并入序列表在文件名“UTFC.P1238WOST25.txt”中所包含的序列表是11KB(如Microsoft中所測量)并且于2015年4月23日創(chuàng)建，其隨同電子投稿一起提交并且以引用的方式并入本文。發(fā)明背景1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明一般涉及醫(yī)學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)以及分子生物學(xué)領(lǐng)域。在某些方面，本發(fā)明的領(lǐng)域涉及免疫療法。更具體地說，本文所述的實施方案涉及嵌合抗原受體(CAR)和CAR-表達(dá)T細(xì)胞的產(chǎn)生，所述T細(xì)胞可特異性地靶向具有升高的靶抗原表達(dá)的細(xì)胞。2.相關(guān)領(lǐng)域的描述臨床級T細(xì)胞的效力可通過將基因療法與免疫療法組合以工程化具有以下優(yōu)良特征的潛力的生物產(chǎn)物而改善：(i)腫瘤相關(guān)抗原(TAA)的識別，(ii)輸注之后的持久性，(iii)遷移到腫瘤部位的潛力，以及(iv)在腫瘤微環(huán)境內(nèi)重復(fù)利用效應(yīng)子功能的能力?；虔煼ㄅc免疫療法的這種組合可重定向T細(xì)胞對于B譜系抗原的特異性并且患有晚期B細(xì)胞惡性腫瘤的患者受益于這種腫瘤特異性T細(xì)胞的輸注(Jena等人,2010；Till等人,2008；Porter等人,2011；Brentjens等人,2011；Cooper等人,2012；Kalos等人,2011；Kochenderfer等人,2010；Kochenderfer等人,2012；Brentjens等人,2013)。遺傳操縱針對人類應(yīng)用工程化的T細(xì)胞的大多數(shù)方法已經(jīng)使用逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒用于嵌合抗原受體(CAR)的穩(wěn)定表達(dá)(Jena等人,2010；Ertl等人,2011；Kohn等人,2011)。此方法，盡管依從當(dāng)前良好的生產(chǎn)規(guī)范(cGMP)，但因其依賴于臨床級重組病毒從有限數(shù)量的生產(chǎn)設(shè)備的制造和釋放而可能較昂貴?；贑ART細(xì)胞的療法的一個缺點是當(dāng)靶抗原也在正常的非患病組織中表達(dá)時脫靶效應(yīng)的潛能。因此，需要新型CART細(xì)胞療法，其提供對患病細(xì)胞的特異性靶向，同時減少對正常組織的副作用。發(fā)明概述本文所述的某些實施方案是基于以下發(fā)現(xiàn)：嵌合抗原受體(CAR)T細(xì)胞可用于靶向過度表達(dá)抗原的細(xì)胞。因此，在一些方面中，CART細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性可僅僅集中在具有高水平的抗原表達(dá)的預(yù)定靶細(xì)胞(例如癌細(xì)胞)，而相對于具有低水平的抗原表達(dá)的細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用減到最小。具體說來，發(fā)現(xiàn)通過使用具有中等水平的靶標(biāo)親和力的CAR，可產(chǎn)生對具有高抗原表達(dá)水平的細(xì)胞具有選擇性細(xì)胞毒性的CART細(xì)胞。不希望受任何具體機(jī)制的約束，所觀察到的作用可歸因于多價抗原與CART細(xì)胞的結(jié)合以促進(jìn)細(xì)胞靶向?；蛘呋蛄硗猓珻AR的表達(dá)水平可在所選擇的CART細(xì)胞中被調(diào)整以便降低細(xì)胞的脫靶細(xì)胞毒性。因此，在第一實施方案中，提供包含靶向抗原的所表達(dá)的CAR的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞(例如，經(jīng)分離的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞)，所述CAR相對于所述抗原具有約5nM至約500nM的Kd。在又一實施方案中，提供一種包含靶向抗原的所表達(dá)的CAR的轉(zhuǎn)基因T細(xì)胞，所述T細(xì)胞僅當(dāng)抗原被T細(xì)胞多價結(jié)合時展現(xiàn)顯著的細(xì)胞毒性活性。一方面，實施方案的經(jīng)分離的細(xì)胞為T細(xì)胞或T細(xì)胞祖細(xì)胞。又一方面，所述細(xì)胞為哺乳動物細(xì)胞，如人細(xì)胞。在又一實施方案中，提供在受試者中選擇性地靶向表達(dá)抗原的細(xì)胞的方法，所述方法包括(a)選擇包含結(jié)合至抗原的所表達(dá)的CAR的CART細(xì)胞，所述CART細(xì)胞具有：(i)只有當(dāng)抗原被T細(xì)胞多價結(jié)合時的細(xì)胞毒性活性；和/或(ii)相對于所述抗原具有約5nM至約500nM的Kd的CAR；以及(b)向所述受試者施用有效量的所選擇的CART細(xì)胞以提供選擇性地靶向具有增加表達(dá)的所述抗原的細(xì)胞的T細(xì)胞應(yīng)答。因此，在某些方面中，實施方案的一種方法進(jìn)一步被定義為一種治療與患病細(xì)胞上的增加水平的抗原表達(dá)有關(guān)的疾病的方法。舉例來說，實施方案的方法可用于治療過度增殖性疾病，如癌癥或自體免疫疾?。换蛴糜谥委煾腥?，如病毒、細(xì)菌或寄生蟲感染。在又一實施方案中，提供在混合細(xì)胞群中選擇性地靶向表達(dá)抗原的細(xì)胞的方法，所述方法包括(a)選擇包含結(jié)合至抗原的所表達(dá)的CAR的CART細(xì)胞，所述CART細(xì)胞具有：(i)只有當(dāng)抗原被T細(xì)胞多價結(jié)合時的細(xì)胞毒性活性；和/或(ii)相對于所述抗原具有約5nM至約500nM的Kd的CAR；以及(b)將混合細(xì)胞群與所選擇的CART細(xì)胞接觸以選擇性地靶向具有增加表達(dá)的抗原的細(xì)胞，所述細(xì)胞群包括表達(dá)不同水平的抗原的細(xì)胞。舉例來說，在某些方面，混合細(xì)胞群包含表達(dá)抗原的非癌細(xì)胞和具有增加表達(dá)的抗原的癌細(xì)胞。在一些方面中，抗原的增加水平可指的是比在被CART細(xì)胞靶向的細(xì)胞中高至少約0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1,000倍的表達(dá)水平。在又一實施方案中，提供選擇CART細(xì)胞的方法，所述方法包括(a)獲得多個表達(dá)結(jié)合至抗原的CAR的CART細(xì)胞，所述多個細(xì)胞包含(i)對抗原具有不同親和力(或?qū)乖哂胁煌Y(jié)合/解離速率)的CAR和/或(ii)在細(xì)胞中以不同水平表達(dá)(即以不同水平存在于細(xì)胞表面上)的CAR；(b)評價細(xì)胞對表達(dá)抗原的對照細(xì)胞和表達(dá)增加水平的抗原的靶細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性；以及(c)選擇對靶細(xì)胞有選擇性細(xì)胞毒性的CART細(xì)胞。在進(jìn)一步的方面中，實施方案的方法進(jìn)一步包括擴(kuò)增和/或儲存所選擇的CART細(xì)胞或所選擇的T細(xì)胞群。在又進(jìn)一步的方面中，實施方案的方法包括用有效量的實施方案的所選擇的CART細(xì)胞治療受試者。在某些方面中，獲得多個CART細(xì)胞可包括生成表達(dá)結(jié)合至抗原的CAR的CART細(xì)胞文庫。舉例來說，CART細(xì)胞文庫可包含CAR中的隨機(jī)或工程化的點突變(例如，由此調(diào)節(jié)CAR的親和力或結(jié)合/解離速率)。另一方面，CART細(xì)胞文庫包含在提供變化的CAR表達(dá)水平的不同啟動子元件的控制下CAR-表達(dá)細(xì)胞。在又一實施方案中，提供包含靶向EGFR抗原的所表達(dá)的CAR的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞(例如，經(jīng)分離的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞)，所述CAR具有尼妥珠單抗的CDR序列(參見，例如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2)或西妥昔單抗的CDR序列(參見，例如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4)。在一些方面中，實施方案的細(xì)胞為包含所表達(dá)的CAR序列的人T細(xì)胞，所述CAR序列具有SEQIDNO:1和SEQIDNO:2的CDR或抗原結(jié)合部分。在進(jìn)一步的方面中，實施方案的細(xì)胞為包含所表達(dá)的CAR序列的人T細(xì)胞，所述CAR序列具有SEQIDNO:3和SEQIDNO:4的CDR或抗原結(jié)合部分。實施方案的方面涉及由CAR結(jié)合的抗原。在一些方面中，所述抗原是在癌細(xì)胞中、在自體免疫細(xì)胞中或在被病毒、細(xì)菌或寄生蟲感染的細(xì)胞中增加的抗原。在某些方面，所述抗原為CD19、CD20、ROR1、CD22、癌胚抗原、甲胎蛋白、CA-125、5T4、MUC-1、上皮腫瘤抗原、前列腺特異性抗原、黑色素瘤相關(guān)抗原、突變的p53、突變的ras、HER2/Neu、葉酸結(jié)合蛋白、HIV-1包膜糖蛋白gp120、HIV-1包膜糖蛋白gp41、GD2、CD123、CD33、CD138、CD23、CD30、CD56、c-Met、間皮素、GD3、HERV-K、IL-11Rα、κ鏈、λ鏈、CSPG4、ERBB2、EGFRvIII或VEGFR2。在一些特定方面中，所述抗原為GP240、5T4、HER1、CD-33、CD-38、VEGFR-1、VEGFR-2、CEA、FGFR3、IGFBP2、IGF-1R、BAFF-R、TACI、APRIL、Fn14、ERBB2或ERBB3。在一些進(jìn)一步方面中，所述抗原為生長因子受體，如EGFR、ERBB2或ERBB3。實施方案的某些方面涉及一種所選擇的CAR(或包含CAR的所選擇的細(xì)胞)，其結(jié)合至抗原并且相對于所述抗原具有約2nM至約500nM的Kd。舉例來說，在一些方面中，CAR相對于抗原具有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20nM或更大的Kd。在更進(jìn)一步方面中，CAR相對于抗原具有約5nM至約450、400、350、300、250、200、150、100或50nM的Kd。在更進(jìn)一步方面中，CAR相對于抗原具有約5nM至500nM、5nM至200nM、5nM至100nM、或5nM至50nM的Kd。如本文所用，提及“CAR的Kd”可指的是針對用于形成CAR的單克隆抗體所測量的Kd。在一些方面中，實施方案的所選擇的CAR每CAR分子可結(jié)合至2、3、4或更多個抗原分子。在一些方面中，所選擇的CAR的每個抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域相對于抗原具有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20nM或更大的Kd。在更進(jìn)一步方面中，所選擇的CAR的每個抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域相對于抗原具有約5nM至約450、400、350、300、250、200、150、100或50nM的Kd。在更進(jìn)一步方面中，所選擇的CAR的每個抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域相對于抗原具有約5nM至500nM、5nM至200nM、5nM至100nM、或5nM至50nM的Kd。在實施方案的一些方面中，根據(jù)實施方案使用的所選擇的CAR為結(jié)合至EGFR的CAR。例如，CAR可包含尼妥珠單抗的CDR序列。例如，在一些方面中，實施方案的CAR包含尼妥珠單抗的所有六個CDR(提供為SEQIDNO:5-10)。在一些方面中，CAR包含SEQIDNO:1和SEQIDNO:2的抗原結(jié)合部分。在一些方面中，CAR包含與SEQIDNO:1和/或SEQIDNO:2至少約90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的序列。在又一方面中，根據(jù)實施方案使用的CAR不包含尼妥珠單抗的CDR序列。在又一實施方案中，提供經(jīng)分離的細(xì)胞，其包含所選擇的CAR和至少一種第二表達(dá)轉(zhuǎn)基因，如表達(dá)的膜結(jié)合的IL-15。例如，在一些方面中，膜結(jié)合的IL-15包含介于IL-15與IL-15Rα之間的融合蛋白。在一些情況下，所述第二轉(zhuǎn)基因是由RNA或DNA(例如，染色體外或游離型載體)編碼的。在某些方面中，所述細(xì)胞包含編碼整合到細(xì)胞基因組中的膜結(jié)合的IL-15的DNA(例如，側(cè)接有轉(zhuǎn)座子重復(fù)序列的編碼DNA)。在某些方面中，實施方案的細(xì)胞(例如，表達(dá)膜結(jié)合的細(xì)胞因子的人CART細(xì)胞)可用于治療患有疾病的受試者(或在受試者中提供免疫應(yīng)答)，其中患病細(xì)胞表達(dá)增加水平的抗原。在一些方面中，實施方案的方法涉及用編碼所選擇的CAR且在一些情況下編碼轉(zhuǎn)座酶的DNA(或RNA)轉(zhuǎn)染T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方法在本領(lǐng)域中是公知的，但在某些方面中，采用高效轉(zhuǎn)染方法，如電穿孔或病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)。例如，可使用核轉(zhuǎn)染裝置將核酸引入細(xì)胞中。然而，優(yōu)選地，轉(zhuǎn)染步驟不包括用病毒感染或轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞，病毒可引起遺傳毒性和/或在所治療的受試者中產(chǎn)生對含有病毒序列的細(xì)胞的免疫應(yīng)答。實施方案的某些方面涉及用編碼所選CAR的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞。用于CAR的各種各樣的表達(dá)載體是本領(lǐng)域中已知的且在本文中進(jìn)一步詳述。例如，在一些方面中，CAR表達(dá)載體為DNA表達(dá)載體，如質(zhì)粒、線性表達(dá)載體或游離體。在某些方面中，所述載體包含額外的序列，如促進(jìn)CAR表達(dá)的序列，如啟動子、增強(qiáng)子、聚-A信號和/或一個或多個內(nèi)含子。在優(yōu)選方面中，CAR編碼序列側(cè)接有轉(zhuǎn)座子序列，以便轉(zhuǎn)座酶的存在使編碼序列整合到轉(zhuǎn)染細(xì)胞的基因組中。如上所詳述，在某些方面中，細(xì)胞進(jìn)一步被轉(zhuǎn)座酶轉(zhuǎn)染，所述轉(zhuǎn)座酶促進(jìn)CAR編碼序列整合到所轉(zhuǎn)染細(xì)胞的基因組中。在一些方面中，轉(zhuǎn)座酶被提供為DNA表達(dá)載體。然而，在優(yōu)選方面中，轉(zhuǎn)座酶被提供為可表達(dá)的RNA或蛋白質(zhì)以使得轉(zhuǎn)座酶的長期表達(dá)不在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中發(fā)生?？筛鶕?jù)實施方案使用任何轉(zhuǎn)座酶系統(tǒng)。然而，在一些方面中，轉(zhuǎn)座酶是鮭魚型Tc1樣轉(zhuǎn)座酶(SB)。舉例來說，轉(zhuǎn)座酶可為“睡美人(Sleepingbeauty)”轉(zhuǎn)座酶，參見，例如美國專利6,489,458，其以引用的方式并入本文。在更進(jìn)一步方面中，實施方案的所選擇的CART細(xì)胞還包含表達(dá)載體，用于表達(dá)刺激T細(xì)胞增殖的膜結(jié)合的細(xì)胞因子。具體說來，包含這種細(xì)胞因子的所選擇的CART細(xì)胞可在幾乎沒有或沒有離體培養(yǎng)下在抗原呈遞細(xì)胞下增殖，由于通過細(xì)胞因子表達(dá)所提供的模擬。同樣，這種CART細(xì)胞可在體內(nèi)增殖，即使當(dāng)由CAR識別的大量抗原不存在時(例如，象在處于緩解中的癌癥患者或患有最小殘留疾病的患者的情形下)。在一些方面中，CART細(xì)胞包含DNA或RNA表達(dá)載體用于表達(dá)Cγ細(xì)胞因子和元件(例如，跨膜結(jié)構(gòu)域)以提供細(xì)胞因子的表面表達(dá)。舉例來說，CAR細(xì)胞可包含IL-7、IL-15或IL-21的膜結(jié)合形式。在一些方面中，細(xì)胞因子通過細(xì)胞因子編碼序列與細(xì)胞因子受體的融合連接至膜。例如，細(xì)胞可包含用于表達(dá)IL-15-IL-15Rα融合蛋白的載體。在更進(jìn)一步方面中，編碼膜結(jié)合Cγ細(xì)胞因子的載體為DNA表達(dá)載體，如整合到CAR細(xì)胞基因組中的載體或染色體外載體(例如，游離型載體)。在更進(jìn)一步方面中，膜結(jié)合的Cγ細(xì)胞因子的表達(dá)是在誘導(dǎo)型啟動子(例如，藥物誘導(dǎo)型啟動子)的控制下以便細(xì)胞因子在CAR細(xì)胞中的表達(dá)(及由此CAR細(xì)胞的增殖)可通過誘導(dǎo)或抑制啟動子活性受到控制。實施方案的方面涉及獲得T細(xì)胞或T細(xì)胞祖細(xì)胞用于表達(dá)所選擇的CAR。在一些方面中，細(xì)胞是從第三方(如組織庫)獲得。在進(jìn)一步方面中，使用來自包含T細(xì)胞或T細(xì)胞祖細(xì)胞的患者的細(xì)胞樣品。舉例來說，在一些情況下，樣品是臍帶血樣品、外周血樣品(例如，單核細(xì)胞部分)或來自包含多能細(xì)胞的受試者的樣品。在一些方面中，可培養(yǎng)來自受試者的樣品以生成誘導(dǎo)的多能干(iPS)細(xì)胞以及用于產(chǎn)生T細(xì)胞的這些細(xì)胞。細(xì)胞樣品可直接從受試者培養(yǎng)或可在使用之前冷凍保存。在一些方面中，獲得細(xì)胞樣品包括收集細(xì)胞樣品。在其他方面中，樣品是由第三方獲得。在更進(jìn)一步方面中，來自受試者的樣品可被處理以純化或富集樣品中的T細(xì)胞或T細(xì)胞祖細(xì)胞。舉例來說，樣品可經(jīng)受梯度純化、細(xì)胞培養(yǎng)選擇和/或細(xì)胞分選(例如，經(jīng)由熒光激活細(xì)胞分選(FACS))。在一些方面中，實施方案的一種方法進(jìn)一步包括獲得、產(chǎn)生或使用抗原呈遞細(xì)胞(APC)。舉例來說，在一些方面中，抗原呈遞細(xì)胞包括樹突細(xì)胞，如表達(dá)或已加載目標(biāo)抗原的樹突細(xì)胞。在進(jìn)一步方面中，抗原呈遞細(xì)胞可包括呈現(xiàn)目標(biāo)抗原的人工抗原呈遞細(xì)胞。例如，人工抗原呈遞細(xì)胞可以是滅活的(例如輻照的)人工抗原呈遞細(xì)胞(aAPC)。用于產(chǎn)生這種aAPC的方法在本領(lǐng)域中是已知的且在本文中進(jìn)一步詳述。因此，在一些方面中，實施方案的轉(zhuǎn)基因CAR細(xì)胞與抗原呈遞細(xì)胞(例如滅活的aAPC)離體共培養(yǎng)一段受限的時間以便擴(kuò)增CAR細(xì)胞群。CAR細(xì)胞與抗原呈遞細(xì)胞共培養(yǎng)的步驟可在包含例如白介素-21(IL-21)和/或白介素-2(IL-2)的培養(yǎng)基中完成。在一些方面中，共培養(yǎng)是在約10:1至約1:10；約3:1至約1:5；或約1:1至約1:3的CAR細(xì)胞與APC的比率下進(jìn)行。例如，CAR細(xì)胞與APC的共培養(yǎng)可在約1:1、約1:2或約1:3的比率下。在一些方面中，用于所選擇的CAR細(xì)胞的培養(yǎng)的APC被工程化以表達(dá)特定多肽，以增強(qiáng)CAR細(xì)胞的生長。例如，APC可包含(i)由轉(zhuǎn)基因CAR細(xì)胞上表達(dá)的CAR靶向的抗原；(ii)CD64；(ii)CD86；(iii)CD137L；和/或(v)在APC表面上表達(dá)的膜結(jié)合的IL-15。在一些方面中，APC包含在APC的表面上表達(dá)的CAR結(jié)合抗體或其片段(參見，例如國際PCT專利公開WO/2014/190273，其以引用的方式并入本文)。優(yōu)選地，對本發(fā)明方法中使用的APC進(jìn)行測試并證實其不含感染性材料和/或經(jīng)測試和證實是滅活的和非增殖的。雖然APC的擴(kuò)增可增加培養(yǎng)中的CAR細(xì)胞的數(shù)量或濃度，但此過程是勞動密集的且花費多的。此外，在一些方面中，應(yīng)在盡可能短的時間內(nèi)用轉(zhuǎn)基因CAR細(xì)胞重新輸注需要療法的受試者。因此，在一些方面中，所選擇的CAR細(xì)胞的離體培養(yǎng)不超過14天、不超過7天或不超過3天。例如，離體培養(yǎng)(例如，在APC存在下的培養(yǎng))可進(jìn)行持續(xù)轉(zhuǎn)基因CAR細(xì)胞的小于一個群倍增。在更進(jìn)一步方面中，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞不在APC存在下離體培養(yǎng)。在更進(jìn)一步方面中，實施方案的一種方法包括在向群體施用細(xì)胞或?qū)⒓?xì)胞與群體接觸之前(例如，在細(xì)胞轉(zhuǎn)染之后或在細(xì)胞離體擴(kuò)增之后)富集所選擇的CAR表達(dá)T細(xì)胞的細(xì)胞群的步驟。例如，富集步驟可包括例如通過使用由CAR或CAR結(jié)合抗體結(jié)合的抗原對細(xì)胞進(jìn)行分選(例如，經(jīng)由熒光激活細(xì)胞分選(FACS))。在更進(jìn)一步方面中，富集步驟包括非T細(xì)胞的耗竭或缺乏CAR表達(dá)的細(xì)胞的耗竭。例如，培養(yǎng)群中的CD56+細(xì)胞可耗竭。在又進(jìn)一步方面中，當(dāng)向受試者施用細(xì)胞時CAR細(xì)胞的樣品被保留(或保持培養(yǎng))。例如，樣品可冷凍保存以用于后面的擴(kuò)增或分析。在某些方面中，實施方案的轉(zhuǎn)基因CAR細(xì)胞是滅活的以用于表達(dá)內(nèi)源性T細(xì)胞受體和/或內(nèi)源性HLA。例如，T細(xì)胞可被工程化以消除內(nèi)源性α/βT細(xì)胞受體(TCR)的表達(dá)。在特定的實施方案中，對CAR+T細(xì)胞進(jìn)行遺傳修飾以消除TCR的表達(dá)。在一些方面中，在CAR表達(dá)T細(xì)胞中存在內(nèi)源性T細(xì)胞受體的破環(huán)。例如，在一些情況下，使用鋅指核酸酶(ZFN)或CRISPR/Cas9系統(tǒng)使內(nèi)源性TCR(例如，α/β或γ/δTCR)缺失或滅活。在某些方面中，CAR表達(dá)T細(xì)胞中的T細(xì)胞受體αβ-鏈例如通過使用鋅指核酸酶被敲除。如本文中進(jìn)一步詳述，實施方案的CAR細(xì)胞可用于治療各種各樣的疾病和病狀。基本上涉及特定抗原的增強(qiáng)表達(dá)的任何疾病都可通過CAR細(xì)胞靶向抗原來治療。例如，自體免疫疾病、感染以及癌癥可用實施方案的方法和/或組合物治療。這些包括癌癥，如原發(fā)性、轉(zhuǎn)移性、復(fù)發(fā)性、療法敏感性、療法難治性癌癥(例如，化學(xué)難治性癌癥)。所述癌癥可為血液、肺、腦、結(jié)腸、前列腺、乳腺、肝臟、腎臟、胃、子宮頸、卵巢、睪丸、腦垂體、食道、脾、皮膚、骨骼等等(例如，B細(xì)胞淋巴瘤或黑色素瘤)。在某些方面中，實施方案的一種方法進(jìn)一步被定義為治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤(如彌漫性內(nèi)生性腦橋膠質(zhì)瘤)的方法。在癌癥治療的情況下，CAR細(xì)胞通常靶向癌細(xì)胞抗原(也稱為腫瘤相關(guān)抗原(TAA))，如EGFR。實施方案的方法可用于制造(例如，用于臨床試驗)各種腫瘤抗原(例如，CD19、ROR1、CD56、EGFR、CD123、c-met、GD2)的CAR+T細(xì)胞。使用此項技術(shù)生成的CAR+T細(xì)胞可用于治療患有白血病(AML、ALL、CML)、感染和/或?qū)嶓w腫瘤的患者。例如，實施方案的方法可用于治療細(xì)胞增殖性疾病、真菌、病毒、細(xì)菌或寄生蟲感染。可靶向的病原體包括但不限于瘧原蟲、錐蟲、曲霉、念珠菌、HSV、RSV、EBV、CMV、JC病毒、BK病毒或埃博拉病原體?？捎蓪嵤┓桨傅腃AR細(xì)胞靶向的抗原的其他實例包括但不限于CD19、CD20、癌胚抗原、甲胎蛋白、CA-125、5T4、MUC-1、上皮腫瘤抗原、黑色素瘤相關(guān)抗原、突變的p53、突變的ras、HER2/Neu、ERBB2、葉酸結(jié)合蛋白、HIV-1包膜糖蛋白gp120、HIV-1包膜糖蛋白gp41、GD2、CD123、CD23、CD30、CD56、c-Met、間皮素、GD3、HERV-K、IL-11Rα、κ鏈、λ鏈、CSPG4、ERBB2、EGFRvIII或VEGFR2。在某些方面中，實施方案的方法涉及CD19或HERV-K表達(dá)細(xì)胞的靶向。例如，靶向HERV-K的CAR細(xì)胞可包含含有單克隆抗體6H5的scFv序列的CAR。在更進(jìn)一步方面中，實施方案的CAR可與細(xì)胞因子如IL-2、IL-7、IL-15、IL-21或其組合綴合或融合。在一些實施方案中，提供用于治療具有醫(yī)學(xué)病狀的個體的方法，所述方法包括向受試者提供有效量的來自表達(dá)T細(xì)胞或T細(xì)胞祖細(xì)胞的CAR(例如，表達(dá)選擇性地殺傷具有增加表達(dá)水平的靶抗原的細(xì)胞的T細(xì)胞的CAR)群的細(xì)胞的步驟。在一些方面中，可向個體施用細(xì)胞一次以上(例如，2、3、4、5或更多次)。在進(jìn)一步的方面中，相隔至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多天向個體施用細(xì)胞。