)的熒光色素的熒光核酸探針與以往的具有激子效應(yīng)的熒光探針的光譜比較實(shí)驗(yàn))

以噻唑橙的激發(fā)波長(zhǎng)(490nm)進(jìn)行激發(fā)，進(jìn)行光譜的測(cè)定。光譜測(cè)定使用島津公司的熒光測(cè)定裝置(RF5300)來(lái)進(jìn)行。關(guān)于濃度，各熒光探針、及互補(bǔ)鏈(序列號(hào)2)均以1μM、在溫度23℃下進(jìn)行測(cè)定。將結(jié)果示于圖1A～C中。圖1A是使用導(dǎo)入了兩個(gè)具有激子效應(yīng)的熒光色素的熒光核酸探針的情況，圖1B及C是以往的具有激子效應(yīng)的熒光探針的光譜。在圖1A中所示的具有兩個(gè)激子效應(yīng)的情況下，可以確認(rèn)由FRET效果產(chǎn)生的噻唑粉的波長(zhǎng)(601nm)的熒光。此時(shí)，單鏈時(shí)(背景)與雙鏈時(shí)(測(cè)定時(shí))的信號(hào)強(qiáng)度的比(S/N比)為4.6。在導(dǎo)入了兩個(gè)具有激子效應(yīng)的熒光色素的情況下，測(cè)定對(duì)象的波長(zhǎng)的S/N比為4.6，與一個(gè)的情況(圖1B：S/N＝2.1、圖1C：S/N＝1.8)相比良好2倍以上。

這表示，在單鏈的情況下，噻唑橙(533nm)通過(guò)激子效應(yīng)，熒光能量以一定程度失活，但是通過(guò)噻唑粉靠近地存在，受到FRET的效應(yīng)并接收能量，同時(shí)該能量也通過(guò)激子效應(yīng)而失活。

[實(shí)施例3]

導(dǎo)入了兩個(gè)具有激子效應(yīng)的熒光色素的熒光核酸探針的熔化曲線解析使用BioRad公司的實(shí)時(shí)PCR裝置(CFX96)來(lái)進(jìn)行。關(guān)于濃度，各熒光探針、及互補(bǔ)鏈均以1μM、且25μl的容量來(lái)進(jìn)行測(cè)定。一邊從4℃到95℃為止以0.5℃刻度進(jìn)行升溫一邊進(jìn)行測(cè)定。將結(jié)果示于圖2A～E中。圖2中所示的結(jié)果是噻唑橙的熒光的比較(激發(fā)波長(zhǎng)：495nm)。噻唑橙與噻唑粉間的距離適當(dāng)?shù)那闆r下通過(guò)FRET的效應(yīng)，噻唑橙的熒光大大降低。

由圖2A～E的結(jié)果認(rèn)為，在本實(shí)施例中使用的熒光標(biāo)記單鏈核酸(DNA)中，關(guān)于具有兩個(gè)激子效應(yīng)的熒光色素間的距離，間隔的堿基為3個(gè)左右最發(fā)揮FRET的效應(yīng)。獲知過(guò)近(間隔的堿基為一個(gè))或過(guò)遠(yuǎn)(間隔的堿基為5個(gè))的情況下，有時(shí)FRET的效應(yīng)變低。為了得到圖2A～E中所示的熔化曲線解析結(jié)果而使用的各熒光核酸探針的堿基序列如下。

產(chǎn)業(yè)上的可利用性

本發(fā)明在利用熒光標(biāo)記探針或引物的領(lǐng)域是有用的。

序列號(hào)1：實(shí)施例1中合成的低聚DNA鏈(20mer)的堿基序列

序列號(hào)2：實(shí)施例1中合成的低聚DNA鏈(20mer)的互補(bǔ)鏈的堿基序列