在特定的實施方案中，所述個體患有癌癥，如淋巴瘤、白血病、非何杰金氏淋巴瘤、急性淋巴母細(xì)胞性白血病、慢性成淋巴細(xì)胞性白血病、慢性淋巴細(xì)胞性白血病或B細(xì)胞相關(guān)的自體免疫疾病。在又一實施方案中，提供一種包含靶向EGFR的所表達(dá)的CAR的經(jīng)分離的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞(例如，T細(xì)胞或T細(xì)胞祖細(xì)胞)。例如，CAR可包含尼妥珠單抗的CDR序列。例如，在一些方面中，實施方案的細(xì)胞包含CAR，所述CAR包含尼妥珠單抗的所有六個CDR(提供為SEQIDNO:5-10)。在一些方面中，CAR包含SEQIDNO:1和SEQIDNO:2的抗原結(jié)合部分。在進(jìn)一步的方面中，CAR包含與SEQIDNO:1和/或SEQIDNO:2至少約90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的序列。在更進(jìn)一步的方面中，實施方案的細(xì)胞包含不含尼妥珠單抗的CDR序列的CAR。在一些方面中，提供一種藥物組合物，其包含實施方案的經(jīng)分離的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。在進(jìn)一步相關(guān)的實施方案中，提供一種治療患有EGFR陽性癌癥的受試者的方法，所述方法包括向受試者施用有效量的轉(zhuǎn)基因人T細(xì)胞，所述T細(xì)胞包含靶向EGFR并包含SEQIDNO:5-10的CDR序列的所表達(dá)的CAR。在又一實施方案中，提供一種包括表達(dá)的CAR的經(jīng)分離的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞(例如，T細(xì)胞或T細(xì)胞祖細(xì)胞)，所表達(dá)的CAR包含西妥昔單抗的CDR序列。例如，在一些方面中，實施方案的細(xì)胞包含一種CAR，所述CAR包含西妥昔單抗的所有六個CDR(提供為SEQIDNO:11-16)。在一些方面中，CAR包含SEQIDNO:3和SEQIDNO:4的抗原結(jié)合部分。在進(jìn)一步的方面中，CAR包含與SEQIDNO:3和/或SEQIDNO:4至少約90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的序列。在更進(jìn)一步的方面中，實施方案的細(xì)胞包含不含西妥昔單抗的CDR序列的CAR。在一些方面中，提供一種藥物組合物，其包含實施方案的經(jīng)分離的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞。在進(jìn)一步相關(guān)的實施方案中，提供一種治療患有EGFR陽性癌癥的受試者的方法，所述方法包括向受試者施用有效量的轉(zhuǎn)基因人T細(xì)胞，所述T細(xì)胞包含靶向EGFR并包含SEQIDNO:11-16的CDR序列的所表達(dá)的CAR。如本文所用，在說明書和權(quán)利要求書中，“一(a)”或“一個(an)”可意指一個或多個。如本文說明書和權(quán)利要求書中所用，當(dāng)詞“一個”與詞“包含”連接使用時，可意指一個或一個以上。如本文說明書和權(quán)利要求書中所用，“另一”或“又一”可意指至少第二或更多。如本文說明書和權(quán)利要求書中所用，術(shù)語“大約”用來說明這樣的值，其包括裝置和用來測定所述值的方法的誤差的固有變化，或者研究受試者之間存在的變化。本發(fā)明的其他目標(biāo)、特征及優(yōu)點將由以下詳細(xì)說明顯而易見。然而，應(yīng)當(dāng)理解詳細(xì)說明和具體實施例僅以例舉的方式給出，這是因為對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言，根據(jù)這一詳細(xì)說明，本發(fā)明主旨和范圍內(nèi)的各種改變和修改將變得顯而易見。附圖簡述圖1A-B.用加載有抗CD3的人工抗原呈遞細(xì)胞數(shù)值擴(kuò)增人原代T細(xì)胞。(A)加載K562克隆4的表型以表達(dá)抗CD3(OKT3)并且通過流式細(xì)胞術(shù)所測量，輻照至100戈瑞。(B)在用低密度的OKT3加載的aAPC(10個T細(xì)胞比1個aAPC)或高密度的OKT3加載的K562(1個T細(xì)胞比2個aAPC)刺激之后CD3+T細(xì)胞的數(shù)值擴(kuò)增。通過刺激周期之后的擴(kuò)增倍數(shù)乘以刺激周期之前的T細(xì)胞總數(shù)來計算推斷的細(xì)胞計數(shù)。數(shù)據(jù)表示為平均值±SD，n＝6，****p<0.0001，雙因素ANOVA(Tukey氏事后檢驗(Tukey’spost-test))。圖2A-D.在低密度aAPC上擴(kuò)增的T細(xì)胞含有更高比率的CD8+T細(xì)胞。(A)用低密度aAPC(10個T細(xì)胞比1個aAPC)擴(kuò)增的T細(xì)胞含有比用高密度aAPC(1個T細(xì)胞比2個aAPC)擴(kuò)增的T細(xì)胞顯著更多的CD8+T細(xì)胞和顯著更少的CD4+T細(xì)胞，如兩個刺激周期之后通過流式細(xì)胞術(shù)所測量。數(shù)據(jù)表示為平均值，n＝6，***p<0.001，****p<0.0001，雙因素ANOVA(Tukey氏事后檢驗)。(B)在用低密度aAPC和高密度aAPC擴(kuò)增的T細(xì)胞中CD4/CD8比率的差異歸因于當(dāng)用低密度aAPC擴(kuò)增時CD4+T細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)的減小。數(shù)據(jù)表示為平均值±SD，n＝6，****p<0.0001，雙因素ANOVA(Tukey氏后檢驗)。(C)在用低密度aAPC和高密度aAPC擴(kuò)增的T細(xì)胞中CD4/CD8比率的差異不歸因于細(xì)胞存活力的差異。細(xì)胞存活力通過在兩個刺激周期之后針對膜聯(lián)蛋白V和PI染色的流式細(xì)胞術(shù)來測定，其中膜聯(lián)蛋白VnegPIneg細(xì)胞被視為活細(xì)胞。數(shù)據(jù)表示為平均值±SD，n＝3。(D)當(dāng)刺激為低密度aAPC時CD4+T細(xì)胞比高密度aAPC具有更少增殖。通過細(xì)胞內(nèi)流式細(xì)胞術(shù)測量Ki-67作為兩個刺激周期之后細(xì)胞增殖的標(biāo)記物。示出了來自三個獨立供體的代表性直方圖。圖3.在用低或高密度aAPC刺激的T細(xì)胞中的差異基因表達(dá)。在兩個刺激周期之后通過mRNA物質(zhì)的多元數(shù)字分布(multiplexeddigitalprofiling)測量用低或高密度aAPC刺激的CD4+與CD8+T細(xì)胞之間的差異基因表達(dá)。顯著上調(diào)或下調(diào)的轉(zhuǎn)錄物通過在2/3供體中在轉(zhuǎn)錄水平上大于1.5倍差異和p<0.01來確定。數(shù)據(jù)由倍數(shù)差異的熱圖表示，n＝3。圖4A-C.用低密度aAPC擴(kuò)增的T細(xì)胞具有更多的中央記憶表型T細(xì)胞。(A)用低密度或高密度aAPC擴(kuò)增的T細(xì)胞的記憶標(biāo)記物分析通過兩個刺激周期之后針對CCR7和CD45RA的流式細(xì)胞術(shù)來測量。在門控CD4+和CD8+T細(xì)胞群中的細(xì)胞群定義如下：效應(yīng)記憶＝CCR7negCD45RAneg，中央記憶＝CCR7+CD45RAneg,首次用于試驗＝CCR7+CD45RA+，效應(yīng)記憶RA＝CCR7negCD45RA+。數(shù)據(jù)表示為平均值±SD，n＝3，*p<0.05，雙因素ANOVA(Tukey氏事后檢驗)。(B)兩個刺激周期之后在T細(xì)胞中針對粒酶和穿孔素的細(xì)胞內(nèi)染色通過在CD4+和CD8+門控T細(xì)胞群中的流式細(xì)胞術(shù)來測量。數(shù)據(jù)表示為平均值±SD，n＝3，*p<0.05，***p<0.001，雙因素ANOVA(Tukey氏事后檢驗)。(C)在用PMA/離子霉素刺激之后的細(xì)胞因子產(chǎn)生通過兩個刺激周期之后T細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色來測量，所述細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色通過CD4+和CD8+門控T細(xì)胞群中的流式細(xì)胞術(shù)來測量。數(shù)據(jù)表示為平均值±SD，n＝3，*p<0.05，***p<0.001，雙因素ANOVA(Tukey氏事后檢驗)。圖5.T細(xì)胞在aAPC上數(shù)值擴(kuò)增之后TCRVα的多樣性。在用低或高密度aAPC擴(kuò)增的T細(xì)胞中TCRVα的多樣性通過mRNA物質(zhì)的數(shù)字多元分布來測量并且每個TCRVα的相對豐度被計算為總TCRVα轉(zhuǎn)錄物的百分比。數(shù)據(jù)表示為平均值±SD，n＝3。圖6.T細(xì)胞在aAPC上數(shù)值擴(kuò)增之后TCRVβ的多樣性。在用低或高密度aAPC擴(kuò)增的T細(xì)胞中TCRVβ的多樣性在分選的CD4+和CD8+T細(xì)胞中通過mRNA物質(zhì)的數(shù)字多元分布來測量并且每個TCRVα的相對豐度被計算為總TCRVα轉(zhuǎn)錄物的百分比。數(shù)據(jù)表示為平均值±SD，n＝3。圖7.在aAPC上數(shù)值擴(kuò)增之后CDR3序列的多樣性。TCRVβ鏈的CDR3序列通過在ImmunoSEQ平臺上的高通量序列來測定。將在數(shù)值擴(kuò)增之前每個單一序列的數(shù)目相對于用低密度(10個T細(xì)胞比1個aAPC)或高密度(1個T細(xì)胞比2個aAPC)aAPC數(shù)值擴(kuò)增之后同一序列的數(shù)目進(jìn)行繪圖。將數(shù)據(jù)用線性回歸擬合并測定斜率。數(shù)據(jù)代表兩個個體供體。圖8A-D.RNA向用aAPC數(shù)值擴(kuò)增的T細(xì)胞轉(zhuǎn)移的優(yōu)化。(A)用aAPC擴(kuò)增之后GFPRNA的表達(dá)和用各種工序電穿孔的T細(xì)胞的存活力。GFP的中值熒光強(qiáng)度通過流式細(xì)胞術(shù)測定。通過PI染色和流式細(xì)胞術(shù)測定存活力。數(shù)據(jù)代表兩個個體供體。(B)在一個、兩個或三個刺激周期之后在用低密度(10個T細(xì)胞比1個aAPC)aAPC擴(kuò)增的T細(xì)胞中GFPRNA的表達(dá)和細(xì)胞存活力。通過流式細(xì)胞術(shù)測定表達(dá)GFP的T細(xì)胞的百分比。通過PI染色和流式細(xì)胞術(shù)測定存活力。數(shù)據(jù)代表兩個個體供體。(C)在用各種工序電穿孔之后在10個T細(xì)胞比1個aAPC的aAPC密度下刺激持續(xù)兩個刺激周期的T細(xì)胞的GFPRNA的表達(dá)和T細(xì)胞的存活力。通過流式細(xì)胞術(shù)測定表達(dá)GFP的T細(xì)胞的百分比。通過PI染色和流式細(xì)胞術(shù)測定存活力。數(shù)據(jù)代表兩個個體供體。(D)在用10個T細(xì)胞比1個aAPC的密度下的aAPC刺激兩個周期之后，在無RNA的模擬電穿孔和有RNA的電穿孔的CD4+和CD8+門控T細(xì)胞中通過流式細(xì)胞術(shù)測量的記憶標(biāo)記物CCR7和CD45RA的表達(dá)。數(shù)據(jù)表示為平均值±SD，n＝3.圖9A-B.通過DNA和RNA修飾的CAR表達(dá)的示意圖。(A)通過用SB轉(zhuǎn)座子/轉(zhuǎn)座酶電穿孔的T細(xì)胞的DNA修飾。用含有CAR的SB轉(zhuǎn)座子和SB11轉(zhuǎn)座酶電穿孔正常的供體PBMC以在一小部分T細(xì)胞中產(chǎn)生穩(wěn)定的CAR表達(dá)。在IL-21(30ng/mL)和IL-2(50U/mL)存在下用表達(dá)aAPC的γ輻照的抗原的刺激隨時間剔除CAR+T細(xì)胞，在5個刺激周期之后產(chǎn)生>85％CAR+T細(xì)胞并且評估T細(xì)胞的CAR介導(dǎo)的功能。(B)通過RNA電轉(zhuǎn)移的T細(xì)胞修飾。用加載了K562克隆4aAPC的γ輻照的抗CD3(OKT3)刺激正常的供體PBMC。第二刺激之后三至五天，用RNA電穿孔T細(xì)胞以在RNA電轉(zhuǎn)移之后24小時產(chǎn)生>95％CAR+T細(xì)胞，并且評估T細(xì)胞的CAR介導(dǎo)的功能。圖10A-E.通過DNA和RNA修飾的Cetux-CAR+T細(xì)胞的表型。(A)通過在CD4+和CD8+門控T細(xì)胞群中針對CAR的IgG區(qū)的流式細(xì)胞術(shù)測定的在RNA修飾的和DNA修飾的T細(xì)胞中CAR表達(dá)的中值熒光強(qiáng)度。數(shù)據(jù)表示為平均值±SD，n＝8。(B)通過在CAR+門控T細(xì)胞中針對CD4和CD8的流式細(xì)胞術(shù)測定的在RNA和DNA修飾的T細(xì)胞中CD4+和CD8+T細(xì)胞群的比例。數(shù)據(jù)表示為平均值±SD，n＝8。(C)通過在CD4+和CD8+門控T細(xì)胞群中的流式細(xì)胞術(shù)測定的記憶標(biāo)記物CCR7和CD45RA的表達(dá)。記憶群定義如下：效應(yīng)記憶＝CCR7negCD45RAneg，中央記憶＝CCR7+CD45RAneg，首次用于試驗＝CCR7+CD45RA+，效應(yīng)記憶RA＝CCR7negCD45RA+。數(shù)據(jù)表示為平均值±SD，n＝3，****p<0.0001，雙因素ANOVA(Tukey氏事后檢驗)。(D)如通過流式細(xì)胞術(shù)在CD4+和CD8+門控T細(xì)胞群中測定的抑制性受體PD-1和復(fù)制衰老CD57的標(biāo)記物的表達(dá)。數(shù)據(jù)表示為平均值±SD，n＝3，**p<0.01，雙因素ANOVA(Tukey氏事后檢驗)。(E)通過流式細(xì)胞術(shù)，通過CD4+和CD8+門控T細(xì)胞群中的細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色測定的粒酶B和穿孔素的表達(dá)。數(shù)據(jù)表示為平均值±SD，n＝3。圖11A-C.DNA修飾的CAR+T細(xì)胞產(chǎn)生更多細(xì)胞因子并且比RNA修飾的CAR+T細(xì)胞展現(xiàn)稍微增加的細(xì)胞毒性。(A)DNA修飾的(5個刺激周期之后)和RNA修飾的CAR+T細(xì)胞(RNA轉(zhuǎn)移后24小時)的細(xì)胞因子產(chǎn)生是在CD8+門控T細(xì)胞中用靶標(biāo)或PMA/離子霉素4小時培養(yǎng)之后通過細(xì)胞內(nèi)染色和流式細(xì)胞術(shù)來測量。數(shù)據(jù)表示為平均值±SD，n＝3，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001，雙因素ANOVA(Tukey氏事后檢驗)。(B)通過標(biāo)準(zhǔn)的4小時鉻釋放測定來測定DNA修飾的(5個刺激周期之后)和RNA修飾的CAR+T細(xì)胞(RNA轉(zhuǎn)移后24小時)的特異性細(xì)胞毒性。數(shù)據(jù)表示為平均值±SD，n＝3，*p<0.05，雙因素ANOVA(Tukey氏事后檢驗)。(C)相對于CAR的中值熒光強(qiáng)度作圖的在10:1效應(yīng)子:靶標(biāo)比率下RNA修飾的CAR+T細(xì)胞對A431的特異性細(xì)胞毒性。將線性回歸擬合至數(shù)據(jù)，得到斜率＝0.0237±0.030，并不顯著不同于0的斜率，p＝0.4798。圖12A-C.Cetux-CAR通過T細(xì)胞的RNA修飾的瞬時表達(dá)。(A)在沒有細(xì)胞因子或刺激添加到T細(xì)胞中的情況下，通過針對CAR的IgG部分的流式細(xì)胞術(shù)每天測量的CAR表達(dá)。數(shù)據(jù)代表三個獨立的供體。(B)在RNA轉(zhuǎn)移之后24小時添加IL-2(50U/mL)和IL-21(30ng/mL)之后通過針對CAR的IgG部分的流式細(xì)胞術(shù)每天測量的CAR表達(dá)。數(shù)據(jù)代表三個獨立的供體。(C)在RNA轉(zhuǎn)移之后24小時添加tEGFR+EL4細(xì)胞之后通過針對CAR的IgG部分的流式細(xì)胞術(shù)每天測量的CAR表達(dá)。數(shù)據(jù)代表三個獨立的供體。圖13A-C.Cetux-CAR通過RNA修飾的瞬時表達(dá)減少細(xì)胞因子產(chǎn)生和對EGFR-表達(dá)細(xì)胞的細(xì)胞毒性。(A)在用靶細(xì)胞或PMA/離子霉素培養(yǎng)4小時之后，在RNA轉(zhuǎn)移之后24小時和120小時在DNA修飾的和RNA修飾的CD8+T細(xì)胞中通過細(xì)胞內(nèi)染色和流式細(xì)胞術(shù)測量的IFN-γ的產(chǎn)生。數(shù)據(jù)表示為平均值±SD，n＝3，*p<0.05，雙因素ANOVA(Tukey氏事后檢驗)。(B)在RNA轉(zhuǎn)移之后24小時和120小時通過標(biāo)準(zhǔn)鉻釋放測定測量的DNA修飾的和RNA修飾的T細(xì)胞的特異性細(xì)胞毒性。數(shù)據(jù)表示為平均值±SD，n＝3，*p<0.05，**p<0.01，****p<0.0001，雙因素ANOVA(Tukey氏事后檢驗)。(C)在10:1的效應(yīng)子與靶標(biāo)比率下通過標(biāo)準(zhǔn)鉻釋放測定測量的從RNA轉(zhuǎn)移后24小時至RNA轉(zhuǎn)移后120小時DNA修飾的和RNA修飾的T細(xì)胞的特異性細(xì)胞毒性的變化。數(shù)據(jù)表示為平均值±SD，n＝3，*p<0.05，雙因素ANOVA(Tukey氏事后檢驗)。圖14A-D.Cetux-CAR+和Nimo-CAR+T細(xì)胞的數(shù)值擴(kuò)增。(A)通過流式細(xì)胞術(shù)測定的γ輻照的tEGFR+K562克隆27的表型。(B)Cetux-CAR+和Nimo-CAR+T細(xì)胞的數(shù)值擴(kuò)增。在每個刺激周期之前，通過流式細(xì)胞術(shù)測定CD3+CAR+T細(xì)胞的百分比。通過刺激周期之后的擴(kuò)增倍數(shù)乘以所刺激的CAR+T細(xì)胞數(shù)目來計算推斷的細(xì)胞計數(shù)。數(shù)據(jù)表示為平均值±SD，n＝7。(C)在CAR電穿孔之后24小時和在擴(kuò)增28天之后，通過針對CAR的IgG部分的流式細(xì)胞術(shù)測定CAR在CD3+T細(xì)胞中的表達(dá)。數(shù)據(jù)表示為平均值，n＝7。(D)在擴(kuò)增28天之后，通過針對CAR的IgG部分的流式細(xì)胞術(shù)測定CAR表達(dá)的中值熒光強(qiáng)度。數(shù)據(jù)表示為平均值±SD，n＝7。圖15A-C.Cetux-CAR+和Nimo-CAR+T細(xì)胞在表型上相似。(A)在擴(kuò)增28天之后，通過對門控CD3+CAR+細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)測量CD4和CD8T細(xì)胞在總T細(xì)胞群中的比例。數(shù)據(jù)表示為平均值±SD，n＝7。(B,C)在T細(xì)胞擴(kuò)增28天之后，通過在門控CD4+和CD8+T細(xì)胞群中的流式細(xì)胞術(shù)測量T細(xì)胞記憶和分化標(biāo)記物的表達(dá)。數(shù)據(jù)表示為平均值±SD，n＝4。圖16A-F.Cetux-CAR+和Nimo-CAR+T細(xì)胞同樣地經(jīng)由CAR的親和力依賴性觸發(fā)而活化。(A)在EGFR阻斷單克隆抗體存在下響應(yīng)于EGFR+A431的IFN-γ的產(chǎn)生。將CAR+T細(xì)胞與具有抗EGFR阻斷抗體或同種型對照的A431共培養(yǎng)并通過細(xì)胞內(nèi)流式細(xì)胞術(shù)測量IFN-γ產(chǎn)生。產(chǎn)生百分比被計算為相對于未阻斷的CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生在門控CD8+T細(xì)胞中IFN-γ的平均熒光強(qiáng)度。數(shù)據(jù)表示為平均值±SD，n＝3，***p<0.001，雙因素ANOVA(Tukey氏事后檢驗)。(B)相對于抗原陰性細(xì)胞系，tEGFR(上圖)和CAR-L(下圖)在EL4細(xì)胞上的經(jīng)表達(dá)的代表性直方圖。通過定量流式細(xì)胞術(shù)測定EGFR表達(dá)的密度。(C)通過細(xì)胞內(nèi)染色和流式細(xì)胞術(shù)測量在與CD19+、tEGFR+或CARL+EL4細(xì)胞共培養(yǎng)之后在門控CD8+CAR+T細(xì)胞中的IFN-γ產(chǎn)生。數(shù)據(jù)表示為平均值±SD，n＝4，**p<0.01，雙因素ANOVA(Tukey氏事后檢驗)。(D)在與CD19+、EGFR+或CARL+EL4細(xì)胞共培養(yǎng)之后30分鐘在門控CD8+CAR+T細(xì)胞中通過磷酸流式細(xì)胞術(shù)(phosflowcytometry)的p38和Erk1/2的磷酸化。數(shù)據(jù)表示為平均值±SD，n＝2，*p<0.05，雙因素ANOVA(Tukey氏事后檢驗)。(E)通過標(biāo)準(zhǔn)4小時鉻釋放測定測量的CD19+、EGFR+及CARL+EL4細(xì)胞的特異性裂解。數(shù)據(jù)表示為平均值±SD，n＝4，****p<0.0001，雙因素ANOVA(Tukey氏事后檢驗)。(F)在長期共培養(yǎng)中T細(xì)胞與EL4細(xì)胞的相對比例。通過在非物種交叉反應(yīng)性抗體下分別針對人和鼠CD3的流式細(xì)胞術(shù)測量含有T細(xì)胞與EL4細(xì)胞的共培養(yǎng)的級分。數(shù)據(jù)表示為平均值±SD，n＝4，**p<0.01，雙因素ANOVA(Tukey氏事后檢驗)。圖17A-C.NimoCART細(xì)胞的活化和功能應(yīng)答受到EGFR表達(dá)密度的影響。A)通過流式細(xì)胞術(shù)測量的在A431、T98G、LN18、U87及NALM-6細(xì)胞系上的EGFR表達(dá)的代表性直方圖。通過定量流式細(xì)胞術(shù)測定每細(xì)胞的分子數(shù)目。數(shù)據(jù)代表三個重復(fù)實驗。B)通過CD8+細(xì)胞上門控的細(xì)胞內(nèi)流式細(xì)胞術(shù)測量的響應(yīng)于與A431、T98G、LN18、U87及NALM-6細(xì)胞系的共培養(yǎng)的CD8+CAR+T細(xì)胞中的IFN-γ產(chǎn)生。數(shù)據(jù)表示為平均值±SD，n＝4，***p<0.001，雙因素ANOVA(Tukey氏事后檢驗)C.通過標(biāo)準(zhǔn)4小時鉻釋放測定測量的CAR+T細(xì)胞對A431、T98G、LN18、U87及NALM-6的特異性裂解。數(shù)據(jù)表示為平均值±SD，n＝4，****p<0.0001，**p<0.01，*p<0.05，雙因素ANOVA(Tukey氏事后檢驗)。圖18A-E.Nimo-CAR+T細(xì)胞功能的活化與EGFR表達(dá)密度直接并且正相關(guān)。(A)通過流式細(xì)胞術(shù)測量的在四個U87來源的腫瘤細(xì)胞系(U87、U87low、U87med及U87high)系列上的EGFR表達(dá)的代表性直方圖。通過定量流式細(xì)胞術(shù)測定每細(xì)胞的分子數(shù)目。數(shù)據(jù)代表一式三份的實驗。(B)通過磷酸流式細(xì)胞術(shù)測量的與U87或U87high共培養(yǎng)5、45及120分鐘之后在門控CD8+T細(xì)胞中的Erk1/2和p38的磷酸化。數(shù)據(jù)表示為平均熒光強(qiáng)度±SD，n＝2。(C)通過磷酸流式細(xì)胞術(shù)測量的在與具有增加水平的EGFR的U87細(xì)胞系共培養(yǎng)45分鐘之后在門控CD8+T細(xì)胞中的Erk1/2和p38MAP激酶家族成員的磷酸化。數(shù)據(jù)表示為平均熒光強(qiáng)度±SD，n＝4，****p<0.0001，***p<0.001，**p<0.01，雙因素ANOVA(Tukey氏事后檢驗)。(D)通過細(xì)胞內(nèi)染色和流式細(xì)胞術(shù)測量的響應(yīng)于與具有增加水平的EGFR的U87細(xì)胞系共培養(yǎng)的在門控CD8+CAR+T細(xì)胞中IFN-γ和TNF-α的產(chǎn)生。數(shù)據(jù)表示為平均值±SD，n＝4，****p<0.0001，***p<0.001，**p<0.01，雙因素ANOVA(Tukey氏事后檢驗)。(E)通過標(biāo)準(zhǔn)4小時鉻釋放測定測量的CAR+T細(xì)胞對具有增加水平的EGFR的U87細(xì)胞系的特異性裂解。數(shù)據(jù)表示為平均值±SD，n＝5，****p<0.0001，**p<0.01，*p<0.05，雙因素ANOVA(Tukey氏事后檢驗)。圖19A-B.增加相互作用時間不恢復(fù)響應(yīng)于低EGFR密度的Nimo-CAR+T細(xì)胞功能。(A)在CD8+門控細(xì)胞中不同的孵育期之后，在用U87或U87high刺激之后通過細(xì)胞內(nèi)染色和流式細(xì)胞術(shù)測量IFN-γ的產(chǎn)生。數(shù)據(jù)表示為平均值±SD，n＝3。(B)在與Cetux-CAR+或Nimo-CAR+T細(xì)胞共培養(yǎng)之后剩余的U87和U87high細(xì)胞的級分。將U87細(xì)胞系與CAR+T細(xì)胞一式三份在1:5的E:T比率下共培養(yǎng)。將混懸液T細(xì)胞從粘附的靶細(xì)胞中分離，并且通過臺盼藍(lán)排除法對粘附級分進(jìn)行計數(shù)。存活百分比被計算為[共培養(yǎng)之后收獲的細(xì)胞數(shù)目]/[無T細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目]*100。數(shù)據(jù)表示為平均值±SD，n＝3，***p<0.001，雙因素ANOVA(Tukey氏事后檢驗)。圖20A-B.在T細(xì)胞表面上增加的CAR密度不恢復(fù)Nimo-CAR+T細(xì)胞對低密度EGFR的敏感性。A)經(jīng)由SB系統(tǒng)通過RNA轉(zhuǎn)移和傳統(tǒng)的DNA電穿孔修飾的T細(xì)胞中的CAR表達(dá)的代表性直方圖。數(shù)據(jù)代表2個獨立實驗。B)響應(yīng)于低和高抗原密度，通過RNA電轉(zhuǎn)移在過度CAR-表達(dá)T細(xì)胞中IFN-γ的產(chǎn)生。在用U87或U87high靶細(xì)胞刺激之后，在CD8+門控細(xì)胞中通過細(xì)胞內(nèi)流式細(xì)胞術(shù)測量IFN-γ的產(chǎn)生。數(shù)據(jù)表示為平均值±SD，n＝2。圖21A-C.Nimo-CAR+T細(xì)胞響應(yīng)于正常腎上皮細(xì)胞上的基礎(chǔ)EGFR水平與Cetux-CAR+T細(xì)胞相比具有較低的活性。(A)通過流式細(xì)胞術(shù)測量的EGFR在HRCE上的經(jīng)表達(dá)的代表性直方圖。通過定量流式細(xì)胞術(shù)測定每細(xì)胞的分子數(shù)目。數(shù)據(jù)代表三個重復(fù)實驗。(B)通過細(xì)胞內(nèi)染色和CD8+細(xì)胞上門控的流式細(xì)胞術(shù)測量響應(yīng)于與HRCE共培養(yǎng)的CD8+CAR+T細(xì)胞中IFN-γ和TNF-α的產(chǎn)生。數(shù)據(jù)表示為平均值±SD，n＝4，**p<0.01，*p<0.05，雙因素ANOVA(Tukey氏事后檢驗)。(C)通過標(biāo)準(zhǔn)4小時鉻釋放測定測量的CAR+T細(xì)胞對HRCE的特異性裂解。數(shù)據(jù)表示為平均值±SD，n＝3，****p<0.0001，***p<0.001，雙因素ANOVA(Tukey氏事后檢驗)。圖22A-B.Cetux-CAR+T細(xì)胞在刺激之后比Nimo-CAR+T細(xì)胞增殖更少，但不具有增加的AICD傾向。(A)通過對于在CD8+細(xì)胞上門控的Ki-67的細(xì)胞內(nèi)流式細(xì)胞術(shù)測量的用U87或U87high刺激之后的CD8+CAR+T細(xì)胞的增殖。數(shù)據(jù)表示為平均熒光強(qiáng)度±SD，n＝4，**p<0.01，雙因素ANOVA(Tukey氏事后檢驗)。(B)通過對于在CD8+細(xì)胞上門控的膜聯(lián)蛋白V和7-AAD的流式細(xì)胞術(shù)測量的用U87或U87high刺激之后的T細(xì)胞的存活力。通過AnnevinVneg7-AADneg百分比測定活細(xì)胞百分比。數(shù)據(jù)表示為平均值±SD，n＝4，***p<0.001，雙因素ANOVA(Tukey氏事后檢驗)。圖23A-C.Cetux-CAR+T細(xì)胞顯示CAR的增強(qiáng)下調(diào)。(A)通過針對CAR的IgG部分的流式細(xì)胞術(shù)測量的與U87或U87high共培養(yǎng)(E:T1:5)期間CAR的表面表達(dá)。剩余CAR的百分比被計算為[共培養(yǎng)中的CAR+％]/[非刺激培養(yǎng)中的CAR+％]x100。數(shù)據(jù)表示為平均值±SD，n＝3，**p<0.01，*p<0.05，雙因素ANOVA(Tukey氏事后檢驗)。(B)在CD8+門控T細(xì)胞中與U87或U87high共培養(yǎng)24小時之后通過流式細(xì)胞術(shù)測定的CAR的細(xì)胞內(nèi)和表面表達(dá)的代表性直方圖。數(shù)據(jù)代表三個獨立的供體。(C)通過針對CAR的Fc部分的流式細(xì)胞術(shù)測量的與EGFR+EL4或CAR-L+EL4共培養(yǎng)(E:T1:1)期間CAR的表面表達(dá)。剩余CAR的百分比被計算為[共培養(yǎng)中的CAR+％]/[非刺激培養(yǎng)中的CAR+％]x100。數(shù)據(jù)表示為平均值，n＝2，*p<0.05，雙因素ANOVA(Tukey氏事后檢驗)。圖24.Cetux-CAR+T細(xì)胞具有對抗原的重新攻擊的降低應(yīng)答。在用U87或U87high培養(yǎng)24小時之后，將CAR+T細(xì)胞用U87或U87high再次攻擊并且通過細(xì)胞內(nèi)染色和在CD8+細(xì)胞上門控的流式細(xì)胞術(shù)測量IFN-γCAR+T細(xì)胞的產(chǎn)生。數(shù)據(jù)表示為平均值±SD，n＝3，***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05，雙因素ANOVA(Tukey氏事后檢驗)。圖25A-B.動物模型和治療方案的示意圖。(A)導(dǎo)螺桿位置的示意圖。鉆一個1mm孔用于將導(dǎo)螺桿插入右側(cè)額葉中，距離冠狀縫1mm且距離矢狀縫2.5mm。(B)治療方案的時間線。在注入腫瘤之前不少于14天將導(dǎo)螺桿植入小鼠的右側(cè)額葉中，這天被指定為研究第0天。在開始T細(xì)胞治療前一天通過BLI對腫瘤進(jìn)行成像。每周經(jīng)由導(dǎo)螺桿頭顱內(nèi)施用CAR+T細(xì)胞持續(xù)三周。當(dāng)小鼠主動地接受治療時，在T細(xì)胞治療之前和之后通過BLI評價腫瘤生長，然后在剩余實驗期間每周進(jìn)行評價。圖26A-C.在T細(xì)胞治療之前U87med和CAR+T細(xì)胞表型的植入。(A)在腫瘤注入之后四天，在用D-熒光素注入并培養(yǎng)10分鐘之后通過BLI對腫瘤進(jìn)行成像。(B)如通過第4天BLI通量測量所測定，將小鼠分成三組以均勻地分布相對腫瘤負(fù)荷。(C)通過流式細(xì)胞術(shù)就CAR表達(dá)和CD4/CD8比率對經(jīng)由4個刺激周期擴(kuò)增的Cetux-CAR+和Nimo-CAR+T細(xì)胞進(jìn)行評估。圖27A-B.Cetux-CAR+和Nimo-CAR+T細(xì)胞抑制U87med顱內(nèi)異種移植物的生長。(A)連續(xù)的BLI評價腫瘤的相對尺寸。(B)如通過腫瘤的連續(xù)BLI評價相對腫瘤生長。本底發(fā)光(灰色陰影)是由沒有腫瘤的小鼠的BLI來定義。在第18天時，在無治療對比Cetux-CAR+T細(xì)胞(n＝7，p<0.01)治療(n＝7)的小鼠之間和無治療(n＝7)對比Nimo-CAR+T細(xì)胞(n＝7，p<0.05)治療的小鼠之間在BLI中有顯著差異，雙因素ANOVA(Sidak氏事后檢驗)。圖28A-B.用Cetux-CAR+和Nimo-CAR+T細(xì)胞治療的帶有U87med顱內(nèi)異種移植物的小鼠的存活期。(A)在7天T細(xì)胞治療內(nèi)，來自兩個獨立實驗的具有U87med-ffLuc-mKate顱內(nèi)異種移植物的小鼠的存活期。通過Mantel-Cox對數(shù)秩檢驗，p＝0.0006所測定，相對于未治療的小鼠(14/14存活)在Cetux-CAR+T細(xì)胞治療小鼠8/14存活)中的存活明顯減少。(B)接受無治療、Cetux-CAR+T細(xì)胞或Nimo-CAR+T細(xì)胞的具有U87med-ffLuc-mKate顱內(nèi)異種移植物的小鼠的存活期。通過Mantel-Cox對數(shù)秩檢驗，p＝0.0269所測定，在Nimo-CAR+T細(xì)胞治療組中存活期的顯著延長。圖29A-C.在T細(xì)胞治療之前U87和CAR+T細(xì)胞表型的植入。(A)在腫瘤注入之后四天，在用D-熒光素注入并培養(yǎng)10分鐘之后通過BLI對腫瘤進(jìn)行成像。(B)如通過第4天BLI通量測量所測定，將小鼠分成三組以均勻地分布相對腫瘤負(fù)荷。(C)通過流式細(xì)胞術(shù)就CAR表達(dá)和CD4/CD8比率對經(jīng)由4個刺激周期擴(kuò)增的Cetux-CAR+和Nimo-CAR+T細(xì)胞進(jìn)行評估。圖30A-B.Cetux-CAR+，而非Nimo-CAR+T細(xì)胞抑制U87顱內(nèi)異種移植物的生長。(A)連續(xù)的BLI評價腫瘤的相對尺寸。(B)如通過腫瘤的連續(xù)BLI評價相對腫瘤生長。在第25天達(dá)到的在無治療對比Cetux-CAR+T細(xì)胞(n＝6，p<0.01)治療(n＝6)的小鼠之間在BLI中有顯著差異，雙因素ANOVA(Sidak氏事后檢驗)。圖31.用Cetux-CAR+和Nimo-CAR+T細(xì)胞治療的帶有U87顱內(nèi)異種移植物的小鼠的存活期。接受無治療、Cetux-CAR+T細(xì)胞或Nimo-CAR+T細(xì)胞的具有U87-ffLuc-mKate顱內(nèi)異種移植物的小鼠的存活期。通過Mantel-Cox對數(shù)秩檢驗，p＝0.0150所測定，在Cetux-CAR+T細(xì)胞治療組中存活期的顯著延長。圖32.對于CAR+T細(xì)胞療法安全擴(kuò)增抗原庫的策略概述。策略分成三個主要類別：(i)通過藥物誘導(dǎo)的自殺或瞬時CAR表達(dá)限制CAR表達(dá)，(ii)通過將表達(dá)限制在缺氧區(qū)或共表達(dá)歸巢受體使CAR靶向腫瘤部位，以及(iii)通過分裂信號以需要兩個抗原識別腫瘤來限制CAR活化，表達(dá)抑制性CAR以防止正常組織的活化，或表達(dá)通過高抗原密度有條件地活化的CAR。圖33A-F.所構(gòu)建的質(zhì)粒的載體圖。(A)西妥昔單抗來源的CAR轉(zhuǎn)座子。注釋如下：HEF-1α/p：人延長因子-1α的啟動子；BGH：牛生長激素聚腺苷酸化序列；IR/DR：反向重復(fù)/同向重復(fù)；ColE1：最小大腸桿菌復(fù)制起點；Kan/R：卡那霉素抗性基因；Kan/p：卡那霉素抗性基因的啟動子。(B)尼妥珠單抗來源的CAR轉(zhuǎn)座子。注釋如下：HEF-1α/p：人延長因子-1α的啟動子；BGH：牛生長激素聚腺苷酸化序列；IR/DR：反向重復(fù)/同向重復(fù)；ColE1：最小大腸桿菌復(fù)制起點；Kan/R：卡那霉素抗性基因；Kan/p：卡那霉素抗性基因的啟動子。(C)西妥昔單抗來源的CAR/pGEM-A64質(zhì)粒。注釋如下：amp/R：氨芐青霉素抗性基因；SpeI：線性化的限制位點。(D)尼妥珠單抗來源的CAR/pGEM-A64質(zhì)粒。注釋如下：amp/R：氨芐青霉素抗性基因；SpeI：線性化的限制位點。(E)tEGFR-F2A-Neo轉(zhuǎn)座子。注釋如下：HEF-1α/p：人延長因子-1α的啟動子；BGH：牛生長激素聚腺苷酸化序列；F2A：自身可裂解的肽F2A；Neo/r：新霉素抗性基因；IR/DR：反向重復(fù)/同向重復(fù)；ColE1：最小大腸桿菌復(fù)制起點；Kan/R：卡那霉素抗性基因；Kan/p：卡那霉素抗性基因的啟動子。(F)CAR-L轉(zhuǎn)座子。注釋如下：HEF-1α/p：人延長因子-1α的啟動子；ZeocinR：博萊霉素抗性基因；BGH：牛生長激素聚腺苷酸化序列；IR/DR：反向重復(fù)/同向重復(fù)；ColE1：最小大腸桿菌復(fù)制起點；Kan/R：卡那霉素抗性基因；Kan/p：卡那霉素抗性基因的啟動子。圖34.pLVU3G-effLuc-T2A-mKateS158A的載體圖。注釋如下：B1：Gateway供體位點B1；effLuc：增強(qiáng)的螢火蟲熒光素酶；T2A：T2A核糖體滑動位點；mKateS158A：增強(qiáng)的mKate紅色熒光蛋白；B2：Gateway供體位點B2，HBVPRE：乙型肝炎翻譯后調(diào)控元件；HIVSINLTR：HIV自滅活長末端重復(fù)；ampR：氨芐青霉素抗性；LTR：長末端重復(fù)；HIVcPPT：HIV中央多嘌呤段。圖35.用于將MFI與ABC相關(guān)聯(lián)用于定量流式細(xì)胞術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。在用飽和量的抗EGFR-PE培養(yǎng)之后，在流式細(xì)胞儀上獲取具有已知抗體結(jié)合能力的微球珠標(biāo)準(zhǔn)樣品。通過相對于通過流式細(xì)胞術(shù)獲得的平均熒光強(qiáng)度對已知的抗體結(jié)合能力作圖生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。發(fā)明詳述I.實施方案的方面EGFR特異性CAR通過RNA修飾的瞬時表達(dá)已經(jīng)提出了CAR通過RNA轉(zhuǎn)移的瞬時表達(dá)降低針對具有正常組織表達(dá)的抗原的CART細(xì)胞療法的長期、靶標(biāo)上、組織外毒性的可能性。在RNA轉(zhuǎn)移之前T細(xì)胞的數(shù)值擴(kuò)增有望獲得為患者輸注所需的臨床上相關(guān)的T細(xì)胞數(shù)量。本發(fā)明者通過在加載有抗CD3抗體OKT3的aAPC上的共培養(yǎng)探究T細(xì)胞的數(shù)值擴(kuò)增不依賴于抗原特異性。更改培養(yǎng)中的抗原呈遞細(xì)胞(例如aAPC)與T細(xì)胞的比率改變了所生成的T細(xì)胞群的表型。用低密度aAPC(10個T細(xì)胞比1個aAPC)擴(kuò)增的T細(xì)胞相對于用高密度aAPC擴(kuò)增的T細(xì)胞來說與CD8+T細(xì)胞的比例增加、中央記憶表型T細(xì)胞的存在增加、IFN-γ和TNF-α的產(chǎn)生減少而IL-2的產(chǎn)生增加、以及擴(kuò)增之后TCR多樣性的潛在更少克隆損失有關(guān)。用低密度aAPC擴(kuò)增的T細(xì)胞更易于RNA電轉(zhuǎn)移，在電轉(zhuǎn)移之后顯示與用高密度aAPC擴(kuò)增的T細(xì)胞相比RNA轉(zhuǎn)錄物的更多表達(dá)和提高的T細(xì)胞存活力。使用aAPC用于T細(xì)胞擴(kuò)增的潛在益處是借助于粘附分子LFA-3和ICAM-1的表達(dá)形成與T細(xì)胞的穩(wěn)定相互作用的能力(Suhoski等人,2007；Paulos等人,2008)。另外，aAPC可相對容易被修飾以表達(dá)所需系列的共刺激分子。因此，用于數(shù)值T細(xì)胞擴(kuò)增的aAPC提供評估用于T細(xì)胞擴(kuò)增的共刺激分子的各種組合的平臺以實現(xiàn)對于過繼性T細(xì)胞療法的最佳T細(xì)胞表型。除aAPC的修飾之外，本發(fā)明者已經(jīng)描述了在T細(xì)胞培養(yǎng)中aAPC的密度對所生成的T細(xì)胞群的表型的影響。雖然CD8+T細(xì)胞或細(xì)胞毒性T細(xì)胞經(jīng)常被認(rèn)為是用于抗腫瘤免疫療法的理想的T細(xì)胞群，但證據(jù)表明CD8+T細(xì)胞在體內(nèi)需要CD4+T細(xì)胞的幫助以實現(xiàn)最佳抗腫瘤應(yīng)答和記憶形成(Kamphorts等人,2013；Bourgeois等人,2002；Sun等人,20013)。然而，CD4+與CD8+T細(xì)胞的理想比率是未知的(Muranski等人,2009)。通過改變擴(kuò)增培養(yǎng)中的aAPC密度以歪斜(skew)用于過繼性免疫療法的T細(xì)胞中的CD4/CD8比率，不管其是從患者分離的TIL抑或基因修飾的T細(xì)胞，這些問題可在臨床試驗中得到解決。最終，培養(yǎng)中降低的aAPC密度產(chǎn)生比用高密度aAPC擴(kuò)增的T細(xì)胞更多的具有中央記憶表型(CCR7+CD45RAneg)的T細(xì)胞。雖然中央記憶表型T細(xì)胞的持久性增強(qiáng)的益處不能擴(kuò)展至RNA修飾的T細(xì)胞，其僅為腫瘤抗原瞬時重定向，但T細(xì)胞的持久性已顯示改善T細(xì)胞療法的抗腫瘤功效(Kowolik等人,2006；Robbins等人,2004；Stephan等人,2007；Wu等人,2013)。因此，用低密度aAPC的離體擴(kuò)增可用于將穩(wěn)定遺傳修飾的T細(xì)胞或TIL重新編碼成中央記憶表型用于提高持久性。發(fā)現(xiàn)在離體擴(kuò)增的T細(xì)胞中通過RNA修飾的CAR的表達(dá)比通過非病毒DNA修飾和經(jīng)由抗原的CAR識別的T細(xì)胞擴(kuò)增的CAR的表達(dá)更多變。在不同密度下CAR的表達(dá)不影響T細(xì)胞特異性地裂解靶標(biāo)的能力，但是合理地預(yù)期到低于某一閾值，低CAR表達(dá)將對靶標(biāo)的特異性裂解具有負(fù)面影響，如先前所報道(Weijtens等人,2000)。別人已經(jīng)描述了通過T細(xì)胞的RNA修飾的CAR的可調(diào)表達(dá)，以使得RNA的劑量決定轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平(Rabinovich等人,2006；Yoon等人,2009；Barrett等人,2011)。因此，使用相同量的RNA進(jìn)行本研究中T細(xì)胞的RNA修飾，這不說明通過改變RNA劑量的CAR表達(dá)的可變性。反而，很可能供體之間的可變性說明電移轉(zhuǎn)之后CAR表達(dá)強(qiáng)度的差異。目前描述的在RNA轉(zhuǎn)移之前T細(xì)胞擴(kuò)增的方案可在改變來自某些供體的T細(xì)胞對RNA攝取的敏感性中發(fā)揮作用，并且增加電轉(zhuǎn)移中的RNA量可增加這些供體中的CAR表達(dá)。通過轉(zhuǎn)移相對較大量的RNA的CAR的高表達(dá)可產(chǎn)生延長的CAR表達(dá)以及在延長時間段內(nèi)的CAR介導(dǎo)的活性(Barrett等人,2011)。來自RNA轉(zhuǎn)移的延長的CAR表達(dá)可有益于抗腫瘤活性，特別是因為T細(xì)胞的刺激似乎加速CAR表達(dá)的損失。然而，延長CAR的表達(dá)也可響應(yīng)于需要CAR表達(dá)優(yōu)化的正常組織抗原提高T細(xì)胞活性以確定表達(dá)的最佳持續(xù)時間，從而使抗腫瘤活性最大，同時降低正常組織毒性。T細(xì)胞的RNA修飾不改變在RNA的電轉(zhuǎn)移之前離體擴(kuò)增的T細(xì)胞中所見的效應(yīng)記憶與中央記憶T細(xì)胞的比例，類似于先前的報道(Schaft等人,2006)。只有在相對較低aAPC密度(10個T細(xì)胞比1個aAPC)下擴(kuò)增的T細(xì)胞能夠有效RNA轉(zhuǎn)錄攝取，而無明顯毒性，即使是用不同的電穿孔條件。此T細(xì)胞群還顯示相當(dāng)大比例的具有中央記憶表型(CCR7+CD45RAneg)的T細(xì)胞，其具有產(chǎn)生減少的IFN-γ和TNF-α、以及細(xì)胞毒性效應(yīng)分子粒酶B和穿孔素。因此，RNA修飾的T細(xì)胞比DNA修飾的T細(xì)胞含有顯著更多的中央記憶表型T細(xì)胞，顯示響應(yīng)于EGFR-表達(dá)細(xì)胞產(chǎn)生減少的IFN-γ和TNF-α和在低E:T比率下稍微較少的特異性裂解。因此，RNA修飾的前體T細(xì)胞群對RNA轉(zhuǎn)移之后的CAR介導(dǎo)的T細(xì)胞功能具有強(qiáng)大影響并且RNA修飾的T細(xì)胞的減少的細(xì)胞因子產(chǎn)生和稍微較少的特異性裂解可在體內(nèi)模型中轉(zhuǎn)換成降低的抗腫瘤功效，其中T細(xì)胞的細(xì)胞毒性潛能是短暫的并且中央記憶T細(xì)胞群的增加的持久性可能沒有益處。以1個T細(xì)胞比2個aAPC擴(kuò)增的T細(xì)胞的RNA修飾類似于DNA修飾的CAR+T細(xì)胞顯示更顯著比例的效應(yīng)記憶表型T細(xì)胞，且因此需要更高的IFN-γ和TNF-α產(chǎn)生能力。RNA轉(zhuǎn)移之前細(xì)胞因子的添加可改善存活力并且額外的電穿孔工序可有效地將RNA轉(zhuǎn)移到這些T細(xì)胞中。經(jīng)由RNA轉(zhuǎn)移引入T細(xì)胞的Cetux-CAR被瞬時表達(dá)，并且表達(dá)損失通過對T細(xì)胞的刺激(包括添加細(xì)胞因子IL-2和IL-21)以及經(jīng)由添加EGFR-表達(dá)細(xì)胞系的抗原刺激來促進(jìn)。伴隨有CAR表達(dá)的損失，RNA修飾的T細(xì)胞顯示針對EGFR-表達(dá)細(xì)胞系(包括腫瘤細(xì)胞和正常人腎細(xì)胞)的降低的細(xì)胞毒性。使用RNA修飾的T細(xì)胞的一個顧慮在于其對靶腫瘤隨時間的固有降低的能力將相對于穩(wěn)定修飾的T細(xì)胞造成降低的抗腫瘤功效。通過RNA轉(zhuǎn)移被修飾以表達(dá)間皮素特異性CAR用于治療鼠的間皮瘤模型的T細(xì)胞的多次注射表明每兩周的腫瘤內(nèi)注射顯示對腫瘤生長的控制，但在治療停止之后，腫瘤復(fù)發(fā)(Zhao等人,2010)。體內(nèi)播散性白血病鼠模型的治療表明雖然對CD19有特異性的RNA修飾的CAR+T細(xì)胞在單次注射之后具有抗腫瘤活性，但在符合CAR降解的一段時間之后腫瘤經(jīng)常復(fù)發(fā)(Barrett等人,2011)。相比之下，穩(wěn)定表達(dá)間皮素特異性CAR的T細(xì)胞的單次腫瘤內(nèi)注射介導(dǎo)優(yōu)良的抗腫瘤活性并且能夠治愈大多數(shù)小鼠。RNA修飾的T細(xì)胞的優(yōu)化給藥表明在后續(xù)輸注和加權(quán)、分次給藥方案之前消除殘留CARnegT細(xì)胞的環(huán)磷酸酰胺的組合在控制疾病負(fù)擔(dān)上更有效，并且在抗腫瘤功效方面與穩(wěn)定修飾的T細(xì)胞相似(Barrett等人,2013)。因此，優(yōu)化給藥方案可改善RNA修飾的T細(xì)胞的抗腫瘤活性。B.CAR+T細(xì)胞可基于EGFR密度將惡性細(xì)胞與正常細(xì)胞相區(qū)分Cetux-CAR+T細(xì)胞可識別正常組織抗原，其可產(chǎn)生靶標(biāo)上、組織外毒性。因此，本發(fā)明者研究CAR作為RNA物質(zhì)的表達(dá)作為一種經(jīng)由CAR的瞬時表達(dá)控制靶標(biāo)上、組織外毒性的方法。雖然CAR表達(dá)是瞬時的并且降低CAR降解之后針對正常組織EGFR的細(xì)胞毒性的可能性，但其不能解決在CAR的相當(dāng)多的降解之前一旦識別正常組織EGFR之后的即時T細(xì)胞效應(yīng)功能的可能性。另外，通過限制CAR表達(dá)，致使T細(xì)胞在CAR降解之后不響應(yīng)于EGFR-表達(dá)腫瘤，并且持續(xù)的抗腫瘤活性的可能性受到此方法的危害。因此，研究了在正常組織存在下控制CAR活性以限制有害的靶標(biāo)上、組織外毒性而無損抗腫瘤活性的機(jī)制。內(nèi)源性T細(xì)胞活化取決于TCR的親和力和經(jīng)由MHC存在的肽的密度(Hemmer等人,1998；Viola等人,1996；Gottschalk等人,2012；Gottschalk2010)。T細(xì)胞通過經(jīng)由TCR的累積信號超過誘發(fā)效應(yīng)功能所需的某一閾值而活化(Hemmer等人,1998；Rosette等人,2001；Viola等人,1996)。對于高親和力TCR，相對較低的抗原密度足以觸發(fā)T細(xì)胞應(yīng)答；然而，低親和力TCR需要更高抗原密度來實現(xiàn)類似的效應(yīng)T細(xì)胞應(yīng)答(Gottschalk等人,2012)。許多腫瘤在比其正常組織表達(dá)更高的密度下過度表達(dá)TAA(Barker等人,2001；Lacunza等人,2010；Hirsch等人,2009)。EGFR在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的擴(kuò)增和過度表達(dá)突顯了這個關(guān)系，因為EGFR在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中相對于正常組織過度表達(dá)，并且過度表達(dá)與腫瘤分級有關(guān)，由此IV級成膠質(zhì)細(xì)胞瘤表達(dá)最高密度的EGFR(Smith等人,2001；Hu等人,2013；Galanis等人,1998)。因此，本發(fā)明者確定EGFR特異性CAR修飾的T細(xì)胞是否可通過降低CAR的結(jié)合親和力基于EGFR密度將惡性細(xì)胞與正常細(xì)胞相區(qū)分。賦予抗原特異性的Cetux-CAR的部分來源于單克隆抗體西妥昔單抗的scFv部分，其特征是高親和力(Kd＝1.9x10-9)(Talavera等人,2009)。因此，本發(fā)明者由單克隆抗體尼妥珠單抗生成CAR，其與西妥昔單抗共享高度重疊的表位和10倍降低的解離常數(shù)(Kd＝2.1x10-8)，特征為59倍降低的結(jié)合速率(Talavera等人,2009；Garrido等人,2011；Adams等人,Zuckier等人,2000)。降低的結(jié)合速率及隨后減小的總體親和力對EGFR的二價識別提出了要求，只有當(dāng)EGFR以高密度表達(dá)時其才發(fā)生。因此，來源于尼妥珠單抗的CAR可使得T細(xì)胞能夠基于EGFR表達(dá)的密度將惡性組織與正常組織相區(qū)分。最近在CLL和ALL中的臨床成功注意到在具有對CD19-CAR+T細(xì)胞療法的完全腫瘤應(yīng)答的患者中的持續(xù)的B細(xì)胞發(fā)育不全，但此毒性被認(rèn)為是可容忍的，因為CD19是譜系限制性抗原且B細(xì)胞發(fā)育不全在晚期淋巴瘤的情形下被認(rèn)為是可耐受的毒性(Grupp等人,2013；Porter等人,2011)。在用CAR修飾的T細(xì)胞靶向HER2和CAIX的臨床試驗中的嚴(yán)重不良事件突顯了控制針對正常組織抗原表達(dá)的CART細(xì)胞活性的需要以加寬除譜系和腫瘤限制性抗原以外的安全可靶向的抗原的范圍(Lamers等人,2013；Morgan等人,2010)。異常表達(dá)的TAA相對于正常組織經(jīng)常在腫瘤上過度表達(dá)，如在成膠質(zhì)細(xì)胞瘤中的EGFR表達(dá)(Smith等人,2001；Hu等人,2013；Galanis等人,1998)。本發(fā)明者開發(fā)了一種對EGFR有特異性的CAR，其對低抗原密度具有降低的響應(yīng)能力以使對正常組織的可能性減到最小，同時維持響應(yīng)于高抗原密度的充分的效應(yīng)功能。這通過開發(fā)來自尼妥珠單抗的EGFR特異性CAR來實現(xiàn)，尼妥珠單抗是一種與西妥昔單抗相比具有高度重疊表位但降低的結(jié)合動力學(xué)的單克隆抗體(Talavera等人,2009；Garrido等人,2011)。Cetux-CAR+T細(xì)胞能夠靶向低和高EGFR密度，而Nimo-CAR+T細(xì)胞能夠針對抗原密度調(diào)整T細(xì)胞活性并且應(yīng)答取決于在靶細(xì)胞上表達(dá)的EGFR密度。雖然Nimo-CAR+T細(xì)胞顯示在腫瘤細(xì)胞和正常腎細(xì)胞上響應(yīng)于低EGFR密度相對于Cetux-CAR+T細(xì)胞的降低的活性，但其能夠響應(yīng)于高EGFR密度等價重定向特異性與功能。CAR親和力影響抗原攻擊之后的增殖并且Cetux-CAR+T細(xì)胞當(dāng)與抗原攻擊之后的Nimo-CAR+T細(xì)胞相比時顯示削弱的增殖，而不是對活化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡(AICD)的增加的傾向。另外，CAR親和力影響與抗原相互作用之后來自T細(xì)胞表面的CAR的下調(diào)。Cetux-CAR展現(xiàn)在與高EGFR密度相互作用之后比Nimo-CAR更快速和更延長的來自細(xì)胞表面的下調(diào)。Cetux-CAR+T細(xì)胞具有響應(yīng)于抗原的重新攻擊的削弱的能力，這可能是CAR下調(diào)或Cetux-CAR+T細(xì)胞的潛在功能衰竭的結(jié)果(James等人,2010；Lim等人,2002)。在描述scFv對CAR功能的影響中的困難來源于圍繞最佳預(yù)測T細(xì)胞功能的內(nèi)源性TCR結(jié)合的生化參數(shù)的相當(dāng)多的爭論。TCR結(jié)合的動力學(xué)可通過以下方程式來描述：由此解離常數(shù)Kd等于解離速率(koff)與結(jié)合速率(kon)的比率(14)。解離常數(shù)(Kd)和解離速率(koff)兩者都被報道為pepMHC的TCR識別之后的T細(xì)胞功能的重要決定因素，然而，這兩個參數(shù)經(jīng)常強(qiáng)相關(guān)，因此難以分割其對T細(xì)胞功能的相應(yīng)影響(Kersh等人,1998；McKeithanT.W.1995；Nauerth等人,2013)。T細(xì)胞觸發(fā)的動力學(xué)校正模型指出koff影響T細(xì)胞功能，由此需要足夠長的停留時間來觸發(fā)T細(xì)胞信號傳導(dǎo)和活化。已對此進(jìn)行修正以包括最佳停留時間窗，其中延長的停留時間可通過削弱多個TCR由單個pepMHC復(fù)合體連續(xù)觸發(fā)的能力對T細(xì)胞活化不利(Kalergis等人,2001)。然而，這些模型與極短的停留時間相互作用能夠產(chǎn)生功能性T細(xì)胞應(yīng)答的報道相抵觸(Govern等人,2010；Tian等人,2007；Aleksic等人,2010；Gottschalk等人,2012)。最近的分析旨在通過降低Kd與koff值之間的高度相關(guān)性并擴(kuò)大kon值的動態(tài)范圍減小先前的數(shù)據(jù)集偏差，該分析揭示了在kon對T細(xì)胞活化的貢獻(xiàn)中的重要作用，涵蓋在T細(xì)胞觸發(fā)的T細(xì)胞限制模型中，其中T細(xì)胞功能與來源于結(jié)合速率、解離速率以及在其相對膜中的TCR和pepMHC的擴(kuò)散之間的數(shù)學(xué)關(guān)系式的T細(xì)胞限制的持續(xù)時間直接相關(guān)(Tain等人,2007；Aleksic等人,2010)。有趣的是，隨著kon變低，TCR和pepMHC能夠在反彈之前在其相對膜中擴(kuò)散，因此，相互作用的持續(xù)時間縮短至koff值。相反，隨著kon變高，TCR能夠快速反彈以延長停留時間，并且相互作用的持續(xù)時間和所得的T細(xì)胞功能通過Kd最佳預(yù)測。限定控制T細(xì)胞功能親合力的TCR親和力組分的作用的一直以來的爭論對依賴一個結(jié)合生化參數(shù)作為優(yōu)于其他的優(yōu)良功能指標(biāo)的通用模型進(jìn)行提醒。相反，可能是結(jié)合速率與解離速率以及自由移動穿過靶細(xì)胞膜的抗原的密度的組合限定功能應(yīng)答。內(nèi)源性TCR應(yīng)答一般被描述為比單克隆抗體的結(jié)合低得多的親和力，所述單克隆抗體被用于獲得CAR特異性(Stone等人,2009)。然而，用于測量TCR結(jié)合親和力的SPR技術(shù)通常在三維空間中進(jìn)行，并且不概括T細(xì)胞與抗原呈遞細(xì)胞的生理相互作用，其中兩個結(jié)合配偶體被限制在其相應(yīng)的膜中，由于受限的胞間隙和適當(dāng)?shù)姆肿佣ㄏ蚨岣呓Y(jié)合概率(Huppa等人,2010)。在2D中TCR結(jié)合動力學(xué)的測量表明TCR結(jié)合比通過3D測量所提出的具有更高親和力，3D測量的特征為提高的結(jié)合速率和降低的解離速率(Huang等人,2010；Robert等人,2012)。然而，其他配體/受體對如ICAM-1或LFA-1的結(jié)合動力學(xué)不顯示在3D或2D測定中所采集的親和力測量值之間的差異。有趣的是，細(xì)胞骨架聚合的消除將2D中得到的測量值減至3D中得到的測量值，突顯了動態(tài)細(xì)胞和細(xì)胞骨架過程在增加T細(xì)胞與抗原的結(jié)合中的作用(Robert等人,2012)。類似的細(xì)胞骨架相互作用或CAR結(jié)合親和力的提高是否發(fā)生目前并不知道，且因此，不清楚是否關(guān)于CAR的scFv結(jié)構(gòu)域的結(jié)合親和力所進(jìn)行的假設(shè)可直接由3D測定中單克隆抗體親和力的測量值作出。另外，幾個因素有助于提高總體T細(xì)胞結(jié)合親合力，如與MHC的共受體結(jié)合以及在T細(xì)胞活化之前和之后T細(xì)胞表面上的TCR納米團(tuán)簇和微團(tuán)簇形成(Holler等人,2003；Schamel等人,2005；Schamel等人,2013；Kumar等人,2011；Yokosuka等人,2010)。雖然CAR似乎可在T細(xì)胞表面上以低聚形式表達(dá)，但CAR與內(nèi)源性T細(xì)胞信號復(fù)合體的牽連程度尚不清楚。僅通過CD3-ζ信號傳導(dǎo)的第一代CAR的報道顯示需要與內(nèi)源性CD3-ζ結(jié)合來實現(xiàn)CAR依賴性T細(xì)胞活化，而通過跨膜CD28以及細(xì)胞內(nèi)CD28和CD3-ζ信號傳導(dǎo)的第二代CAR顯示當(dāng)內(nèi)源性TCR-CD3復(fù)合體從T細(xì)胞表面開始限制時在CAR依賴性活化能力上無差異(Bridgeman等人,2010；Torikai等人,2012)。因此，CAR與內(nèi)源性TCR信號傳導(dǎo)機(jī)構(gòu)的結(jié)合可取決于CAR構(gòu)型。解決scFv親和力在CAR設(shè)計中的作用的特異性研究受到限制，并且集中于解離常數(shù)Kd的作用。最近關(guān)于ROR1特異性CAR的研究比較得出6倍降低的Kd，由此更高的親和力，這是由提高的kon和降低的koff兩者一起造成，并且顯示更高親和力的ROR-1特異性CAR在體外提高T細(xì)胞功能，包括細(xì)胞因子的產(chǎn)生和特異性裂解，而無AICD的傾向提高(Hudecek等人,2013)。另外，高親和力ROR-1特異性CAR+T細(xì)胞在體內(nèi)介導(dǎo)優(yōu)良的抗腫瘤活性。類似地，Cetux-CAR+T細(xì)胞的更高親和力不增加AICD的傾向，并且響應(yīng)于降低的EGFR密度提高T細(xì)胞功能，包括細(xì)胞因子的產(chǎn)生和特異性裂解。然而，來源于具有寬的Kd值范圍的一組親和力成熟的HER2特異性單克隆抗體的一系列CAR前期研究發(fā)現(xiàn)存在親和力閾值，低于該閾值，CAR依賴性T細(xì)胞活化被削弱；而高于此閾值，響應(yīng)于不同HER2水平的T細(xì)胞的活化在提高的親和力下并不改善(Chmielewski等人,2004)。相比之下，本發(fā)明的研究鑒定高親和力CAR和低親和力CAR基于抗原密度靶向的不同能力。較高親和力的Cetux-CAR+T細(xì)胞與響應(yīng)于降低的EGFR密度相對于Nimo-CAR+T細(xì)胞增加的細(xì)胞因子產(chǎn)生和特異性裂解有關(guān)。雖然Nimo-CAR相對于Cetux-CAR具有降低的親和力，但Nimo-CAR的Kd值高于親和力閾值并且在通過先前研究預(yù)測以具有效應(yīng)功能的范圍內(nèi)。類似于內(nèi)源性TCR的研究，這些結(jié)果表明CAR親和力的描述不應(yīng)僅通過解離常數(shù)來描述，并且支持出于CAR設(shè)計將個體解離速率與結(jié)合速率之間的關(guān)系考慮在內(nèi)。研究之間親和力對CAR功能的影響之間的矛盾可通過構(gòu)成解離常數(shù)Kd的生化參數(shù)koff和kon的獨特關(guān)系來說明。HER2特異性CAR來源于呈現(xiàn)寬的Kd值范圍的抗體，Kd主要在koff上不同，并且有最小的kon值相關(guān)性(Chmielewski等人,2004)。因此，較高親和力相互作用不提高結(jié)合速率，但增加與抗原相互作用的持續(xù)時間。相反，ROR-1特異性CAR和Cetux-CAR的較高親和力都受到提高的結(jié)合速率的影響。用于獲得ROR-1特異性CAR的較高親和力單克隆抗體具有6倍降低的Kd，由提高的kon和降低的koff兩者共同造成，由此較高親和力的特征是提高的結(jié)合速率和增加的相互作用持續(xù)時間(Hudecek等人,2013)。西妥昔單抗與尼妥珠單抗之間在Kd上的10倍差異主要受到西妥昔單抗的kon的59倍增加和koff的5.3x增加的影響，由此西妥昔單抗相對于尼妥珠單抗具有大大提高的結(jié)合速率，但與大多數(shù)的較高親和力相互作用、較短的相互作用持續(xù)時間形成對比(Talavera等人,2009)。因此，在CAR設(shè)計中改變scFv結(jié)構(gòu)域的結(jié)合速率而非解離速率可對T細(xì)胞功能具有更大影響。先前研究已確定，最小CAR密度為T細(xì)胞活化所需，低于該密度，T細(xì)胞活化將被消除(James等人,2010)。然而，足夠高的抗原表達(dá)可削弱此要求并且當(dāng)CAR以低密度表達(dá)時實現(xiàn)CAR依賴性T細(xì)胞活化(James等人,2010)。在研究中使用高和低親和力HER特異性CAR評估CAR表達(dá)密度、抗原密度及CAR親和力之間的相互作用以及對CAR+T細(xì)胞功能的影響。此研究報道，響應(yīng)于低抗原密度具有低CAR密度的T細(xì)胞的降低的T細(xì)胞功能僅當(dāng)T細(xì)胞表達(dá)較高親和力HER2特異性CAR時是明顯的(Turatti等人,2007)。然而，當(dāng)CAR以較高密度表達(dá)時，CAR介導(dǎo)的細(xì)胞毒性與親和力或抗原密度無關(guān)。作者把當(dāng)表達(dá)低密度時高親和力CAR的降低的應(yīng)答歸因于不能誘導(dǎo)連續(xù)觸發(fā)的低HER2密度。雖然據(jù)報道CAR不像內(nèi)源性TCR一樣連續(xù)觸發(fā)(James等人,2010)，但有可能這是CAR特異性的，并且不同的跨膜區(qū)、內(nèi)功能域及scFv親和力都可影響連續(xù)觸發(fā)的能力。本發(fā)明者未觀察到在對低抗原密度的初始響應(yīng)中Cetux-CAR+T細(xì)胞中的任何缺陷，然而，通過對EGFR+aAPC的反復(fù)刺激剔除的CAR表達(dá)水平可針對最佳CAR密度來選擇，其中表達(dá)次優(yōu)水平的CAR的T細(xì)胞未能擴(kuò)增且因此脫離全部組成部分。相比之下，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)降低親和力的Nimo-CAR+T細(xì)胞顯示對低抗原表達(dá)的降低的敏感性，但Nimo-CAR的增加的密度不恢復(fù)Nimo-CAR+T細(xì)胞對低抗原的敏感性，因此其可能通過不同的機(jī)制來控制。雖然CAR在低密度下的表達(dá)可降低對抗原的敏感性，但這不可能是體內(nèi)選擇性地靶向高抗原密度的最佳策略，主要是因為在低密度下表達(dá)的CAR顯示對所有水平抗原的降低的敏感性，且因此有抗腫瘤活性降低的可能性(James等人,2010；Weijtens等人,2000)。另外，CAR在恒定數(shù)目的CAR/抗原下從T細(xì)胞表面開始下調(diào)(James等人,2010)。因此，在較低密度下CAR-表達(dá)T細(xì)胞在低于最小密度下更易于下調(diào)以實現(xiàn)T細(xì)胞活化。在此研究中，經(jīng)預(yù)測相對于Cetux-CAR因降低的結(jié)合速率而具有降低親和力的Nimo-CAR介導(dǎo)與EGFR表達(dá)密度直接相關(guān)的T細(xì)胞活化并且響應(yīng)于具有低EGFR密度的正常腎細(xì)胞具有降低的活性。另外，Nimo-CAR+T細(xì)胞相對于Cetux-CAR+T細(xì)胞顯示增強(qiáng)的增殖和減弱的CAR下調(diào)。通過Nimo-CAR+T細(xì)胞靶向成膠質(zhì)細(xì)胞瘤上的EGFR具有介導(dǎo)抗腫瘤活性的潛力，同時降低靶標(biāo)上、組織外毒性的可能性。C.Cetux-CAR+和Nimo-CAR+T細(xì)胞在顱內(nèi)神經(jīng)膠質(zhì)瘤模型中的體內(nèi)抗腫瘤功效一些腫瘤如成膠質(zhì)細(xì)胞瘤相對于正常組織表達(dá)在高密度下過度表達(dá)EGFR并且據(jù)猜測改變CAR的scFv結(jié)構(gòu)域以降低結(jié)合親和力可在高EGFR密度存在下優(yōu)先活化T細(xì)胞但在低EGFR密度存在下降低T細(xì)胞活性。Cetux-CAR和Nimo-CAR以獨特的親和力和結(jié)合動力學(xué)結(jié)合EGFR上的重疊表位，以使得Cetux-CAR具有5.3倍降低的解離常數(shù)，且由此更高的親和力，特征為59倍增高的結(jié)合速率。體外研究還表明Cetux-CAR在外源性細(xì)胞因子不存在下具有響應(yīng)于抗原的減少的增殖、增強(qiáng)的CAR下調(diào)(取決于CAR結(jié)合EGFR的scFv結(jié)構(gòu)域和EGFR的密度)、以及響應(yīng)于抗原的重新攻擊的削弱的細(xì)胞因子產(chǎn)生。Cetux-CAR+和Nimo-CAR+T細(xì)胞在治療顱內(nèi)神經(jīng)膠質(zhì)瘤異種移植物中的功效的評價通過顯示以下來支持體外結(jié)論：Cetux-CAR+T細(xì)胞和Nimo-CAR+T細(xì)胞兩者可介導(dǎo)針對表達(dá)中等EGFR密度的U87med的抗腫瘤活性，但僅Cetux-CAR+T細(xì)胞顯示針對具有內(nèi)源性低EGFR密度的U87的抗腫瘤活性。一些研究表明更高親和力的TCR相互作用可產(chǎn)生優(yōu)良的體內(nèi)活性(Nauerth等人,2013；Zhong等人,2013)；然而，已顯示體外T細(xì)胞活性不一定反映體內(nèi)功效(Chervin等人,2013；Janicki等人,2008)。具有高體外效力的高親和力T細(xì)胞已顯示具有削弱的體內(nèi)應(yīng)答，特征為減弱的信號傳導(dǎo)、擴(kuò)增及T細(xì)胞介導(dǎo)功能(Corse等人,2010)。類似地，低親和力相互作用已顯示具有縮減的體內(nèi)T細(xì)胞擴(kuò)增，造成在免疫應(yīng)答的每個階段存在較少的T細(xì)胞(Zehn等人,2009)。評價TCR親和力在抗腫瘤功效中的作用的模型已顯示高親和力TCR相互作用具有削弱的抗腫瘤功能，特征為腫瘤中的減少存在和削弱的溶細(xì)胞功能(Chervin等人,2013；Engels等人,2012；Janicki等人,2008)。因此，已經(jīng)提出具有中等親和力的T細(xì)胞相對于高親和力T細(xì)胞可能更好地控制腫瘤生長(Corse等人,2010；Janicki等人,2008)。將這些觀察結(jié)果與以下體外觀察結(jié)果綜合，Cetux-CAR+T細(xì)胞可具有降低的體內(nèi)抗腫瘤功效，體外觀察結(jié)果包括Cetux-CAR+T細(xì)胞當(dāng)在外源性細(xì)胞因子不存在下刺激時具有降低的增殖能力，在與抗原結(jié)合之后具有增加的CAR下調(diào)，以及響應(yīng)于抗原的重新攻擊的降低的能力。本發(fā)明者沒有觀察到相對于Nimo-CAR+T細(xì)胞的削弱的抗腫瘤功效；然而，在腫瘤內(nèi)注射之后CAR+的歷程沒有接著，且因此，不評價體內(nèi)擴(kuò)增的差異。選擇CAR+T細(xì)胞的腫瘤內(nèi)注射以避免當(dāng)評估抗腫瘤活性時CAR+T細(xì)胞歸巢于腫瘤的不同能力的混雜變量；然而，Cetux-CAR+T細(xì)胞可能由于保持在腫瘤周邊中而具有減少的腫瘤浸潤。Nimo-CAR+T細(xì)胞治療響應(yīng)于U87上的低EGFR密度相對于未治療的小鼠沒有顯著地減少腫瘤負(fù)荷或改善小鼠的存活期，其比正常腎臟上皮細(xì)胞上測量的EGFR密度高約2倍(圖18和圖21)。相比之下，Cetux-CAR+T細(xì)胞在具有低EGFR密度的3/6小鼠中顯示腫瘤控制和延長的存活期。雖然Nimo-CAR+T細(xì)胞治療針對具有極低EGFR密度的正常組織可具有減小的細(xì)胞毒性潛能，但它們還對表達(dá)低EGFR密度的腫瘤逃逸變體具有潛能。然而，由于在成膠質(zhì)細(xì)胞瘤中的實質(zhì)異質(zhì)性，單一靶標(biāo)不太可能在給定患者內(nèi)的所有腫瘤細(xì)胞上表達(dá)(Little等人,2012；Szerlip等人,2012)。用HER2特異性CAR+T細(xì)胞治療實驗成膠質(zhì)細(xì)胞瘤模型還顯示HER2無效腫瘤細(xì)胞的逃逸(Ahmed等人,2010；Hegde等人,2013)。剖析患者腫瘤可鑒定靶向給定腫瘤中的最大數(shù)量細(xì)胞的抗原的組合，并且由CAR+T細(xì)胞靶向多重抗原已顯示改善具有單一特異性的CAR+T細(xì)胞治療的治療功效(Hegde等人,2013)。具有均勻EGFR密度的U87的體內(nèi)實驗沒有概括說明患者腫瘤中的抗原異質(zhì)性，因此，Cetux-CAR+T細(xì)胞或Nimo-CAR+T細(xì)胞與不同特異性的CAR+T細(xì)胞組合的評價可針對來源于可能更好地概括說明體內(nèi)腫瘤異質(zhì)性的患者的成膠質(zhì)細(xì)胞瘤樣本進(jìn)行評估(Ahmed等人,2010)。出人意料地，Cetux-CAR+T細(xì)胞在T細(xì)胞治療7天內(nèi)顯示出顯著毒性，其中在T細(xì)胞注射7天內(nèi)有6/14小鼠死亡。先前，據(jù)報道通過在不帶有腫瘤的小鼠中T細(xì)胞輸注之后48小時的肝酶測量所示，EGFR特異性CAR沒有可檢測的體內(nèi)毒性(Zhou等人,2013)。因為此CAR來源于鼠抗體，所以EGFR特異性CAR不可能識別正常組織上的鼠EGFR。另外，在抗原不存在下毒性的測量在腫瘤上表達(dá)抗原的患者中不重復(fù)生理CAR+T細(xì)胞活化，因為這些細(xì)胞將活化、增殖并響應(yīng)于腫瘤裂解產(chǎn)生細(xì)胞因子，這些都可促成可測量的毒性(Barrett等人,2014)。實際上，在本研究中，用Cetux-CAR+T細(xì)胞治療帶有低抗原腫瘤或不帶有腫瘤的小鼠不會產(chǎn)生可檢測的毒性(圖4)，突出顯示了體內(nèi)T細(xì)胞活化對所觀察到的T細(xì)胞毒性的作用。因為西妥昔單抗不識別鼠EGFR，所以靶標(biāo)上、組織外毒性不可能是Cetux-CAR+T細(xì)胞相關(guān)毒性的原因(Mutsaers等人,2009)。在此模型中Cetux-CAR介導(dǎo)毒性的可能機(jī)制包括由T細(xì)胞活化造成的細(xì)胞因子相關(guān)毒性或由于成簇、免疫突觸形成或與降低抗原特異性的T細(xì)胞細(xì)胞骨架締合所致的Cetux-CAR親合力的可能提高，如在CD8共受體結(jié)合以提高高親和力TCR的親合力，由此導(dǎo)致特異性損失的作用中所述(Stone等人,2013)。概括地說，Nimo-CAR+T細(xì)胞在顱內(nèi)原位異種移植物模型中顯示與更高親和力的Cetux-CAR+T細(xì)胞相當(dāng)?shù)目鼓[瘤活性和改善的存活期，而無與Cetux-CAR+T細(xì)胞有關(guān)的T細(xì)胞相關(guān)毒性。相反，Cetux-CAR+T細(xì)胞而非Nimo-CAR+T細(xì)胞顯示針對具有低EGFR密度的腫瘤的抗腫瘤活性。這些研究結(jié)果與體外觀察結(jié)果一致：Nimo-CAR+T細(xì)胞響應(yīng)于低EGFR密度具有降低的活性。D.為了CAR+T細(xì)胞療法安全擴(kuò)增抗原庫開發(fā)以實現(xiàn)CAR+T細(xì)胞的安全性的方法可被分為三個主要策略：(i)將CAR+T細(xì)胞限于腫瘤組織，(ii)限制CAR表達(dá)/T細(xì)胞持久性，以及(iii)將CAR介導(dǎo)的T細(xì)胞活化限于腫瘤(圖32)。在歸巢于腫瘤部位的T細(xì)胞中歸巢分子與CAR的共表達(dá)(如CCR2、CCR4及CXCR2)已被描述為隔離CAR+T細(xì)胞與腫瘤部位(Peng等人,2010；Moon等人,2011；DiStasi等人,2009)。雖然CAR+T細(xì)胞當(dāng)與無歸巢受體的CAR+T細(xì)胞相比時在腫瘤組織中增濃，但不清楚何種百分比的表達(dá)歸巢受體的CAR+T細(xì)胞不會有效地歸巢于腫瘤且會因此靶向正常組織。同樣，由腫瘤分泌的趨化因子也可在組織創(chuàng)傷和治愈期間在正常組織中分泌。因此，將這些治療與其他治療方式如手術(shù)、化療及放射線組合將擔(dān)當(dāng)在治療期間T細(xì)胞被吸引至非特異性地受損的正常組織的風(fēng)險。對于優(yōu)先在低氧條件下(常見于許多腫瘤中)表達(dá)的CAR的開發(fā)已通過將CAR與氧依賴性降解結(jié)構(gòu)域融合以限制常氧下的CAR表達(dá)和對靶組織的能力來實現(xiàn)(Chan等人,2005)。因為在從低氧移動到常氧的T細(xì)胞中的CAR降解可耗費幾分鐘至幾小時，所以有可能靶標(biāo)上、組織外毒性在CAR降解之前出現(xiàn)。另外，雖然許多腫瘤的中心是低氧的，但充分血管化的邊緣腫瘤區(qū)域可具有足夠的氧濃度來降解CAR，從而保護(hù)邊緣區(qū)域免于CAR介導(dǎo)的T細(xì)胞活性(Vartanian等人,2014)。暫時限制CAR+T細(xì)胞存在的策略包括T細(xì)胞的自殺基因修飾，如CAR作為瞬時RNA物質(zhì)的表達(dá)；和iCaspase9自殺開關(guān)(suicideswitch)的引入，其是通過二聚化(CID)的化學(xué)誘導(dǎo)物來特異性地活化以導(dǎo)致T細(xì)胞死亡(Zhao等人,2010；DiStassi等人,2011；Budde等人,2013；Barrett等人,2011；Barrett等人,2013)。兩種方法都具有高外顯率并且導(dǎo)致CAR+T細(xì)胞的幾乎完全廢除，在通過藥物遞送誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡抑或RNA轉(zhuǎn)基因表達(dá)隨時間損失之后。因為兩種策略都永久地去除CAR+T細(xì)胞，所以它們在保護(hù)正常組織的同時還限制針對腫瘤的治療功效。這些策略的一個限制在于，在CAR減少或T細(xì)胞去除之前，針對正常細(xì)胞的有效活性存在，并且不存在毒性的短期限制。來自T細(xì)胞療法的嚴(yán)重不良事件可從臨床癥狀開始快速進(jìn)展，因此，需要一種策略能夠一輸注CAR+T細(xì)胞就保護(hù)正常組織(Grupp等人,2013；Porter等人,2011)。雙重特異性、互補(bǔ)CAR響應(yīng)于僅在腫瘤上共同表達(dá)的兩種抗原的共表達(dá)通過解離信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域并表達(dá)具有兩種特異性的兩個嵌合受體實現(xiàn)選擇性活化。在此策略中，一個特異性與CD3ζ融合以表達(dá)第一代CAR且不同的互補(bǔ)特異性與共刺激內(nèi)功能域(稱為嵌合共刺激受體(CCR))融合，以使得完全活化及T細(xì)胞功能僅在通過抗原的共表達(dá)的CAR與CCR同時結(jié)合下獲得(Wilkie等人,2014；Lanitis等人,2013；Kloss等人,2013)。此方法已用針對以下具有重定向特異性的不同的CAR與CCR對來試行：乳腺癌的HER2和MUC1、前列腺癌的PSMA和PSCA以及卵巢癌治療的間皮素和α-葉酸受體。早期研究顯示T細(xì)胞活化和裂解功能可在CCR活化不存在下經(jīng)由第一代CAR表達(dá)針對表達(dá)靶標(biāo)的單抗原出現(xiàn)。雖然此細(xì)胞毒性比在第二代CAR下所觀察到的要低，但仍然有CAR靶向表達(dá)單抗原的正常組織的一些殘余風(fēng)險(Wilkie等人,2014；Lanitis等人,2013)?？朔讼拗频囊粋€策略是開發(fā)具有次優(yōu)親和力的第一代CAR，以使得當(dāng)由單抗原激活時其幾乎不能賦予T細(xì)胞功能并且毒性僅僅通過CCR的連接來挽救(Kloss等人,2013)。然而，此策略通過鈍化T細(xì)胞對腫瘤抗原的敏感性來起作用。雖然此策略預(yù)防識別并靶向單抗原表達(dá)組織，由此潛在地降低正常組織毒性，但其同樣降低抗腫瘤活性。另外，出于有效的T細(xì)胞活化和腫瘤消除而要表達(dá)兩種抗原的要求減少了能夠CAR活化的腫瘤的級分并且提高腫瘤逃逸變體發(fā)展的可能性。僅見于正常組織上而未見于腫瘤上的抗原對于PD-1信號傳導(dǎo)內(nèi)功能域的抑制性CAR(iCAR)融合特異性能夠顯著地抑制T細(xì)胞介導(dǎo)的殺傷和響應(yīng)于結(jié)合正常組織抗原的細(xì)胞因子產(chǎn)生(Fedorov等人,2013)。令人印象深刻的是，T細(xì)胞功能的iCAR抑制是可逆性的，并且T細(xì)胞隨后在與腫瘤抗原相遇時能夠完成功能有效的應(yīng)答。此策略的成功依賴于CAR、iCAR及兩種抗原的化學(xué)計量。因此，合理地預(yù)測如果iCAR表達(dá)或抗原在占絕對優(yōu)勢的CAR/腫瘤抗原表達(dá)存在下不充分的話，那么可出現(xiàn)正常組織毒性。此化學(xué)計量參數(shù)必須評估并針對每組抗原嚴(yán)格控制以便此策略能夠奏效。本文描述了一種基于CAR設(shè)計中使用的scFv的親和力控制腫瘤部位的T細(xì)胞活化以響應(yīng)于正常組織上低密度的EGFR減輕CAR+T細(xì)胞的活化同時響應(yīng)于腫瘤組織上的高EGFR密度介導(dǎo)T細(xì)胞的細(xì)胞毒性的方法。此方法的優(yōu)點在于(i)正常組織毒性的降低與響應(yīng)于腫瘤的活性減弱無關(guān)，和(ii)T細(xì)胞的活化/抑制不需要多重抗原的識別，為此表達(dá)的化學(xué)計量和與相對受體的結(jié)合必須受到嚴(yán)格控制。另外，對用于T細(xì)胞活化的多重抗原的需要進(jìn)一步降低將被有效靶向的腫瘤的比例。限制T細(xì)胞靶標(biāo)上、組織外的組織毒性的方法都不是互相排斥的，并且多種策略的組合可提供對避免正常組織損傷的改善。E.臨床意義成膠質(zhì)細(xì)胞瘤患者可以是用于對EGFR有特異性的T細(xì)胞對于癌癥免疫療法的安全性的初始評價的理想患者群。EGFR在40-50％患有成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的患者中過度表達(dá)(Parsons等人,2008；Hu等人,2013)。另外，未在正常腦組織中報道有EGFR表達(dá)(Yano等人,2003)。因為EGFR廣泛分布在正常上皮表面上，所以腫瘤切除之后T細(xì)胞的腔內(nèi)遞送可使抗腫瘤潛能最大化，同時使與CNS外的上皮表面的相互作用的可能性減至最低。在患有成膠質(zhì)細(xì)胞瘤的患者中的初始安全評價之后，可能延長對于以下其他EGFR-表達(dá)惡性腫瘤的EGFR特異性CAR+T細(xì)胞療法，這包括乳腺癌、卵巢癌、肺癌、頭頸部癌、結(jié)腸直腸癌及腎細(xì)胞癌(Hynes等人,2005)。雖然CAR通過T細(xì)胞的RNA修飾的瞬時表達(dá)可由于CAR+T細(xì)胞的存在受限而導(dǎo)致降低的抗腫瘤功效，但RNA修飾的T細(xì)胞的多次輸注，尤其是以加權(quán)的初始劑量，可以克服這些潛在的限制，如先前在晚期白血病鼠模型中通過RNA轉(zhuǎn)移修飾的CD19CAR+T細(xì)胞的情況下所示(Barrett等人,2013)。雖然用通過RNA表達(dá)轉(zhuǎn)移的間皮素特異性CAR的臨床試驗已顯示過敏的可能性，這可歸因于響應(yīng)于反復(fù)的CAR輸注對CAR部分有特異性的IgE抗體應(yīng)答的發(fā)生，已提出在CAR+T細(xì)胞輸注與治療之間不超過10天以便在21天過程內(nèi)完成的給藥策略避免了IgG抗體與IgE抗體的同種型轉(zhuǎn)換并且目前正在評估中(Maus等人,2013)。盡管有這些挑戰(zhàn)，CAR-表達(dá)RNA修飾在臨床應(yīng)用中仍存在許多有吸引力的優(yōu)點。首先，T細(xì)胞的RNA修飾不涉及轉(zhuǎn)基因的基因組整合，且因此可能減少監(jiān)管機(jī)構(gòu)審批的繁瑣手續(xù)，這可以縮短CAR+T細(xì)胞療法的臨床前開發(fā)期。另外，通過RNA轉(zhuǎn)移的CAR修飾的T細(xì)胞的生成比使用睡美人轉(zhuǎn)座子/轉(zhuǎn)座酶系統(tǒng)的DNA修飾快得多，從而在大約一半的離體培養(yǎng)時間中產(chǎn)生如T細(xì)胞的DNA修飾所需要>90％CAR+T細(xì)胞。提高監(jiān)管機(jī)構(gòu)審批手續(xù)的速度和減少離體制造時間可使新穎的CAR+T細(xì)胞療法更快地被診所利用，加快從實驗室到病床的通信時間并且返回調(diào)整在為臨床應(yīng)用微調(diào)這些療法中的提高的效率。RNA修飾還可提供測試對在患者中廣泛表達(dá)的正常組織抗原如EGFR有特異性的瞬時修飾的T細(xì)胞的平臺以便在評估永久整合的CAR作為安全性的另一量度之前測定CAR結(jié)構(gòu)的安全概況。因為Cetux-CAR顯示T細(xì)胞活化和裂解活性響應(yīng)于低EGFR密度，所以永久表達(dá)Cetux-CAR的T細(xì)胞的DNA修飾由于正常組織毒性的高風(fēng)險而不可能是可行的臨床策略。然而，通過RNA轉(zhuǎn)移修飾的Nimo-CAR+T細(xì)胞的最初臨床評價可確定Nimo-CAR+T細(xì)胞在瞬時CAR表達(dá)的額外安全特征下介導(dǎo)正常組織毒性的能力以減輕長期正常組織毒性的問題。雖然Nimo-CAR+T細(xì)胞介導(dǎo)針對低密度EGFR的細(xì)胞毒性的能力降低可以降低正常組織毒性，但其也可降低針對表達(dá)低密度EGFR的腫瘤的效力，從而提高長出表達(dá)低密度EGFR的腫瘤逃逸變體的可能性。相比之下，Cetux-CAR+T細(xì)胞針對所有水平的EGFR表達(dá)的特異性裂解活性可降低長出表達(dá)低EGFR的腫瘤逃逸變體的風(fēng)險，但是以針對具有低EGFR表達(dá)的正常組織的潛在毒性為代價。另外，Cetux-CAR+T細(xì)胞似乎不依賴于靶向EGFR-表達(dá)正常組織而介導(dǎo)一定程度的T細(xì)胞相關(guān)毒性，如在表達(dá)中等密度EGFR的顱內(nèi)U87的治療中所示，這或許是由于增加的細(xì)胞因子產(chǎn)生或局部炎癥的誘發(fā)。Cetux-CAR+與Nimo-CAR+T細(xì)胞之間的關(guān)系突顯了在基因修飾的T細(xì)胞療法的安全性與功效之間必須達(dá)成平衡。選擇何種策略可能具有更佳的臨床結(jié)果，Cetux-CAR+T細(xì)胞具有提高的毒性風(fēng)險但有更強(qiáng)的腫瘤控制的潛力或者Nimo-CAR+T細(xì)胞具有降低的毒性風(fēng)險但有更大的發(fā)生腫瘤逃逸變體的可能性，并沒有一個簡單的解決方案。應(yīng)對此平衡的一個潛在的臨床策略可為輸注通過DNA修飾的Nimo-CAR+T細(xì)胞用于穩(wěn)定控制表達(dá)高EGFR的腫瘤變體，組合多次輸注通過RNA修飾的Cetux-CAR+T細(xì)胞以消除表達(dá)低EGFR的腫瘤細(xì)胞。II.定義如本文所用的術(shù)語“嵌合抗原受體(CAR)”可指的是例如人工T細(xì)胞受體、嵌合T細(xì)胞受體、或嵌合免疫受體，并且包括工程化受體，其將人工特異性移植到特定的免疫效應(yīng)細(xì)胞上。CAR可用于向T細(xì)胞上的單克隆抗體賦予特異性，由此允許生成大量特異性T細(xì)胞，例如用于過繼性細(xì)胞療法中。在具體的實施方案中，CAR將細(xì)胞的特異性導(dǎo)向例如腫瘤相關(guān)抗原。在一些實施方案中，CAR包含細(xì)胞內(nèi)活化結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、及包含腫瘤相關(guān)抗原結(jié)合區(qū)的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域。在具體的方面中，CAR包含來源于單克隆抗體的單鏈可變片段(scFv)融合至CD3-ζ跨膜結(jié)構(gòu)域和內(nèi)功能域的融合物。其他CAR設(shè)計的特異性可來源于受體(例如肽)的配體或來源于模式識別受體，如Dectin。在一些實施方案中，可以通過使用對B譜系分子CD19有特異性的CAR重定向T細(xì)胞的特異性來靶向惡性B細(xì)胞。在某些實施方案中，抗原識別結(jié)構(gòu)域的間距可被修改以減少活化誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。在某些實施方案中，CAR可包含用于額外的共刺激信號傳導(dǎo)的結(jié)構(gòu)域，如CD3-ζ、FcR、CD27、CD28、CD137、DAP10、和/或OX40。在一些實施方案中，以下分子可與CAR共表達(dá)，包括共刺激分子、用于成像(例如，用于電子發(fā)射斷層掃描)的報道基因、當(dāng)添加前藥時有條件地去除T細(xì)胞的基因產(chǎn)物、歸巢受體、趨化因子、趨化因子受體、細(xì)胞因子以及細(xì)胞因子受體。如本文所用的術(shù)語“T細(xì)胞受體(TCR)”是指T細(xì)胞上的蛋白質(zhì)受體，其是由alpha(α)和beta(β)鏈的異源二聚體構(gòu)成，但在一些細(xì)胞中，TCR是由gamma和delta(γ/δ)鏈組成。在一些實施方案中，TCR可在包含TCR的任何細(xì)胞上被修飾，包括例如輔助T細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞、記憶T細(xì)胞、調(diào)控T細(xì)胞、天然殺傷T細(xì)胞及γδT細(xì)胞。如本文所用，術(shù)語“抗原”為能夠被抗體或T細(xì)胞受體結(jié)合的分子。抗原一般可用于誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答和/或產(chǎn)生B和/或T淋巴細(xì)胞的細(xì)胞免疫應(yīng)答。術(shù)語“腫瘤相關(guān)抗原”與“癌細(xì)胞抗原”在本文中可互換使用。在每個情況下，該術(shù)語指的是特異性地或優(yōu)先地通過癌細(xì)胞表達(dá)的蛋白質(zhì)、糖蛋白或糖類。如本文所用的短語“有此需要”關(guān)于治療受試者或選擇性地靶向受試者中的細(xì)胞時是指具有可受益于選擇性殺傷表達(dá)靶抗原(或增加水平的靶抗原)的細(xì)胞的疾病狀況的受試者。在一些方面中，該疾病狀況可以是相對于在受試者中無癌細(xì)胞的情況表達(dá)增加水平的靶抗原的癌癥。舉例來說，該癌癥可以是相對于在受試者中無癌細(xì)胞的情況表達(dá)增加水平的EGFR的神經(jīng)膠質(zhì)瘤。如本文所用的短語“有效量”相對于CART細(xì)胞或包含CART細(xì)胞的藥物組合物是指當(dāng)向受試者施用時足以殺傷表達(dá)(或表達(dá)增加水平的)由CAR結(jié)合的靶抗原的細(xì)胞的CART細(xì)胞的量。III.嵌合抗原受體本文所述的實施方案涉及生成與鑒定編碼抗原特異性嵌合抗原受體(CAR)多肽的核酸。在一些實施方案中，CAR被人源化以降低免疫原性(hCAR)。在一些實施方案中，CAR可識別在一個或多個抗原之間包含共享空間的表位。模式識別受體如Dectin-1可用于獲得針對糖抗原的特異性。在某些實施方案中，結(jié)合區(qū)可包含單克隆抗體的互補(bǔ)決定區(qū)、單克隆抗體的可變區(qū)、和/或其抗原結(jié)合片段。在一些實施方案中，結(jié)合區(qū)為scFv。在另一實施方案中，結(jié)合至受體或細(xì)胞靶標(biāo)的肽(例如，細(xì)胞因子)可包括在內(nèi)作為CAR結(jié)合區(qū)中的scFv區(qū)的可能或替代。因此，在一些實施方案中，CAR可由多個編碼多重scFv區(qū)的載體和/或其他靶蛋白生成?；パa(bǔ)決定區(qū)(CDR)是見于抗原受體(例如，免疫球蛋白和T細(xì)胞受體)蛋白的可變結(jié)構(gòu)域中的短氨基酸序列，其與抗原互補(bǔ)且因此提供對于那個特定抗原有其特異性的受體。抗原受體的每條多肽鏈含有三個CDR(CDR1、CDR2及CDR3)。由于抗原受體通常由兩條多肽鏈構(gòu)成，所以對于每個抗原受體存在六個可與抗原接觸的CDR--重鏈和輕鏈各含有三個CDR。因為與免疫球蛋白和T細(xì)胞受體選擇性有關(guān)的大多數(shù)序列變異一般見于CDR中，所以這些區(qū)有時被稱為高變結(jié)構(gòu)域。在這些當(dāng)中，CDR3顯示最大的變異性，因為它是通過VJ(VDJ，在重鏈和TCRαβ鏈的情況下)區(qū)的重組來編碼。經(jīng)由實施方案生成的CAR編碼核酸可包含一個或多個人基因或基因片段以增強(qiáng)對于人患者的細(xì)胞免疫療法。在一些實施方案中，全長CARcDNA或編碼區(qū)可經(jīng)由本文所述的方法生成?？乖Y(jié)合區(qū)或結(jié)構(gòu)域可包含來源于特定的人單克隆抗體的單鏈可變片段(scFv)的VH和VL鏈的片段，如美國專利7,109,304中所述的那些，該專利以引用的方式并入本文。在一些實施方案中，scFv包含人抗原特異性抗體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在一些實施方案中，scFv區(qū)為由為在人細(xì)胞中表達(dá)的人密碼子選擇而優(yōu)化的序列編碼的抗原特異性scFv。CAR的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的排列可以是多聚體的，如二聚抗體或多聚體。多聚體可通過將輕鏈和重鏈的可變部分交叉配對到可被稱為二聚抗體的物質(zhì)中而形成。在一些實施方案中，CAR的鉸鏈部分可被縮短或排除(即，生成僅包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)及細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的CAR)。許多鉸鏈可在本實施方案中使用，例如如表1所示。在一些實施方案中，絞鏈區(qū)可保留第一半胱氨酸，或通過脯氨酸或絲氨酸取代而突變，或被截短至第一半胱氨酸。Fc部分可從用作抗原結(jié)合區(qū)的scFv上缺失以生成根據(jù)實施方案的CAR。在一些實施方案中，抗原結(jié)合區(qū)可僅編碼一個Fc結(jié)構(gòu)域，例如，來自人免疫球蛋白的CH2或CH3結(jié)構(gòu)域。還可包括人免疫球蛋白的鉸鏈、CH2及CH3區(qū)，該人免疫球蛋白已被修飾以增強(qiáng)二聚和低聚。在一些實施方案中，鉸鏈部分可包含或由8-14個氨基酸肽(例如，12個AA肽)、CD8α的一部分或IgG4Fc組成。在一些實施方案中，抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域可使用促進(jìn)低聚的結(jié)構(gòu)域如CD8α懸掛于細(xì)胞表面。在一些實施方案中，抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域可使用由單克隆抗體(mAb)克隆2D3(mAb克隆2D3，描述于例如Singh等人,2008中)識別的結(jié)構(gòu)域懸掛于細(xì)胞表面。CAR的內(nèi)功能域或細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域一般可引起或促進(jìn)包含CAR的免疫細(xì)胞的正常效應(yīng)功能中的至少一種的活化。舉例來說，內(nèi)功能域可促進(jìn)T細(xì)胞的效應(yīng)功能，例如像，溶細(xì)胞活性或包括分泌細(xì)胞因子的輔助活性。在首次用于試驗、記憶、或記憶型T細(xì)胞中的效應(yīng)功能可包括抗原依賴性增殖。術(shù)語“細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域”或“內(nèi)功能域”是指可轉(zhuǎn)導(dǎo)效應(yīng)功能信號和/或引導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)行特殊功能的CAR的部分。雖然整個細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域都可包括在CAR中，但在一些情況下，可包括內(nèi)功能域的截短部分。一般來說，內(nèi)功能域包括截短的內(nèi)功能域，其中截短的內(nèi)功能域保留轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中的效應(yīng)功能信號的能力。在一些實施方案中，內(nèi)功能域包含T細(xì)胞受體的ζ鏈或其任何同源物(例如，η、δ、γ或ε)、MB1鏈、B29、FcRIII、FcRI以及信號傳導(dǎo)分子的組合，如CD3ζ和CD28、CD27、4-1BB、DAP-10、OX40、及其組合、以及其他相似的分子和片段?？墒褂没罨鞍准易宓钠渌蓡T的細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)部分，如FcγRIII和FcεRI。這些替代的跨膜和細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的實例可見于例如Gross等人(1992)、Stancovski等人(1993)、Moritz等人(1994)、Hwu等人(1995)、Weijtens等人(1996)及Hekele等人(1996)中，其以引用的方式整體并入本文。在一些實施方案中，內(nèi)功能域可包含人CD3ζ細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域?？乖禺愋约?xì)胞外結(jié)構(gòu)域與細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域優(yōu)選地通過跨膜結(jié)構(gòu)域連接?？砂ㄔ贑AR中的跨膜結(jié)構(gòu)域包括例如人IgG4Fc鉸鏈和Fc區(qū)、人CD4跨膜結(jié)構(gòu)域、人CD28跨膜結(jié)構(gòu)域、跨膜人CD3ζ結(jié)構(gòu)域、或半胱氨酸突變的人CD3ζ結(jié)構(gòu)域、或來自人跨膜信號傳導(dǎo)蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域，例如像CD16和CD8及促紅細(xì)胞生成素受體?？缒そY(jié)構(gòu)域的實例提供于例如表1中。在一些實施方案中，內(nèi)功能域包含編碼共刺激受體的序列，例如像修飾的CD28細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域、或CD28、CD27、OX-40(CD134)、DAP10或4-1BB(CD137)共刺激受體。在一些實施方案中，由CD3ζ起始的原始信號、由人共刺激受體提供的額外信號都可包括在CAR中以便更有效地活化轉(zhuǎn)化的T細(xì)胞，這可有助于改善過繼性免疫療法的體內(nèi)持久性和治療成功。如表1中所示，內(nèi)功能域或細(xì)胞內(nèi)受體信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域可包含單獨或以與以下FcγRIII共刺激信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域組合的CD3的ζ鏈，例如像CD28、CD27、DAP10、CD137、OX40、CD2、4-1BB。在一些實施方案中，內(nèi)功能域包含以下一種或多種的一部分或全部：TCRζ鏈、CD28、CD27、OX40/CD134、4-1BB/CD137、FcεRIγ、ICOS/CD278、IL-2Rβ/CD122、IL-2Rα/CD132、DAP10、DAP12及CD40。在一些實施方案中，1、2、3、4或更多個胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域可包括在內(nèi)功能域中。舉例來說，在一些CAR中，已觀察到至少兩個或三個融合在一起的信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域可產(chǎn)生相加或協(xié)同效應(yīng)。在一些方面中，可生成經(jīng)分離的核酸區(qū)段和包括編碼CAR的DNA序列的表達(dá)盒?？墒褂枚喾N載體。在一些優(yōu)選實施方案中，載體可使得遞送編碼CAR的DNA以便免疫如T細(xì)胞。CAR表達(dá)可在調(diào)控的真核生物啟動子的控制下，例如像MNDU3啟動子、CMV啟動子、EF1α啟動子或泛素啟動子。而且，載體可含有可選擇的標(biāo)記物，至少，用來促進(jìn)其體外操縱。在一些實施方案中，CAR可由從DNA模板體外轉(zhuǎn)錄來的mRNA來表達(dá)。嵌合抗原受體分子為重組的且以其經(jīng)由存在于其胞質(zhì)尾中的免疫受體活化基序(ITAM)結(jié)合抗原和轉(zhuǎn)導(dǎo)活化信號的能力為特征。利用抗原結(jié)合部分(例如由單鏈抗體(scFv)生成)的受體構(gòu)建體提供“通用的”的額外益處是在于：它們可以HLA非依賴性方式結(jié)合靶細(xì)胞表面上的天然抗原。例如，scFv構(gòu)建體可融合至編碼CD3復(fù)合體ζ鏈(ζ)的細(xì)胞內(nèi)部分、Fc受體重鏈及sky酪氨酸激酶的序列(Eshhar等人,1993；Fitzer-Attas等人,1998)。包括腫瘤識別和通過CTL的裂解的重定向的T細(xì)胞效應(yīng)機(jī)制已經(jīng)記錄在若干個鼠及人抗原-scFv:ζ系統(tǒng)中(Eshhar等人,1997；Altenschmidt等人,1997；Brocker等人,1998)?？乖Y(jié)合區(qū)可例如來自于人或非人scFv。使用非人抗原結(jié)合區(qū)(如鼠單克隆抗體)的一個可能的問題是降低的人效應(yīng)功能和降低滲透到腫瘤塊中的能力。此外，非人單克隆抗體可由人宿主識別為外源蛋白，且因此，重復(fù)注射這種外源抗體可能造成免疫應(yīng)答的誘發(fā)，由此導(dǎo)致有害的超敏反應(yīng)。對于基于鼠的單克隆抗體，此效應(yīng)被稱為人抗小鼠抗體(HAMA)應(yīng)答。在一些實施方案中，在CAR中包含人抗體或scFv序列與一些鼠抗體相比可幾乎沒造成或不造成HAMA應(yīng)答。類似地，在CAR中包含人序列可用于降低或避免免疫介導(dǎo)的識別或由駐留在受體中的內(nèi)源性T細(xì)胞造成的消除的風(fēng)險并且可能基于HLA識別加工過的抗原。在一些實施方案中，CAR包含：a)細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，b)跨膜結(jié)構(gòu)域，c)絞鏈區(qū)，及d)包含抗原結(jié)合區(qū)的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域。在一些實施方案中，細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域與內(nèi)功能域一起通過可與編碼絞鏈區(qū)的載體和編碼抗原結(jié)合區(qū)的載體融合(例如，經(jīng)由轉(zhuǎn)座子定向的同源重組)的單一載體來編碼。在其他實施方案中，細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)區(qū)和跨膜區(qū)可通過融合(例如，經(jīng)由轉(zhuǎn)座子定向的同源重組)在一起的兩個單獨的載體來編碼。在一些實施方案中，CAR的抗原特異性部分，也被稱為包含抗原結(jié)合區(qū)的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，選擇性地靶向腫瘤相關(guān)抗原。腫瘤相關(guān)抗原可以是任何種類，只要其在腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞表面上表達(dá)?？梢越?jīng)由實施方案生成的CAR靶向的腫瘤相關(guān)抗原的實例包括例如CD19、CD20、癌胚抗原、甲胎蛋白、CA-125、MUC-1、CD56、EGFR、c-Met、AKT、Her2、Her3、上皮腫瘤抗原、黑色素瘤相關(guān)抗原、突變的p53、突變的ras、Dectin-1等等。在一些實施方案中，CAR的抗原特異性部分為scFv。靶向腫瘤的scFv的實例提供于表1中。在一些實施方案中，CAR可與膜結(jié)合的細(xì)胞因子共表達(dá)，以便例如當(dāng)存在少量腫瘤相關(guān)抗原時提高持久性。例如，CAR可與膜結(jié)合的IL-15共表達(dá)。在一些實施方案中，細(xì)胞內(nèi)腫瘤相關(guān)抗原，例如像HA-1、存活素、WT1及p53可以CAR來靶向。這可通過在通用的T細(xì)胞上表達(dá)的CAR來實現(xiàn)，該CAR識別在HLA的情形下由細(xì)胞內(nèi)腫瘤相關(guān)抗原所述的加工過的肽。另外，通用的T細(xì)胞可被遺傳修飾以表達(dá)識別在HLA的情形下細(xì)胞內(nèi)加工的腫瘤相關(guān)抗原的T細(xì)胞受體對。根據(jù)實施方案使用的靶抗原的另外的實例包括但不限于CD19、CD20、ROR1、CD22、癌胚抗原、甲胎蛋白、CA-125、5T4、MUC-1、上皮腫瘤抗原、前列腺特異性抗原、黑色素瘤相關(guān)抗原、突變的p53、突變的ras、HER2/Neu、葉酸結(jié)合蛋白、HIV-1包膜糖蛋白gp120、HIV-1包膜糖蛋白gp41、GD2、CD123、CD33、CD138、CD23、CD30、CD56、c-Met、間皮素、GD3、HERV-K、IL-11Rα、κ鏈、λ鏈、CSPG4、ERBB2、EGFRvIII、VEGFR2、GP240、CD-33、CD-38、VEGFR-1、VEGFR-2、CEA、FGFR3、IGFBP2、IGF-1R、BAFF-R、TACI、APRIL、Fn14、ERBB2或ERBB35T4、MUC-1及EGFR。在某些特定方面中，實施方案的所選CAR包含尼妥珠單抗的CDR或抗原結(jié)合部分，如SEQIDNO:1-2中所列。舉例來說，CAR可包含VLCDR1RSSQNIVHSNGNTYLD(SEQIDNO:5)；VLCDR2KVSNRFS(SEQIDNO:6)；VLCDR3FQYSHVPWT(SEQIDNO:7)；VHCDR1NYYIY(SEQIDNO:8)；VHCDR2GINPTSGGSNFNEKFKT(SEQIDNO:9)及VHCDR3QGLWFDSDGRGFDF(SEQIDNO:10)，參見，例如Mateo等人,1997，其以引用的方式并入本文。在其他特定方面中，實施方案的CAR包含西妥昔單抗的CDR或抗原結(jié)合部分，如SEQIDNO:3-4中所列。舉例來說，CAR可包含VLCDR1RASQSIGTNIH(SEQIDNO:11)；VLCDR2ASEIS(SEQIDNO:12)；VLCDR3QQNNNWPTT(SEQIDNO:13)；VHCDR1NYGVH(SEQIDNO:14)；VHCDR2VIWSGGNTDYNTPFTS(SEQIDNO:15)及VHCDR3ALTYYDYEFAY(SEQIDNO:16)，參見，例如國際(PCT)專利公布WO2012100346，其以引用的方式并入本文。如上所論述，在一些方面中，所選的CAR結(jié)合至抗原并且相對于該抗原具有在約2nM與約500nM之間的Kd，其中包含所選CAR的T細(xì)胞針對表達(dá)該抗原的靶細(xì)胞(例如癌細(xì)胞)展現(xiàn)細(xì)胞毒性。舉例來說，在一些方面中，CAR相對于抗原具有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20nM或更大的Kd并且包含所選CAR的T細(xì)胞針對表達(dá)該抗原的靶細(xì)胞展現(xiàn)細(xì)胞毒性。在更進(jìn)一步的方面中，CAR相對于抗原具有在約5nM與約450、400、350、300、250、200、150、100或50nM之間的Kd。在更進(jìn)一步的方面中，CAR相對于抗原具有在約5nM至500nM、5nM至200nM、5nM至100nM、或5nM至50nM的Kd并且包含所選CAR的T細(xì)胞針對表達(dá)該抗原的靶細(xì)胞展現(xiàn)細(xì)胞毒性。在一些方面中，實施方案的所選CAR每CAR分子可結(jié)合至2、3、4或更多個抗原分子并且包含所選CAR的T細(xì)胞針對表達(dá)該抗原的靶細(xì)胞(例如癌細(xì)胞)展現(xiàn)細(xì)胞毒性。在一些方面中，所選CAR的每個抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域相對于抗原具有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20nM或更大的Kd并且包含所選CAR的T細(xì)胞針對表達(dá)該抗原的靶細(xì)胞展現(xiàn)細(xì)胞毒性。在更進(jìn)一步的方面中，所選CAR的每個抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域相對于抗原具有約5nM至約450、400、350、300、250、200、150、100或50nM的Kd并且包含所選CAR的T細(xì)胞針對表達(dá)該抗原的靶細(xì)胞展現(xiàn)細(xì)胞毒性。在更進(jìn)一步的方面中，所選CAR的每個抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域相對于抗原具有約5nM至500nM、5nM至200nM、5nM至100nM、或5nM至50nM的Kd并且包含所選CAR的T細(xì)胞針對表達(dá)該抗原的靶細(xì)胞展現(xiàn)細(xì)胞毒性。由CAR識別的病原體可以是基本上任何種類的病原體，但在一些實施方案中，病原體為真菌、細(xì)菌或病毒。示例性病毒病原體包括以下那些：腺病毒科、埃-巴二氏病毒(EBV)、巨細(xì)胞病毒(CMV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、JC病毒、BK病毒、HSV、HHV病毒科、小核糖核酸病毒科、皰疹病毒科、肝病毒科、黃病毒科、逆轉(zhuǎn)錄病毒科、正粘病毒科、副粘病毒科、乳多空病毒科、多瘤病毒科、彈狀病毒科以及披膜病毒科。示例性致病病毒引起天花、流感、腮腺炎、麻疹、水痘、埃博拉及風(fēng)疹。示例性致病真菌包括念珠菌屬、曲菌屬、隱球酵母屬、組織胞漿菌屬、肺孢子蟲屬及葡萄狀穗霉屬。示例性致病細(xì)菌包括鏈球菌屬、假單胞菌屬、志賀氏菌屬、彎曲桿菌屬、葡萄球菌屬、螺桿菌屬、大腸桿菌、立克次氏體屬、桿菌屬、博代氏桿菌屬、衣原體屬、螺旋體屬及沙門氏菌屬。在一些實施方案中，病原體受體Dectin-1可用于生成識別如曲菌屬的真菌的細(xì)胞壁上的糖結(jié)構(gòu)的CAR。在另一實施方案中，CAR可基于識別病毒決定簇(例如，來自CMV和埃博拉的糖蛋白)以阻斷病毒感染和病理的抗體來制作。在一些實施方案中，編碼CAR的裸DNA或合適的載體可引入受試者的T細(xì)胞(例如，從患有癌癥或其他疾病的人患者中獲得的T細(xì)胞)中。通過使用裸DNA的電穿孔穩(wěn)定轉(zhuǎn)染T細(xì)胞的方法在本領(lǐng)域中是已知的。參見，例如美國專利號6,410,319。裸DNA一般是指編碼以適用于表達(dá)的方向包含在質(zhì)粒表達(dá)載體中的實施方案的嵌合受體的DNA。在一些實施方案中，裸DNA的使用可縮短產(chǎn)生表達(dá)經(jīng)由實施方案方法生成的CAR的T細(xì)胞所需的時間?；蛘?，病毒載體(例如，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體或慢病毒載體)可用于將嵌合構(gòu)建體引入到T細(xì)胞中。一般來說，用于轉(zhuǎn)染來自受試者的T細(xì)胞的編碼CAR的載體一般在受試者的T細(xì)胞中應(yīng)為非復(fù)制的。已知大量基于病毒的載體，其中保持在細(xì)胞中的病毒拷貝數(shù)低得足以維持細(xì)胞的存活力。說明性載體包括pFB-neo載體以及基于HIV、SV40、EBV、HSV或BPV的載體。一旦已確認(rèn)轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞能夠在所需的調(diào)控下和所需水平下表達(dá)CAR作為表面膜蛋白，便可確定嵌合受體在宿主細(xì)胞中是否具有功能性以提供所期望的信號誘導(dǎo)。隨后，轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞可再引入受試者中或向受試者施用以激活受試者中的抗腫瘤應(yīng)答。為了便于施用，轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞可在適當(dāng)?shù)妮d體或稀釋劑下被制成藥物組合物或被制成適于體內(nèi)施用的植入物，所述載體或稀釋劑優(yōu)選為藥學(xué)上可接受的。制得這種組合物或植入物的手段已在本領(lǐng)域中有所描述(參見，例如Remington'sPharmaceuticalSciences,第16版,Mack編著(1980))。適當(dāng)時，CAR-表達(dá)轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞可被配制成半固體或液體形式的制劑，如膠囊、溶液、注射劑、吸入劑或氣溶膠，以用于它們相應(yīng)的施用途徑的常規(guī)方式?？衫帽绢I(lǐng)域中已知的手段來防止組合物的釋放和吸收或使組合物的釋放和吸收減到最少直到其到達(dá)靶組織或器官或確保組合物的定時釋放。一般來說，優(yōu)選采用不影響表達(dá)嵌合受體的細(xì)胞的藥學(xué)上可接受的形式。因此，轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞理想地可由含有平衡鹽溶液(如漢氏平衡鹽溶液)或生理鹽水的藥物組合物制成。IV.與實施方案有關(guān)的方法和組合物在某些方面中，本文所述的實施方案包括一種制備和/或擴(kuò)增抗原特異性重定向T細(xì)胞的方法，所述方法包括用含有編碼hCAR的DNA構(gòu)建體的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染T細(xì)胞，然后任選地用抗原陽性細(xì)胞、重組抗原或受體的抗體刺激這些細(xì)胞以致使細(xì)胞增殖。另一方面，提供一種通過電穿孔或使用裸DNA的其他非病毒基因轉(zhuǎn)移(如但不限于聲致穿孔)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和重定向T細(xì)胞的方法。大多數(shù)研究者將病毒載體用于攜帶異源基因到T細(xì)胞中。通過使用裸DNA，可縮短產(chǎn)生重定向的T細(xì)胞所需的時間。“裸DNA”意指編碼以適用于表達(dá)的方向包含在表達(dá)盒或載體中的嵌合T細(xì)胞受體(cTCR)的DNA。根據(jù)實施方案的電穿孔方法產(chǎn)生表達(dá)和攜帶在嵌合TCR(cTCR)的表面上的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子。在某些方面中，T細(xì)胞為原代人T細(xì)胞，如來源于人外周血單核細(xì)胞(PBMC)、用G-CSF、骨髓或臍帶血刺激之后收集的PBMC的T細(xì)胞。條件包括mRNA和DNA的使用及電穿孔。轉(zhuǎn)染之后，細(xì)胞可立即被輸注或可被儲存。在某些方面中，轉(zhuǎn)染之后，細(xì)胞可離體繁殖數(shù)天、數(shù)周或數(shù)月作為在基因轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中之后約1、2、3、4、5天或更多天內(nèi)的混合群體。另一方面，轉(zhuǎn)染之后，轉(zhuǎn)染子被克隆并且顯示存在單一整合的或游離體維持的表達(dá)盒或質(zhì)粒和表達(dá)嵌合受體的克隆被離體擴(kuò)增。選出用于擴(kuò)增的克隆顯示特異性地識別和裂解表達(dá)CD19的靶細(xì)胞的能力。重組T細(xì)胞可通過用IL-2或結(jié)合共有γ鏈的其他細(xì)胞因子(例如IL-7、IL-12、IL-15、IL-21等)刺激來擴(kuò)增。重組T細(xì)胞可通過用人工抗原呈遞細(xì)胞刺激來擴(kuò)增。重組T細(xì)胞可在人工抗原呈遞細(xì)胞上或在抗體如OKT3(其與T細(xì)胞表面的CD3交聯(lián))下擴(kuò)增。重組T細(xì)胞的亞群可在人工抗原呈遞細(xì)胞上或在抗體如Campath(其結(jié)合T細(xì)胞表面的CD52)下缺失。另一方面，可將遺傳修飾的細(xì)胞冷凍保存。輸注之后的T細(xì)胞繁殖(存活)可通過以下來評價：(i)使用對CAR有特異性的引物的q-PCR；(ii)使用對CAR有特異性的抗體的流式細(xì)胞術(shù)；和/或(iii)可溶性TAA。本文所述的實施方案還涉及使用重定向的免疫T細(xì)胞用具有CD19特異性的細(xì)胞表面表位對包括B細(xì)胞的B細(xì)胞惡性腫瘤或病癥的靶向。惡性B細(xì)胞為用于重定向的T細(xì)胞的極佳靶標(biāo)，因為B細(xì)胞可充當(dāng)T細(xì)胞的免疫刺激抗原呈遞細(xì)胞。臨床前研究支持：用帶有人或人源化CAR的供體來源的CD19特異性T細(xì)胞的過繼性療法的抗腫瘤活性包括(i)CD19+靶標(biāo)的重定向殺傷，(ii)在與CD19+靶標(biāo)/刺激細(xì)胞培養(yǎng)之后細(xì)胞因子的重定向的分泌/表達(dá)，以及(iii)在與CD19+靶標(biāo)/刺激細(xì)胞培養(yǎng)之后的持續(xù)增殖。在某些實施方案中，CAR細(xì)胞被遞送給有此需要的個體，如患有癌癥或感染的個體。然后細(xì)胞增強(qiáng)個體的免疫系統(tǒng)以攻擊相應(yīng)的癌癥或致病細(xì)胞。在一些情況下，向個體提供一個或多個劑量的抗原特異性CART細(xì)胞。在向個體提供兩個或更多個劑量的抗原特異性CART細(xì)胞的情況下，施用之間的持續(xù)時間應(yīng)足以使得個體中的增殖時間，并且在特定的實施方案中，給藥之間的持續(xù)時間為1、2、3、4、5、6、7天或更多天。被修飾以包括嵌合抗原受體并缺失功能性TCR的同種異體T細(xì)胞的來源可以是任何種類，但在特定的實施方案中，細(xì)胞是從例如臍帶血、外周血、人胚胎干細(xì)胞或誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞庫中獲得的。治療效果的合適劑量將為例如每劑量至少105或約105至約1010個細(xì)胞，優(yōu)選地在一系列給藥周期中。示例性給藥方案是由四個逐步升高劑量的一周給藥周期組成，起始于第0天至少約105個細(xì)胞，舉例來說在啟動患者內(nèi)劑量逐步增加方案的幾周內(nèi)逐漸增加至約1010個細(xì)胞的靶劑量。合適的施用方式包括靜脈內(nèi)、皮下、腔內(nèi)(例如通過儲集器接入裝置)、腹膜內(nèi)、以及直接注射到腫瘤塊中。實施方案的藥物組合物可單獨或以與適用于治療癌癥的其他廣為接受的試劑組合使用。無論是單獨抑或以與其他試劑組合的形式遞送，實施方案的藥物組合物都可經(jīng)由各種途徑遞送到哺乳動物(尤其是人)體內(nèi)的不同部位以實現(xiàn)特定的效應(yīng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，盡管超過一個途徑可用于施用，但特定的途徑可提供比另一途徑更即時且更有效的作用。實施方案的組合物可以單位劑型提供，其中每個劑量單位(例如注射劑)含有預(yù)定量的組合物，單獨或以與其他活性劑的適當(dāng)組合形式。如本文所用的術(shù)語單位劑型是指物理上離散的、適宜作為用于人和動物受試者的單位劑量的單位，每個單位含有預(yù)定量的實施方案的組合物，單獨或以與其他活性劑組合的形式，以足以產(chǎn)生預(yù)期效果的量來計算，適當(dāng)時聯(lián)合藥學(xué)上可接受的稀釋劑、載體或媒介物。用于實施方案的新穎單位劑型的規(guī)格取決于與具體受試者中的藥物組合物有關(guān)的具體藥效學(xué)。理想地，有效量或足夠數(shù)量的分離轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞存在于組合物中并引入受試者中以使得長期的、特異性的抗腫瘤應(yīng)答被建立以減小腫瘤尺寸或消除在不存在這種治療下將出現(xiàn)的腫瘤生長或再生長。理想地，再引入受試者中的轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞的量當(dāng)與其中不存在轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞的相同病狀相比時造成腫瘤尺寸10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或100％減小。因此，所施用的轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞的量應(yīng)考慮施用途徑并且應(yīng)如此以使得足夠數(shù)量的轉(zhuǎn)導(dǎo)T細(xì)胞將被引入以實現(xiàn)期望的治療反應(yīng)。此外，包括在本文所述的組合物中的每種活性劑的量(例如，每個有待接觸的細(xì)胞的量或每一定體重的量)在不同的應(yīng)用中可變化。一般說來，轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞的濃度理想地應(yīng)足以在所治療的受試者中提供至少約1×106至約×109個轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞，甚至更理想地，約1×107至約5×108個轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞，但是可利用任何合適的量，超過，例如大于5×108個細(xì)胞，或者低于，例如小于1×107個細(xì)胞。給藥方案可基于廣為接受的基于細(xì)胞的療法(參見，例如Topalian和Rosenberg,1987；美國專利號4,690,915)，或者可采用交替連續(xù)輸注策略。這些值提供當(dāng)優(yōu)化實施方案的方法時由專業(yè)人員利用的轉(zhuǎn)導(dǎo)T細(xì)胞的范圍的一般指導(dǎo)。在本文中的所述范圍的詳述并沒有排除使用更高或較低量的組分，如在特殊的應(yīng)用中可能被考慮。例如，實際劑量和方案可視組合物是否與其他藥物組合物組合施用或者可視CAR-表達(dá)細(xì)胞中的個體間差異(如，與靶標(biāo)抗原的CAR結(jié)合親和力)而變化。本領(lǐng)域技術(shù)人員可易于根據(jù)具體情況的緊急程度作出任何必要的調(diào)整。V.抗原呈遞細(xì)胞在一些情況下，APC適用于制備基于CAR的治療組合物和細(xì)胞療法產(chǎn)物。根據(jù)實施方案使用的APC包括但不限于樹突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及人工抗原呈遞細(xì)胞。關(guān)于抗原呈遞系統(tǒng)的制備和使用的一般指導(dǎo)，參見，例如美國專利號6,225,042、6,355,479、6,362,001及6,790,662；美國專利申請公布號2009/0017000和2009/0004142；以及國際公布號WO2007/103009)。APC可用于擴(kuò)增CAR-表達(dá)T細(xì)胞。在與腫瘤抗原相遇期間，由抗原呈遞細(xì)胞遞送給T細(xì)胞的信號可實現(xiàn)T細(xì)胞編程及其后續(xù)的治療功效。這對產(chǎn)生對提供給T細(xì)胞的信號允許最佳控制的人工抗原呈遞細(xì)胞有促進(jìn)動力(Turtle等人,2010)。除目標(biāo)抗體或抗原之外，APC系統(tǒng)還可包含至少一種外源性輔助分子?？刹捎萌魏魏线m數(shù)量和組合的輔助分子。輔助分子可選自如共刺激分子和粘附分子的輔助分子。示例性共刺激分子包括CD70和B7.1(也稱為B7或CD80)，其可結(jié)合至T細(xì)胞表面上的CD28和/或CTLA-4，由此實現(xiàn)例如T細(xì)胞擴(kuò)增、Th1分化、短期T細(xì)胞存活以及細(xì)胞因子分泌，如白介素(IL)-2(參見Kim等人,2004)。粘附分子可包括糖結(jié)合的糖蛋白如選擇素、跨膜結(jié)合糖蛋白如整聯(lián)蛋白、鈣依賴性蛋白如鈣粘素、以及單程跨膜免疫球蛋白(Ig)超家族蛋白如細(xì)胞間粘附分子(ICAM)，它們促進(jìn)例如細(xì)胞與細(xì)胞或細(xì)胞與基質(zhì)的接觸。示例性粘附分子包括LFA-3和ICAM，如ICAM-1。適用于示例性輔助分子(包括共刺激分子和粘附分子)的選擇、克隆、制備及表達(dá)的技術(shù)、方法及試劑舉例說明在例如美國專利號6,225,042、6,355,479及6,362,001中。被選出變成aAPC的細(xì)胞優(yōu)選地在細(xì)胞內(nèi)抗原加工、細(xì)胞內(nèi)肽運輸和/或細(xì)胞內(nèi)MHCI類或II類分子肽裝載中具有缺陷，或為變溫的(即，對溫度攻擊沒有哺乳動物細(xì)胞系敏感)，或具有缺陷和變溫特性兩者。優(yōu)選地，被選出變成aAPC的細(xì)胞還缺乏表達(dá)引入細(xì)胞中的外源性MHCI類或II類分子和輔助分子組分的至少一種內(nèi)源性對應(yīng)物(例如，內(nèi)源性MHCI類或II類分子和/或如上所述的內(nèi)源性輔助分子)的能力。此外，aAPC優(yōu)選地保留在其修飾以生成aAPC之前細(xì)胞所具有的缺陷和變溫特性。示例性aAPC構(gòu)成或來源于與抗原加工(TAP)缺乏的細(xì)胞系(如昆蟲細(xì)胞系)有關(guān)的轉(zhuǎn)運子。示例性變溫昆蟲細(xì)胞系為果蠅細(xì)胞系，如Schneider2細(xì)胞系(例如，Schneider,J.m1972)。用于Schneider2細(xì)胞的制備、生長及培養(yǎng)的說明性方法提供于美國專利號6,225,042、6,355,479及6,362,001中。APC可經(jīng)受凍融循環(huán)。例如，APC可通過將含有APC的合適容器與適量的液氮、固體二氧化碳(干冰)或類似低溫材料接觸以使得冷凍快速發(fā)生來冷凍。然后通過將APC從低溫材料中移除并暴露于周圍室溫條件，或者通過便利的解凍過程對冷凍的APC進(jìn)行解凍，在便利的解凍過程中溫水浴或溫曖的手被用于促成較短的解凍時間。另外，APC可在解凍之前被冷凍和儲存一段延長的時間。也可對冷凍的APC進(jìn)行解凍，然后在進(jìn)一步使用之前凍干?？赡懿焕赜绊憙鋈谶^程的防腐劑，如二甲亞砜(DMSO)、聚乙二醇(PEG)及其他防腐劑，不宜存在于經(jīng)歷凍融循環(huán)的含有APC的介質(zhì)中或者如通過將APC轉(zhuǎn)移到基本上不含這種防腐劑的介質(zhì)中被基本上去除。在其他實施方案中，異種核酸和aAPC內(nèi)源性核酸可通過交聯(lián)而滅活，以使得在滅活之后基本上沒有細(xì)胞生長、核酸的復(fù)制或表達(dá)。例如，aAPC可在表達(dá)外源性MHC和輔助分子、將所述分子呈遞在aAPC表面上并用所選的一種或多種肽裝載所呈遞的MHC分子之后的一點處滅活。因此，所述滅活和選出的肽裝載的aAPC基本上不能增殖或復(fù)制，但可保留所選肽的呈遞功能。交聯(lián)也可產(chǎn)生基本上不含污染微生物如細(xì)菌和病毒的aAPCS，而實質(zhì)上不會降低aAPC的抗原呈遞細(xì)胞功能。因此，交聯(lián)可用于維持aAPC的重要的APC功能，同時有助于緩和關(guān)于使用aAPC開發(fā)的細(xì)胞療法產(chǎn)物的安全性問題。關(guān)于與交聯(lián)有關(guān)的方法和aAPC，參見，例如美國專利申請公布號20090017000，其以引用的方式并入本文。VI.試劑盒本文所述的任何組合物都可包含在試劑盒中。在一些實施方案中，同種異體的CART細(xì)胞提供于試劑盒中，所述試劑盒還可包括適用于擴(kuò)增細(xì)胞的試劑，如介質(zhì)、抗原呈遞細(xì)胞(例如aAPC)、生長因子、抗體(例如用于分選或表征CART細(xì)胞)和/或編碼CAR或轉(zhuǎn)座酶的質(zhì)粒。在非限制性實施例中，嵌合受體表達(dá)構(gòu)建體、生成嵌合受體表達(dá)構(gòu)建體的一種或多種試劑、用于轉(zhuǎn)染表達(dá)構(gòu)建體的細(xì)胞和/或獲得用于轉(zhuǎn)染表達(dá)構(gòu)建體的同種異體細(xì)胞的一種或多種儀器(這類儀器可以是注射器、移液管、鑷子和/或任何這類醫(yī)學(xué)上認(rèn)可的裝置)。在一些實施方案中，用于消除內(nèi)源性TCRα/β表達(dá)的表達(dá)構(gòu)建體、生成構(gòu)建體的一種或多種試劑和/或CAR+T細(xì)胞被提供于試劑盒中。在一些實施方案中，還包括編碼鋅指核酸酶的表達(dá)構(gòu)建體。在一些方面中，試劑盒包括用于細(xì)胞電穿孔的試劑或裝置。試劑盒可包含實施方案的一種或多種適當(dāng)?shù)确值慕M合物或生成實施方案組合物的試劑。試劑盒的組分可以含水介質(zhì)或凍干形式包裝。試劑盒的容器裝置可包括至少一個小瓶、試管、燒瓶、瓶子、注射器或其他容器裝置，組分可位于且優(yōu)選地適當(dāng)?shù)确钟谒鋈萜餮b置中。當(dāng)試劑盒中存在一種以上組分時，該試劑盒一般還將含有第二、第三或其他額外的容器，額外的組分可單獨位于這些容器中。然而，組分的各種組合可包含在小瓶中。實施方案的試劑盒通常還將包括用于容納嵌合受體構(gòu)建體和任何其他試劑容器的裝置，密封以用于商業(yè)銷售。這類容器可包括例如注射成?；虼的３尚偷乃芰先萜?，其中保留了所需小瓶。VII.實施例以下特定和非限制性實施例被視為僅為說明性的，且無論如何不以任何方式限制本公開。據(jù)信本領(lǐng)域技術(shù)人員可基于本文中的說明書在最大程度上利用本公開內(nèi)容，而不需要進(jìn)一步的詳細(xì)說明。本文所引用的所有出版物都在此以引用的方式整體并入。當(dāng)參考URL或其他這類標(biāo)識或地址時，應(yīng)理解這類標(biāo)識可變化并且因特網(wǎng)上的特定信息可能變來變?nèi)?，但是通過在因特網(wǎng)上進(jìn)行搜索可以找到等同的信息。對其的參考證實了這些信息的可用性及其公眾傳播。實施例1–材料和方法質(zhì)粒西妥昔單抗來源的CAR轉(zhuǎn)座子。西妥昔單抗來源的CAR是由以下物質(zhì)組成：來自人GMCSFR2信號肽的信號肽(氨基酸1-22；NP_758452.1)、西妥昔單抗的可變輕鏈(PDB:1YY9_C)甲溝炎接頭(AAE37780.1)、西妥昔單抗的可變重鏈(PDB:1YY9_D)、人IgG4(氨基酸161-389，AAG00912.1)、人CD28跨膜和信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(氨基酸153-220，NP_006130)、以及人CD3-ζ細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(氨基酸52至164，NP_932170.1)。GMCSFR2序列、可變輕鏈、甲溝炎接頭、可變重鏈以及部分IgG4是人密碼子優(yōu)化的并且通過GeneART(Regensburg,Germany)生成為0700310/pMK。在人類延長因子1-α(HEF1α)控制下的先前所述的CD19CD28mZ(CoOp)/pSBSO被選為SB轉(zhuǎn)座子的主鏈。0700310/pMK和先前所述的CD19CD28mZ/pSBSO(93,94)經(jīng)歷用NheI和XmnI限制酶的雙消化。CAR插入物與轉(zhuǎn)座子主鏈通過在0.8％瓊脂糖凝膠中在150伏下運行45分鐘的瓊脂糖凝膠電泳并用溴化乙錠染色以便在紫外曝光下目測而分別被鑒定為1.3kb和5.2kb的DNA片段。將條帶切除并純化(Qiaquick凝膠提取試劑盒，Qiagen,Valencia,CA)，然后使用T4DNA連接酶(Promega,Madison,WI)在3:1的插入物與主鏈摩爾比下連接。TOP10化學(xué)感受態(tài)細(xì)菌(Invitrogen,GrandIsland,NY)的熱激轉(zhuǎn)化和在37℃下培養(yǎng)12-16小時的含卡那霉素的瓊脂板上的選擇鑒定了細(xì)菌克隆對于轉(zhuǎn)座子主鏈呈陽性。六個克隆被選出在37℃下在卡那霉素選擇下在TB培養(yǎng)基中微型培養(yǎng)8小時。DNA由微型培養(yǎng)物的制備經(jīng)由MiniPrep試劑盒(Qiagen)完成，并且隨后用限制酶進(jìn)行分析消化且通過瓊脂糖凝膠電泳對片段尺寸分析將克隆鑒定為CetuxCD28mZ(CoOp)/pSBSO陽性的(圖33A)。將陽性克隆1:1000接種到具有卡那霉素抗生素選擇的TB培養(yǎng)基中的大型培養(yǎng)中并且在37℃下在振蕩器上培養(yǎng)16小時直到實現(xiàn)對數(shù)期生長。使用EndoFreeMaxiPrep試劑盒(Qiagen)將DNA從細(xì)菌中分離。DNA的分光光度分析證實通過OD260/280讀數(shù)的純度為1.8至2.0。尼妥珠單抗來源的CAR轉(zhuǎn)座子。尼妥珠單抗來源的CAR是由以下物質(zhì)組成：來自人GMCSFR2信號肽的信號肽(氨基酸1-19，NP_001155003.1)、尼妥珠單抗的可變輕鏈(PDB:3GKW_L)、甲溝炎接頭(GenBank：AAE37780.1)、尼妥珠單抗的可變重鏈(PDB:3GKW_H)、人IgG4(氨基酸161-389，AAG00912.1)、人CD28跨膜和信號傳導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(氨基酸153-220，NP_006130)以及人CD3-ζ細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(氨基酸52至164，NP_932170.1)。GMCSFR2序列、可變輕鏈、甲溝炎接頭、可變重鏈以及部分IgG4是人密碼子優(yōu)化的并且通過GeneART生成為0841503/pMK。08541503/pMK和先前所述的CD19CD28mZ/pSBSO(Singh等人,2013；Singh等人,2008)經(jīng)歷用NheI和XmnI限制酶的雙消化，連接，轉(zhuǎn)化，大規(guī)模擴(kuò)增及質(zhì)粒NimoCD28mZ(CoOp)/pSBSO的純化如上所述進(jìn)行(圖33B)。SB11轉(zhuǎn)座酶。在CMV啟動子(Kan-CMV-SB11)控制下的高活性SB11轉(zhuǎn)座酶如先前所述使用(Singh等人,2008；Davies等人,2010)。pGEM/GFP/A64。在T7啟動子控制下的GFP，然后是64個A-T堿基對和SpeI位點被用于體外轉(zhuǎn)錄GFPRNA。先前已經(jīng)描述了pGEM/GFP/A64的克隆(Boczkowski等人,2000)。西妥昔單抗來源的CAR/pGEM-A64。將西妥昔單抗來源的CAR通過CetuxCD28mZ(CoOp)/pSBSO和CD19CD28mZ(CoOp)/pSBSO-MCS的NheI和XmnI雙消化克隆到中間載體pSBSO-MCS中。在電泳之后通過從瓊脂糖凝膠中的提取來分離Cetux-CAR插入物和pSBSO-MCS主鏈并且連接，轉(zhuǎn)化和如CetuxCD28mZ(CoOp)/pSBSO的生成中所述大規(guī)模擴(kuò)增。將CetuxCD28mZ(CoOp)克隆到pGEM/GFP/A64質(zhì)粒中以便將Cetux-CAR置于T7啟動子的控制下以用于體外轉(zhuǎn)錄。具有64個核苷酸長度的人工聚A尾的RNA在37℃下用NheI和EcoRV消化CetuxCD28mZ(CoOp)/pSBSO-MCS，而在37℃下用XbaI然后在25℃下用SmaI依序消化pGEM/GFP/A64。將消化的Cetux-CAR插入物與pGEM/A64主鏈通過在0.8％瓊脂糖凝膠中在150伏下運行45分鐘的電泳分離，并且通過溴化乙錠染色和UV曝光來目測。將片段從凝膠上切除并通過Qiaquick凝膠提取(Qiagen)進(jìn)行純化并且在3:1插入物與載體摩爾比下使用T4DNA連接酶(Promega)來連接并在16℃下孵育過夜。Dam-/-C2925化學(xué)感受態(tài)細(xì)菌(Invitrogen)通過熱激進(jìn)行轉(zhuǎn)化并且在37℃下在含氨芐青霉素的瓊脂上培養(yǎng)過夜以用于含pGEM/A64主鏈的克隆的選擇。將八個克隆通過在氨芐青霉素抗生素選擇下在TB培養(yǎng)基中接種選出進(jìn)行小規(guī)模的DNA擴(kuò)增并且在37℃下在振蕩器上培養(yǎng)8小時。使用MiniPrep試劑盒(Qiagen)和分析型限制酶消化進(jìn)行DNA的純化，且隨后的電泳確定哪些克隆表達(dá)正確的連接產(chǎn)物CetuxCD28mZ/pGEM-A64(圖33C)。選出陽性克隆1:1000接種在含氨芐青霉素的TB中。在37℃下培養(yǎng)18小時之后，使用EndoFree質(zhì)粒純化試劑盒(Qiagen)純化DNA。分光光度分析通過OD260/280比率在1.8與2.0之間證實高質(zhì)量DNA。尼妥珠單抗來源的CAR/pGEM-A64。在37℃下用NheI且在50℃下用SfiI依序消化NimoCD28mZ(CoOp)/pSBSO，而在37℃下用XbaI且在50℃下用SfiI依序消化pGEM/GFP/A64。將NimoCD28mZ(CoOp)克隆到pGEM/GFP/A64質(zhì)粒中以便將Nimo-CAR置于T7啟動子的控制下用于體外轉(zhuǎn)錄具有64個核苷酸長度的人工聚A尾的RNA。將消化的Nimo-CAR插入物和pGEM/A64主鏈通過在0.8％瓊脂糖凝膠中在150伏下運行45分鐘的電泳分離，并且通過溴化乙錠染色和UV曝光來目測。將片段從凝膠上切除并通過Qiaquick凝膠提取(Qiagen)進(jìn)行純化并且在3:1插入物與載體摩爾比下使用T4DNA連接酶(Promega)來連接并在16℃下孵育過夜。Dam-/-C2925化學(xué)感受態(tài)細(xì)菌(Invitrogen)通過熱激進(jìn)行轉(zhuǎn)化并且在37℃下在含氨芐青霉素的瓊脂上培養(yǎng)過夜用于含pGEM/A64主鏈的克隆的選擇。將八個克隆通過在氨芐青霉素抗生素選擇下在TB培養(yǎng)基中接種選出進(jìn)行小規(guī)模的DNA擴(kuò)增并且在37℃下在振蕩器上培養(yǎng)8小時。使用MiniPrep試劑盒(Qiagen)和分析型限制酶消化進(jìn)行DNA的純化且隨后的電泳確定哪些克隆表達(dá)正確的連接產(chǎn)物NimoCD28mZ/pGEM-A64(圖33D)。選出陽性克隆1:1000接種在含氨芐青霉素的TB中。在37℃下培養(yǎng)18小時之后，使用EndoFree質(zhì)粒純化試劑盒(Qiagen)純化DNA。分光光度分析通過OD260/280比率在1.8與2.0之間證實高質(zhì)量DNA。截短的EGFR轉(zhuǎn)座子。將截短的EGFR克隆到經(jīng)由自剪切肽序列F2A連接到新霉素抗性基因上的SB轉(zhuǎn)座子中。僅含細(xì)胞外和跨膜結(jié)構(gòu)域的人EGFR(登錄NP_005219.2)的密碼子優(yōu)化的截短形式0909312ErbB1/pMK-RQ通過GeneArt(Regensburg,Germany)來合成。在37℃下用NheI和SmaI消化ErbB1/pMK-RQ，而在37℃下用NheI、然后在37℃下用NruI依序消化tCD19-F2A-Neo/pSBSO，兩次消化之間有純化步驟(Qiaquick凝膠提取試劑盒，Qiagen)。通過在0.8％瓊脂糖凝膠上在150伏下運行45分鐘的凝膠電泳分離tEGFR插入物與F2A-Neo/pSBSO主鏈。分離具有預(yù)測尺寸的條帶(Qiaquick凝膠提取試劑盒，Qiagen)并在16℃下用T4DNA連接酶(Promega)連接。TOP10化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞(Invitrogen)被熱激轉(zhuǎn)化伴隨連接產(chǎn)生并且在含卡那霉素的瓊脂上培養(yǎng)過夜。接種五個克隆以通過在含卡那霉素的TB中培養(yǎng)8小時進(jìn)行小規(guī)模DNA擴(kuò)增。通過MiniPrep試劑盒(Qiagen)的DNA純化及隨后的分析型限制酶消化鑒定克隆為tErbB1-F2A-Neo/pSBSO陽性的(圖33E)。將陽性克隆以1:1000接種到培養(yǎng)物中用于在37℃下在振蕩器上培養(yǎng)16小時的大規(guī)模DNA擴(kuò)增。使用EndoFree質(zhì)粒純化試劑盒(Qiagen)進(jìn)行來自對數(shù)期生長的細(xì)菌的DNA的純化并且分光光度法通過OD260/280讀數(shù)在1.8與2.0之間證實DNA純度。CAR-L轉(zhuǎn)座子。將先前所述的2D3雜交瘤(94)用于獲得CAR-L的scFv序列。簡單說來，根據(jù)制造商說明書，通過RNeasy微型試劑盒(Qiagen)從雜交瘤中提取RNA。經(jīng)由SuperscriptIIIFirstStrand試劑盒(Invitrogen)的逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA文庫。使用FR1區(qū)的簡并引物的PCR擴(kuò)增小鼠可變重鏈和輕鏈，它們隨后被連接到TOPOTA載體中。CAR-L被如下構(gòu)建成為密碼子優(yōu)化序列：在人GMCSFR信號肽(氨基酸1-22；NP_758452.1)之后，2D3-來源的scFv融合至人CD8α細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(氨基酸136-182；NP_001759.3)及人CD28的跨膜和細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(氨基酸56-123；NP_001230006.1)并且以CD3ζ的人細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域(氨基酸48-163；NP_000725.1)終止。CAR-L蛋白在GeneArt合成，然后切除并且用融合至博萊霉素抗性基因的可自剪切的2A肽連接到SB轉(zhuǎn)座子中，表示為CAR-L-2A-Zeo(圖33F)(Rushworth等人,2014)。細(xì)胞系：增殖和修飾除非另作說明，否則將所有細(xì)胞系都保持在5％CO2、95％濕度及37℃下的完全培養(yǎng)基杜爾貝科改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco’smodifiedeaglemedium,DMEM)(LifeTechnologies,GrandIsland,NY)中，該培養(yǎng)基中補(bǔ)充有10％熱滅活胎牛血清(FBS)(HyClone,ThermoScientific)和2mMGlutamax-100(Gibco,LifeTechnologies)。將粘附細(xì)胞系常規(guī)地培養(yǎng)至70-80％匯合，然后1:10傳代，之后用0.05％胰蛋白酶-EDTA(Gibco)解離。根據(jù)制造商說明書，使用AmpF_STR標(biāo)識試劑盒(AppliedBiosystems，目錄號4322288)通過STRDNA指紋圖譜驗證細(xì)胞系的身份。將STR曲線與已知的ATCC指紋圖譜(ATCC.org)并且與細(xì)胞系集成分子認(rèn)證數(shù)據(jù)庫(CellLineIntegratedMolecularAuthenticationdatabase,CLIMA)0.1.200808版(在萬維網(wǎng)上的bioinformatics.istge.it/clima/網(wǎng)址處)(NucleicAcidsResearch37:D925-D932PMCID:PMC2686526)相比。STR曲線匹配已知的DNA指紋圖譜。OKT3裝載的K562克隆4。K562克隆4作為禮物獲贈于賓夕法尼亞大學(xué)(UniversityofPennsylvania)的CarlJune,M.D.并且先前已有描述(Suhoski等人,2007；Paulos等人,2008)?？寺?被修飾以表達(dá)tCD19、CD86、CD137L、CD64及膜IL15-GFP融合蛋白并且已被制造作為工作細(xì)胞庫用于在PACT下的臨床前和臨床研究。可使K562克隆4通過結(jié)合至CD64高親和力Fc受體而表達(dá)抗CD3抗體OKT3。為了將OKT3裝載到K562克隆4上，將細(xì)胞在含有1x20％N-乙酰半胱氨酸的X-VIVO無血清培養(yǎng)基(Lonza,Cologne,Germany)中以1x106個細(xì)胞/mL的密度培養(yǎng)過夜。此步驟為OKT3的最佳結(jié)合清除Fc受體。次日，將細(xì)胞洗滌并且以1x106個細(xì)胞/mL再懸浮于含有1x20％N-乙酰半胱氨酸的X-VIVO培養(yǎng)基中并且在達(dá)到100Gy下輻照。將細(xì)胞洗滌并以1x106個細(xì)胞/mL再懸浮于PBS中并且以1mg/mL的濃度添加OKT3(eBioscience,SanDiego,CA)并在4℃下在滾筒上孵育30分鐘。再次洗滌細(xì)胞，染色以通過流式細(xì)胞術(shù)證實共刺激分子和OKT3的表達(dá)，并且冷凍保存。tEGFR+K562克隆27。K562克隆27來源于K562克隆9，后者作為禮物獲贈于賓夕法尼亞大學(xué)的CarlJune,M.D.。如先前所述(Suhoski等人,2007；Paulos等人,2008)，將K562克隆9慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)以表達(dá)tCD19、CD86、CD137L及CD64?？寺?7經(jīng)由SB轉(zhuǎn)染由克隆9修飾以穩(wěn)定地表達(dá)膜栓系的IL15-IL15Rα融合蛋白(Hurton,L.V.,2014)，通過有限稀釋進(jìn)行克隆，并且通過流式細(xì)胞術(shù)證實具有所有轉(zhuǎn)基因的高表達(dá)。K562克隆27通過tErbB1-F2A-Neo/pSBSO的SB轉(zhuǎn)染修飾以表達(dá)截短的EGFR。用PE標(biāo)記的EGFR特異性抗體(BDBiosciences,Carlsbad,CA，目錄號555997)和抗PE珠(MiltenyiBiotec,Auburn,CA)孵育表達(dá)EGFR的K562克隆27，然后通過流過磁性柱(MiltenyiBiotec)與非標(biāo)記的細(xì)胞分離。磁選擇之后，在1mg/mLG418(Invivogen,SanDiego,CA)存在下培養(yǎng)tEGFR+K562克隆27以維持高EGFR表達(dá)。EL4、CD19+EL4、tEGFR+EL4及CAR-L+EL4。EL4是從ATCC獲得的并且通過SB非病毒基因修飾而修飾以表達(dá)tCD19-F2A-Neo、tEGFR-F2A-Neo或CAR-L-F2A-Neo。根據(jù)制造商說明書，使用AmaxaNucelofector(Lonza)和原代小鼠T細(xì)胞試劑盒(Lonza)對EL4進(jìn)行電穿孔。簡單說來，在90xg下旋轉(zhuǎn)2x106個EL4細(xì)胞10分鐘并且再懸浮于100uL含有3μg轉(zhuǎn)座子(tCD19-F2A-Neo、tEGFR-F2A-Neo或CAR-L-2A-Zeo)和2ugSB11轉(zhuǎn)座酶的原代小鼠T細(xì)胞緩沖液中，并使用Amaxa程序X-001進(jìn)行電穿孔。電穿孔之后，將細(xì)胞立即轉(zhuǎn)移到以試劑盒(Lonza)供應(yīng)的預(yù)熱的和補(bǔ)充的原代小鼠T細(xì)胞培養(yǎng)基中。次日，添加1mg/mLG418以選出經(jīng)修飾以表達(dá)轉(zhuǎn)基因的EL4細(xì)胞。修飾后7天通過流式細(xì)胞術(shù)證實表達(dá)。U87、U87low、U87med及U87high。U87(正式表示為U87MG)是從ATCC(Manassas,VA)獲得的。根據(jù)制造商說明書，使用AmaxaNucleofector和細(xì)胞系Nucleofector試劑盒T(Lonza，目錄號VACA-1002)，通過用tErbB1-F2A-Neo/pSBSO和SB11電穿孔生成U87low和U87med以過度表達(dá)EGFR。簡單說來，U87細(xì)胞被培養(yǎng)至80％匯合，然后通過在0.05％胰蛋白酶-EDTA(Gibco)中解離來收獲并使用自動細(xì)胞計數(shù)器(Cellometer，自動T4細(xì)胞計數(shù)器，Nexcelcom,Lawrence,MA)經(jīng)由臺盼藍(lán)排除來計數(shù)。將1x106個U87細(xì)胞在3μgtErbB1-F2A-Neo/pSBSO轉(zhuǎn)座子和2μgSB11轉(zhuǎn)座酶存在下懸浮于100μL細(xì)胞系試劑盒T電穿孔緩沖液中，轉(zhuǎn)移到槽中并且經(jīng)由程序U-029電穿孔。電穿孔之后立即將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到6孔板中并使其回收于完全DMEM培養(yǎng)基中。次日，添加0.35mg/mLG418(Invivogen)以針對轉(zhuǎn)基因表達(dá)來選擇。在增殖至至少1x106個細(xì)胞之后，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)來評價EGFR表達(dá)。電穿孔的U87細(xì)胞證實EGFR表達(dá)相對于未修飾的U87的適度增加并且被表示為U87low。為了生成U87med細(xì)胞，根據(jù)制造商說明書，使用Lipofectamine2000(Invitrogen)用tErbB1-F2A-Neo和SB11對U87細(xì)胞進(jìn)行陽離子脂質(zhì)體-轉(zhuǎn)移。次日，添加0.35mg/mLG418到培養(yǎng)物中以針對新霉素抗性來選擇。在細(xì)胞增殖至顯著數(shù)目之后，流式細(xì)胞術(shù)展現(xiàn)兩個峰值群，相對于U87細(xì)胞有互相排斥的中等或高等EGFR過度表達(dá)。用抗EGFR-PE染色細(xì)胞并且針對前50％最高峰進(jìn)行FACS分選。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到不大于70％匯合時進(jìn)行小心的亞克隆并且常規(guī)地進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析以確保細(xì)胞維持EGFR表達(dá)。U87high是過度表達(dá)wtEGFR的U87-172b細(xì)胞，并且是Oliver博士的饋贈。U87-ffLuc-mKate和U87med-ffLuc-mKate。將U87和U87med細(xì)胞慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)以表達(dá)ffLuc-mKate轉(zhuǎn)基因(圖34)，類似于先前所述的方案(Turkman等人,2011)。簡單說來，根據(jù)制造商說明書，在Lipofectamine2000(Invitrogen)存在下用pcMVR8.2、VSV-G及pLVU3GeffLuc-T2AmKates158A轉(zhuǎn)染293-METR包裝細(xì)胞。48小時之后，收獲病毒樣顆粒(VLP)并在100kDaNMWL過濾器(Millipore,Billerica,MA)上濃縮。為了轉(zhuǎn)導(dǎo)U87和U87med，將細(xì)胞鋪于6孔板中直到70-80％匯合，然后將ffLucmKateVLP連同8μg/mL聚凝胺一起添加。將該板在1800rpm下離心1.5小時，然后孵育6小時。孵育之后，去除上清液。轉(zhuǎn)導(dǎo)之后二十四小時，細(xì)胞達(dá)到匯合并繼代培養(yǎng)并且針對表達(dá)中等水平ffLuc-mKate的細(xì)胞進(jìn)行FACS分選。人腎皮層上皮細(xì)胞(HRCE)。HRCE是從Lonza獲得的，經(jīng)描述是從健康個體的近端和遠(yuǎn)端腎小管中采集的，并培養(yǎng)于完全腎生長培養(yǎng)基(Lonza，目錄號CC-3190)中，該培養(yǎng)基中補(bǔ)充有重組人表皮生長因子(rhEGFR)、腎上腺素、胰島素、三碘甲腺原氨酸、氫化可的松、轉(zhuǎn)鐵蛋白、10％熱滅活的FBS(HyClone)以及2mMGlutamax-100(Gibco)。HRCE具有有限的體外壽命，因此，所有測定都用經(jīng)歷小于10個群體倍增的細(xì)胞進(jìn)行。培養(yǎng)細(xì)胞至70-80％匯合，然后通過0.05％胰蛋白酶-EDTA(Gibco)分離并于新鮮的完全腎生長培養(yǎng)基中1:5傳代。NALM-6、T98G、LN18及A431。NALM-6、T98G、LN18及A431全部都從ATCC中獲得的并且如針對細(xì)胞系所述來培養(yǎng)。T細(xì)胞修飾和培養(yǎng)。外周血單核細(xì)胞是從來自墨西哥灣沿岸地區(qū)血庫(GulfCoastRegionalBloodBank)的健康供體中獲得的并且通過Ficoll-Paque(GEHealthcare,Milwaukee,WI)分離并冷凍保存。所有T細(xì)胞培養(yǎng)物都保持在補(bǔ)充有10％FBS(HyClone)和2mMGlutamax(Gibco)的完全RPMI-1640(HyClone)中。用SB轉(zhuǎn)座子/轉(zhuǎn)座酶的電穿孔。如先前所述進(jìn)行SB電穿孔(Singh等人,2008)。在電穿孔當(dāng)天解凍PBMC并且以1x106個細(xì)胞/mL的密度靜置于無細(xì)胞因子的培養(yǎng)基完全RPMI-1640中2小時。靜置期之后，在200xg下離心細(xì)胞8分鐘，然后再懸浮于培養(yǎng)基中并且使用自動細(xì)胞計數(shù)器(Cellometer，自動T4細(xì)胞計數(shù)器，Nexcelcom)通過臺盼藍(lán)排除來計數(shù)。再次離心PBMC并且以2x108/mL再懸浮于人T細(xì)胞電穿孔緩沖液(Lonza，目錄號VPA-1002)中，然后將100μL細(xì)胞懸液與15μg轉(zhuǎn)座子(Cetux-或Nimo-CAR)和5μgSB11轉(zhuǎn)座酶混合，轉(zhuǎn)移到電穿孔槽中并且使用用于未刺激的人T細(xì)胞的程序U-014，經(jīng)由AmaxaNucleofector(Lonza)進(jìn)行電穿孔。電穿孔之后，將細(xì)胞立即轉(zhuǎn)移到補(bǔ)充有20％熱滅活的FBS(HyClone)和2mMGlutamax-100(Gibco)的無苯酚的RPMI中以便回收過夜。次日，通過流式細(xì)胞術(shù)就CD3和Fc(以測定CAR表達(dá))對細(xì)胞進(jìn)行分析以便測定轉(zhuǎn)座子的瞬時表達(dá)。CAR+T細(xì)胞的刺激和培養(yǎng)。在電穿孔之后二十四小時，用100Gy輻照的EGFR+K562克隆27人工抗原呈遞細(xì)胞(aAPC)在2個CAR+T細(xì)胞:1個aAPC的比率下刺激細(xì)胞。在通過流式細(xì)胞術(shù)評價CAR表達(dá)之后每7-9天再刺激T細(xì)胞。整個培養(yǎng)期間，T細(xì)胞每2-3天接受添加到培養(yǎng)物中的30ng/mLIL-21(Peprotech,RockyHill,NJ)。每2-3天，IL-2(Aldeleukin,Novartis,Switzerland)以50U/mL在第二刺激周期之后添加到培養(yǎng)物中。在第14天，就NK細(xì)胞的存在對培養(yǎng)物進(jìn)行評估，其被指定為存在于培養(yǎng)物中的CD3negCD56+細(xì)胞。如果NK細(xì)胞代表>10％的細(xì)胞群體，那么通過用CD56特異性磁珠(MiltenyiBiotec)標(biāo)記NK細(xì)胞并在LS柱(MiltenyiBiotec)上分選來進(jìn)行NK細(xì)胞耗竭。通過含有CAR+T細(xì)胞的陰性流的流式細(xì)胞術(shù)證實來自培養(yǎng)物的NK細(xì)胞亞群的成功耗竭。當(dāng)CAR在>85％的CD3+T細(xì)胞上表達(dá)時，通常在5個刺激周期之后，評估培養(yǎng)物的功能。RNA的體外轉(zhuǎn)錄。將CetuxCD28mZ/pGEM-A64、NimoCD28mZ/pGEM-A64或GFP/pGEM-A64在37℃下用SpeI消化4小時以提供用于體外RNA轉(zhuǎn)錄的線性模板。通過在0.8％瓊脂糖凝膠中的瓊脂糖凝膠電泳和單條帶的存在證實模板的完全線性化，并通過QiaQuickPCR純化(Qiagen)純化剩余的消化物并且以小體積洗脫以獲得0.5μg/μL的濃度。根據(jù)制造商方案，使用T7mMACHINEmMESSAGEUltra(Ambion,LifeTechnologies，目錄號AM1345)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)并且在37℃下孵育2小時。在mRNA轉(zhuǎn)錄之后，通過添加以1單位/μgDNA模板的供應(yīng)的TurboDNA酶降解DNA模板并在37℃下再孵育30分鐘。使用RNeasy微型試劑盒(Qiagen)純化轉(zhuǎn)錄的RNA。通過分光光度法測定濃度和純度(OD260/280值＝2.0-2.2)并且在-80℃下在單解凍的等分試樣中冷凍。通過以下操作評估RNA產(chǎn)物的質(zhì)量：在含甲醛的瓊脂糖凝膠(1％瓊脂糖、10％10xMOPS運行緩沖液、6.7％甲醛)上在75伏下在1xMOPS運行緩沖液中凝膠電泳80分鐘，并且目測單個劃出的條帶。多克隆T細(xì)胞擴(kuò)增。通過用100Gy輻照的K562克隆4的培養(yǎng)實現(xiàn)不依賴于抗原的T細(xì)胞的數(shù)值擴(kuò)增，該克隆裝載有通過交聯(lián)CD3遞送增殖性刺激的OKT3。每7-10天以10:1或1:2T細(xì)胞:aAPC的密度添加aAPC，每2-3天添加50U/mLIL-2。在整個培養(yǎng)期間進(jìn)行培養(yǎng)基更換以將T細(xì)胞保持在0.5-2x106個細(xì)胞/mL之間的密度下。RNA電轉(zhuǎn)移到T細(xì)胞中。在RNA轉(zhuǎn)移之前3-5天，通過如上所述與100Gy輻照的OKT3-裝載的K562克隆4共培養(yǎng)使T細(xì)胞經(jīng)歷刺激。在電轉(zhuǎn)移之前，收獲T細(xì)胞并且使用自動細(xì)胞計數(shù)器(Cellometer，自動T4細(xì)胞計數(shù)器，Nexcelcom)通過臺盼藍(lán)排除來計數(shù)。在細(xì)胞制備期間，將RNA從-80℃冷凍器中移出并在冰上解凍。將T細(xì)胞在90xg下離心10分鐘，并且小心地吸出上清液以確保完全去除而不會破壞細(xì)胞沉淀。將T細(xì)胞懸浮在P3原代細(xì)胞4D-Nucleofector緩沖液(Lonza，目錄號V4XP-3032)中至1x108/mL的濃度并且將20μL每個T細(xì)胞懸液與3μg體外轉(zhuǎn)錄的RNA混合，然后轉(zhuǎn)移到Nucleofector槽帶(Lonza，目錄號V4XP-3032)。使用程序DQ-115在Amaxa4DNucleofector(Lonza)中對細(xì)胞進(jìn)行電穿孔，然后使其靜置在槽中長達(dá)15分鐘。靜置期之后，將溫恢復(fù)培養(yǎng)基，補(bǔ)充有2mMGlutamax-100(Gibco)和20％熱滅活的FBS(HyClone)的無苯酚的RPMI1640(HyClone)添加到槽中并將細(xì)胞輕輕地轉(zhuǎn)移到含有恢復(fù)培養(yǎng)基的6孔板中并轉(zhuǎn)移到組織培養(yǎng)孵育箱中。4小時之后，添加50U/mLIL-2和30ng/mLIL-21到T細(xì)胞中。RNA轉(zhuǎn)移之后四至二十四小時，通過用于Fc的流式細(xì)胞術(shù)就CAR的表達(dá)對T細(xì)胞進(jìn)行分析。在RNA轉(zhuǎn)移后24小時時進(jìn)行所有功能測定。免疫染色和流式細(xì)胞術(shù)獲取和分析。在FACSCalibur(BDBiosciences,SanJose,CA)上收集流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)并使用CellQuest軟件(3.3版,BDBiosciences)獲取。使用FlowJo軟件(x.0.6版,TreeStar,Ashland,OR)進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)的分析。表面免疫染色和抗體。(除非另有說明)用在以下稀釋度下綴合至以下染料的單克隆抗體進(jìn)行高達(dá)1x106個細(xì)胞的免疫染色：熒光素(FITC，1:25)、藻紅蛋白(PE，1:40)、綴合至花青染料的多甲藻素葉綠素蛋白(PerCPCy5.5，1:25)、別藻藍(lán)蛋白(APC，1:40)、AlexaFluor488(1:20)、AlexaFluor647(1:20)。除非另有說明，否則所有抗體都購自BDBiosciences。使用對以下各物有特異性的抗體：CD3(克隆SK7)、CD4(克隆RPA-T4)、CD8(克隆SK1)、CD19(HIB19)、CD27(克隆L128)、CD28(克隆L293)、CD45RA(克隆HI100)、CD45RO(克隆HI100)、CD56(克隆B159)、CD62L(克隆DREG-56)、CCR7(克隆GD43H7，Biolegend,SanDiego，用CARPerCPCy5.5以1:45稀釋)、EGFR(克隆EGFR.1，用PE以1:13.3稀釋)、Fc(以檢測CAR，克隆HI10104，Invitrogen)、IL15(克隆34559，R&DSystems,Minneapolis,MN，用PE以1:20稀釋)、鼠F(ab’)2(以檢測裝載在K562上的OKT3，JacksonImmunoresearch,WestGrove,PA，目錄號115-116-072，用PE以1:100稀釋)、TNF-α(克隆mAb11，1:40PE稀釋)和IFN-γ(克隆27，1:66.7APC稀釋)、pErk1/2(克隆20A，AlexaFluor647)、pp38(克隆36/p38，PE)以及Ki-67(克隆B56，F(xiàn)ITC，1:20，BDBiosciences)。在4℃下，在黑暗中將表面分子在FACS緩沖液(PBS、2％FBS、0.5％疊氮化鈉)中染色30分鐘。定量流式細(xì)胞術(shù)。使用QuantumSimplyCellular聚苯乙烯珠(BangsLaboratories,Fishers,IN)進(jìn)行定量流式細(xì)胞術(shù)。提供五個珠群，四個群具有增加量的抗鼠IgG及由此已知的抗體結(jié)合能力(ABC)和一個空白群。用飽和濃度(1:3稀釋，按照制造商建議)的珠孵育EGFR-PE(BDBiosciences，目錄號555997)，同時對靶細(xì)胞進(jìn)行免疫染色。結(jié)合至微球的EGFR-PE的MFI被用于生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，使用QuickCal數(shù)據(jù)分析程序(2.3版，BangsLaboratories)將線性回歸擬合至該標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖35)。將結(jié)合至靶細(xì)胞的EGFR-PE的所測量的MFI減去本底自體熒光量施加于線性回歸產(chǎn)生每細(xì)胞表達(dá)的EGFR分子的平均數(shù)量。細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色和流式細(xì)胞術(shù)。在4000x稀釋的GolgiStop(BDBiosciences)存在下將T細(xì)胞與靶細(xì)胞以1:1的比率共培養(yǎng)4-6小時。非刺激的T細(xì)胞充當(dāng)陰性對照，而用含有1000x稀釋的PMA/離子霉素和布雷菲德菌素A(BDBiosciences)的用白細(xì)胞活化混合物處理的T細(xì)胞充當(dāng)陽性對照。EGFR特異性單克隆抗體(克隆LA1，Millipore)用于阻斷CAR與EGFR的相互作用。細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色如下進(jìn)行：在4℃下在黑暗中通過在Cytofix/Cytoperm緩沖液(BDBiosciences)中固定/透化20分鐘進(jìn)行表面免疫染色，繼之以在4℃下、在黑暗中在1xPerm/洗滌緩沖液(BDBiosciences)中進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色30分鐘。所用抗體是TNF-α(BDBiosciences，克隆mAb11，用PE以1:40稀釋)和IFN-γ(BDBiosciences，克隆27，用APC以1:66.7稀釋)。細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色之后，將細(xì)胞用0.5％多聚甲醛(CytoFix,BDBiosciences)固定直到在FACSCalibur上獲取樣品。通過流式細(xì)胞術(shù)測量磷酸化。除非另有說明，否則將T細(xì)胞與靶細(xì)胞在1:1的比率下共培養(yǎng)45分鐘?；罨螅?00xg下離心T細(xì)胞5min并且傾析上清液。通過添加20體積的1xPhosFlow裂解/固定緩沖液(BDBiosciences)裂解并固定T細(xì)胞，預(yù)溫至37℃并且在37℃下孵育10分鐘。離心之后，通過添加冰冷的PhosFlowPermIII緩沖液(BDBiosciences)對細(xì)胞進(jìn)行透化，同時在黑暗中在冰上渦流并孵育20分鐘。孵育之后，用FACS緩沖液洗滌細(xì)胞并且再懸浮于100μL染色溶液中。染色溶液由針對CD4(克隆SK3，F(xiàn)ITC)、CD8(克隆SK1，PerCPCy5.5)、pErk1/2(克隆20A，AlexaFluor647)、pp38(克隆36/p38，PE)的抗體和FACS緩沖液組成，所有都以相同比率存在并且在室溫下在黑暗中孵育20分鐘。用0.5％多聚甲醛固定細(xì)胞并且在24小時之內(nèi)通過流式細(xì)胞術(shù)分析。存活力染色。膜聯(lián)蛋白V(BDBiosciences)和7-AAD(BDBiosciences)的染色用于測定細(xì)胞存活力并且在1x膜聯(lián)蛋白結(jié)合緩沖液中進(jìn)行，在室溫下在黑暗中針對CD4或CD8染色20分鐘?；罴?xì)胞的百分比被測定為在CD4或CD8門控T細(xì)胞群中的AnnexinVneg7-AADneg％。對于細(xì)胞增殖標(biāo)記物Ki-67的染色。通過細(xì)胞內(nèi)流式細(xì)胞術(shù)測量增殖標(biāo)記物Ki-67。將T細(xì)胞與粘附靶細(xì)胞以1:5的比率共培養(yǎng)36小時，然后通過去除上清液并在300xg下離心從培養(yǎng)物中收獲T細(xì)胞。然后通過逐滴添加冰冷的70％乙醇同時在高速下渦流來固定并透化T細(xì)胞。然后在染色之前將T細(xì)胞貯藏在-20℃下持續(xù)2-24小時。將細(xì)胞在室溫下在黑暗中在100μLFAC緩沖液中用Ki-67(克隆B56，F(xiàn)ITC，1:20，BDBiosciences)、CD4(克隆RPA-T4)及CD8(克隆SK1)染色30min，然后立即通過流式細(xì)胞術(shù)來分析。T細(xì)胞功能測定CAR下調(diào)。收獲CAR+T細(xì)胞和靶標(biāo)并且使用自動細(xì)胞計數(shù)器(Cellometer，自動T4細(xì)胞計數(shù)器，Nexcelcom)通過臺盼藍(lán)排除來計數(shù)，然后以1:1比率在12孔板中混合，并且在每個時間點收獲單個孔以測量T細(xì)胞上的CAR表面表達(dá)。用于下調(diào)的陰性對照是無刺激涂鋪的T細(xì)胞。通過CD3、CD4和CD8表達(dá)對T細(xì)胞染色以及通過Fc對CAR共染色是在流式細(xì)胞儀上分析的。CAR的下調(diào)百分比被計算為[刺激之后的CAR表達(dá)]/[無刺激的CAR表達(dá)]x100。二次活化和細(xì)胞因子產(chǎn)生。收獲CAR+T細(xì)胞和粘附靶標(biāo)并且使用自動細(xì)胞計數(shù)器(Cellometer，自動T4細(xì)胞計數(shù)器，Nexcelcom)通過臺盼藍(lán)排除來計數(shù)，然后以1:1的比率在12孔板中混合。共培養(yǎng)24小時之后，通過去除上清液并用PBS洗滌粘附細(xì)胞從培養(yǎng)中收獲T細(xì)胞。在300xg下旋轉(zhuǎn)T細(xì)胞5分鐘，然后再懸浮于培養(yǎng)基中并且使用自動細(xì)胞計數(shù)器(Cellometer，自動T4細(xì)胞計數(shù)器，Nexcelcom)通過臺盼藍(lán)排除來計數(shù)。用靶標(biāo)以1:1比率刺激T細(xì)胞并且如上所述分析細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子產(chǎn)生。長期細(xì)胞毒性測定。在開始測定的前一天，收獲粘附的U87和U87high細(xì)胞，計數(shù)，并且將40,000個靶細(xì)胞涂鋪在6孔板的每個孔中的完全DMEM內(nèi)并在組織培養(yǎng)孵育箱中孵育過夜。在測定當(dāng)天，收獲CAR+T細(xì)胞，通過臺盼藍(lán)排除計數(shù)，并且以1:5E:T比率添加到涂鋪的靶細(xì)胞中。陰性對照孔中沒有添加T細(xì)胞。在每個測定時間點，通過丟棄上清液并用PBS洗滌孔來去除T細(xì)胞。通過0.05％胰蛋白酶-EDTA(Gibco)從孔中分離粘附細(xì)胞。進(jìn)行顯微鏡檢查以目測確保細(xì)胞從孔中完全分離。將收獲的細(xì)胞旋轉(zhuǎn)沉降并且再懸浮于100μL培養(yǎng)基中，然后使用血球計通過臺盼藍(lán)排除來計數(shù)。存活細(xì)胞百分比被計算為[T細(xì)胞共培養(yǎng)之后的細(xì)胞數(shù)目]/[沒有T細(xì)胞共培養(yǎng)的細(xì)胞數(shù)目]x100。鉻釋放測定。特異性細(xì)胞毒性經(jīng)由標(biāo)準(zhǔn)4小時鉻釋放測定來評價，如先前所述(Singh等人,2008)。收獲靶細(xì)胞并且使用自動細(xì)胞計數(shù)器(Cellometer，自動T4細(xì)胞計數(shù)器)通過臺盼藍(lán)排除來計數(shù)。將不少于250,000個細(xì)胞等分，然后在300xg下離心5分鐘并丟棄上清液。隨后，將0.1μCi的51Cr添加到每個靶標(biāo)中并且在37℃下在組織培養(yǎng)孵育箱中孵育1-1.5小時。將每孔100,000個T細(xì)胞一式三份涂鋪并且以1:2比率連續(xù)稀釋以在96孔V形底板(Corning,Corning,NY)中得到20:1、10:1、5:1、2.5:1及1.25:1的最終效應(yīng)物與靶標(biāo)(E:T)比率，并置于組織培養(yǎng)孵育箱中。僅將培養(yǎng)基置于孔中用于最小鉻釋放對照。用鉻標(biāo)記之后，將靶標(biāo)用10mLPBS洗滌三次，然后以125,000個細(xì)胞/mL的最終濃度再懸浮，充分混合，并將100μL添加到每排中，包括所有含T細(xì)胞的排、最小釋放排及最大釋放排。在300xg下離心板3分鐘。離心之后，將100μL的0.1％TritonX-100(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)添加到最大釋放排中，并且將板置于組織培養(yǎng)孵育箱中4小時。孵育之后，然后通過小心地去除50μL上清液而沒有破壞細(xì)胞沉淀來收獲板，并且將板轉(zhuǎn)移到LumaPlate-96(Perkin-Elmer,Waltham,MA)中并使其干燥過夜。次日，用頂部密封件(Perkin-Elmer)密封板并且在TopCountNXT(Perkin-Elmer)上測量閃爍。特異性裂解百分比被計算為[(所釋放的51Cr-最小值)/(最大值-最小值)]x100，其中最大值和最小值是每一式三份的平均值。高通量基因表達(dá)和CDR3測序通過mRNA轉(zhuǎn)錄物的直接成像對基因表達(dá)分析。如先前所述(319-322)進(jìn)行mRNA分子的直接成像和量化。通過分別用CD4和CD8磁珠(MiltenyiBiotec)孵育并在LS柱上分選就CD4和CD8表達(dá)在擴(kuò)增之前或之后對細(xì)胞進(jìn)行陽性分選。流式細(xì)胞術(shù)用于證實CD4和CD8分離的群體的純度。將1x106個T細(xì)胞在165μL的RLT緩沖液(Qiagen)中裂解并且在-80℃下以單次解凍的等分試樣冷凍。將RNA裂解物解凍并在65℃下與多重靶標(biāo)特異性、顏色編碼的報道基因和生物素化的捕獲探針雜交12小時。鑒定目標(biāo)淋巴細(xì)胞特異性mRNA轉(zhuǎn)錄物并且將由RefSeq登錄物生成的兩個編碼集用于生成報道基因和捕獲探針對、淋巴細(xì)胞編碼集以及TCRVα和Vβ編碼集。淋巴細(xì)胞編碼集含有用于以下基因的探針：ABCB1；ABCG2；ACTB；ADAM19；AGER；AHNAK；AIF1；AIM2；AIMP2；AKIP1；AKT1；ALDH1A1；ANXA1；ANXA2P2；APAF1；ARG1；ARRB2；ATF3；ATM；ATP2B4；AXIN2；B2M；B3GAT1；BACH2；BAD；BAG1；BATF；BAX；BCL10；BCL11B；BCL2；BCL2L1；BCL2L1；BCL2L11；BCL2L11；BCL6；BCL6B；BHLHE41；BID；BIRC2；BLK；BMI1；BNIP3；BTLA；C21orf33；CA2；CA9；CARD9；CASP1；CAT；CBLB；CCBP2；CCL3；CCL4；CCL5；CCNB1；CCND1；CCR1；CCR2；CCR4；CCR5；CCR6；CCR7；CD160；CD19；CD19R-scfv；CD19RCD28；CD2；CD20-scfv利妥昔單抗)；CD226；CD244；CD247；CD27；CD274；CD276；CD28；CD300A；CD38；CD3D；CD3E；CD4；CD40LG；CD44；CD45R-scfv；CD47；CD56R-scfv；CD58；CD63；CD69；CD7；CD80；CD86；CD8A；CDH1；CDK2；CDK4；CDKN1A；CDKN1B；CDKN2A；CDKN2C；CEBPA；CFLAR；CFLAR；CHPT1；CIITA；CITED2；CLIC1；CLNK；c-MET-scfv；CREB1；CREM；CRIP1；CRLF2；CSAD；CSF2；CSNK2A1；CTGF；CTLA4；CTNNA1；CTNNB1；CTNNBL1；CTSC；CTSD；CX3CL1；CX3CR1；CXCL10；CXCL12；CXCL9；CXCR1；CXCR3；CXCR4；DAPL1；DEC1；DECTIN-1R；DGKA；DOCK5；DOK2；DPP4；DUSP16；EGFR-scfv(NIMOCAR)；EGLN1；EGLN3；EIF1；ELF4；ELOF1；ENTPD1；EOMES；EPHA2；EPHA4；EPHB2；ETV6；FADD；FAM129A；FANCC；FAS；FASLG；FCGR3B；FGL2；FLT1；FLT3LG；FOS；FOXO1；FOXO3；FOXP1；FOXP3；FYN；FZD1；G6PD；GABPA；GADD45A；GADD45B；GAL3ST4；GAS2；GATA2；GATA3；gBAD-1R-scfv；GEMIN2；GFI1；GLIPR1；GLO1；GNLY；GSK3B；GZMA；GZMB；GZMH；HCST；HDAC1；HDAC2；HER2-scfv；HERV-K6H5-scfv；HLA-A；HMGB2；HOPX；HOXA10；HOXA9；HOXB3；HOXB4；HPRT1；HRH1；HRH2；人CD19R-scfv；ICOS；ICOSLG；ID2；ID3；IDO1；IFNA1；IFNG；IFNGR1；IGF1R；IKZF1；IKZF2；IL10；IL10RA；IL12A；IL12B；IL12RB1；IL12RB2；IL13；IL15；IL15RA；IL17A；IL17F；IL17RA；IL18；IL18R1；IL18RAP；IL1A；IL1B；IL2；IL21R；IL22；IL23A；IL23R；IL27；IL2RA；IL2RB；IL2RG；IL4；IL4R；IL5；IL6；IL6R；IL7R；IL9；IRF1；IRF2；IRF4；ITCH；ITGA1；ITGA4；ITGA5；ITGAL；ITGAM；ITGAX；ITGB1；ITGB7；ITK；JAK1；JAK2；JAK3；JUN；JUNB；KIR2DL1；KIR2DL2；KIR2DL3；KIR2DL4；KIR2DL5A；KIR2DS1；KIR2DS2；KIR2DS3；KIR2DS4；KIR2DS5；KIR3DL1；KIR3DL2；KIR3DL3；KIR3DS1；KIT；KLF10；KLF2；KLF4；KLF6；KLF7；KLRAP1；KLRB1；KLRC1；KLRC2；KLRC3；KLRC4；KLRD1；KLRF1；KLRG1；KLRK1；LAG3；LAIR1；LAT；LAT2；LCK；LDHA；LEF1；LGALS1；LGALS3；LIFR；LILRB1；LOC282997；LRP5；LRP6；LRRC32；LTA；LTBR；LYN；MAD1L1；MAP2K1；MAPK14；MAPK3；MAPK8；MBD2；MCL1；MIF；MMP14；MPL；MTOR；MXD1；MYB；MYC；MYO6；NANOG；NBEA；NCAM1；NCL；NCR1；NCR2；NCR3；NCRNA00185；NEIL1；NEIL2；NFAT5；NFATC1；NFATC2；NFATC3；NFKB1；NOS2；NOTCH1；NR3C1；NR4A1；NREP；NRIP1；NRP1；NT5E；OAZ1；OPTN；P2RX7；PAX5；PDCD1；PDCD1LG2；PDE3A；PDE4A；PDE7A；PDK1；PDXK；PECAM1；PHACTR2；PHC1；POLR1B；POLR2A；POP5；POU5F1；PPARA；PPP2R1A；PRDM1；PRF1；PRKAA2；PRKCQ；PROM1；PTGER2；PTK2；PTPN11；PTPN4；PTPN6；PTPRK；RAB31；RAC1；RAC2；RAF1；RAP1GAP2；RARA；RBPMS；RHOA；RNF125；RORA；RORC；RPL27；RPS13；RUNX1；RUNX2；RUNX3；S100A4；S100A6；SATB1；SCML1；SCML2；SEL1L；SELL；SELPLG；SERPINE2；SH2B3；SH2D2A；SIT1；SKAP1；SKAP2；SLA2；SLAMF1；SLAMF7；SLC2A1；SMAD3；SMAD4；SNAI1；SOCS1；SOCS3；SOD1；SOX13；SOX2；SOX4；SOX5；SPI1；SPN；SPRY2；STAT1；STAT3；STAT4；STAT5A；STAT5B；STAT6；STMN1；SYK；TAL1；TBP；TBX21；TBXA2R；TCF12；TCF3；TCF7；TDGF1；TDO2；TEK；TERF1；TERT；TF；TFRC；TGFA；TGFB1；TGFB2；TGFBR1；胸苷激酶；TIE1；TLR2；TLR8；TNF；TNFRSF14；TNFRSF18；TNFRSF1B；TNFRSF4；TNFRSF9；TNFSF10；TNFSF11；TNFSF14；TOX；TP53；TRAF1；TRAF2；TRAF3；TSC22D3；TSLP；TXK；TYK2；TYROBP；UBASH3A；VAX2；VEGFA；WEE1；XBP1；XBP1；YY1AP1；ZAP70；ZBTB16；ZC2HC1A；ZEB2；ZNF516。TCRVα和Vβ編碼集含有用于以下基因的探針：TRAV1-1；TRAV1-2；TRAV2；TRAV3；TRAV4；TRAV5；TRAV6；TRAV7；TRAV8-1；TRAV8-2；TRAV8-3；TRAV8-6；TRAV9-1；TRAV9-2；TRAV10；TRAV11；TRAV12-1；TRAV12-2；TRAV12-3；TRAV13-1；TRAV13-2；TRAV14；TRAV16；TRAV17；TRAV18；TRAV19；TRAV20；TRAV21；TRAV22；TRAV23；TRAV24；TRAV25；TRAV26-1；TRAV26-2；TRAV27；TRAV29；TRAV30；TRAV34；TRAV35；TRAV36；TRAV38-1；TRAV38-2；TRAV39；TRAV40；TRAV41；TRBV2；TRBV3-1；TRBV4-1；TRBV4-2；TRBV4-3；TRBV5-1；TRBV5-4；TRBV5-5；TRBV5-6；TRBV5-8；TRBV6-1；TRBV6-2；TRBV6-4；TRBV6-5；TRBV6-6；TRBV6-8；TRBV6-9；TRBV7-2；TRBV7-3；TRBV7-4；TRBV7-6；TRBV7-7；TRBV7-8；TRBV7-9；TRBV9；TRBV10-1；TRBV10-2；TRBV10-3；TRBV11-1；TRBV11-2；TRBV11-3；TRBV12-3；TRBV12-5；TRBV13；TRBV14；TRBV15；TRBV16；TRBV18；TRBV19；TRBV20-1；TRBV24-1；TRBV25-1；TRBV27；TRBV28；TRBV29-1；TRBV30。雜交之后，將樣品在nCounterPrep(NanoStringTechnologies,Seattle,WA)中處理，并在nCounter數(shù)字分析儀(nCounterDigitalAnalyzer)(NanoStringTechnologies)中分析。鑒定參照基因，其跨越以下大范圍的RNA表達(dá)水平：ACTB、G6PD、OA21、POLR1B、RPL27、RPS13及TBP，并且用于歸一化數(shù)據(jù)。使用nCounterRCCCollector(1.6.0版,NanoStringTechnologies)針對陽性基因、陰性基因及管家基因進(jìn)行歸一化。針對數(shù)字基因表達(dá)圖譜表征的統(tǒng)計檢驗用于確定樣品對之間的基因差異表達(dá)(O’Connor等人,2012；Audic等人,1997)。歸一化之后，通過p<0.01與在至少2/3對中大于1.5的倍數(shù)變化的組合鑒定淋巴細(xì)胞編碼集中的顯著的差異基因表達(dá)，如先前所述(O’Connor等人,2012)。通過分級聚類和TreeView軟件1.1版進(jìn)行差異性RNA轉(zhuǎn)錄物的歸一化值的熱作圖(Eisen等人,1998)。歸一化之后，TCRVα和Vβ的百分比來源于計數(shù)數(shù)據(jù)，如先前所述(Zhang等人,2012)。高通量CDR3深度測序。擴(kuò)增TCRβCDR3區(qū)并從1x106個T細(xì)胞提取的DNA測序(QiagenDNeasy血液和組織試劑盒，Qiagen)并且在ImmunoSEQ平臺(AdaptiveTechnologies,Seattle,WA)上進(jìn)行，如先前所述(Robins等人,2009)。在顱內(nèi)神經(jīng)膠質(zhì)瘤異種移植物鼠模型中的T細(xì)胞的體內(nèi)評估在批準(zhǔn)的動物方案ACUF下，在MDAnderson癌癥中心的實驗動物照管與使用委員會(InstitutionalAnimalCareandUseCommittee)(IACUC)的指導(dǎo)和規(guī)定下進(jìn)行所有動物實驗。所用的所有小鼠都是7-8周齡的雌性NOD.Cg-PrkdcscidIL2Rγtm1Wjl/Sz品系(NSG)(JacksonLaboratory,BarHarbor,ME)。導(dǎo)螺桿的植入。使用劑量為0.1mL/10g的氯胺酮/賽拉嗪混合物(10mg/mL氯胺酮，0.5mg/mL賽拉嗪)麻醉7-8周齡的小鼠。如先前所述進(jìn)行導(dǎo)螺桿的植入(Lal等人,2000)。一旦對刺激無反應(yīng)，便通過剃去毛發(fā)來制備頭部的手術(shù)區(qū)域并用聚維酮-碘(聚乙烯吡咯烷酮與元素碘復(fù)合)抗菌溶液處理。使用手術(shù)無菌技術(shù)，在頭蓋骨的中間作出一個1cm的切口。使用1mm鉆頭(DH#60,PlasticsOne,Roanoke,VA)作出一個開口，使用穩(wěn)固的環(huán)形壓力從鉆孔(DH-0,PlasticsOne)延伸1mm。使用螺絲刀(SD-80,PlasticsOne)將在中心有0.50mm開口和1.57mm軸徑的導(dǎo)螺桿(PlasticsOne，目錄號C212SG)插入鉆頭部位中。縫合切口部位并且給予小鼠劑量為0.1mL/10g的0.01mg/mL丁丙諾啡作為術(shù)后鎮(zhèn)痛藥。將小鼠在低功率熱源上從手術(shù)中恢復(fù)直到恢復(fù)完全移動性。U87-ffLucm-Kate或U87med-ffLuc-mKate腫瘤細(xì)胞的植入。確定在顱內(nèi)腫瘤之前2-3周小鼠從導(dǎo)螺桿植入中恢復(fù)，如先前所述(Lal等人,2000)。在室溫下用無酶的細(xì)胞解離緩沖液PBS(Gibco)孵育10分鐘之后，將U87-ffLuc-mKate或U87med-ffLuc-mKate從組織培養(yǎng)容器中分離。使用血球計通過臺盼藍(lán)排除對細(xì)胞計數(shù)并在200xg下離心8分鐘。離心之后，將細(xì)胞再懸浮于無菌PBS中至50,000個細(xì)胞/μL的最終濃度。用異氟烷(2-氯代-2-(二氟甲氧基)-1,1,1-三氟-乙烷)使小鼠麻醉，并且如上所述為切口做準(zhǔn)備。在小鼠經(jīng)歷手術(shù)準(zhǔn)備時，通過在距離注射器末端2.5mm處放置塑料防護(hù)器并且裝載含有250,000個細(xì)胞的5μL細(xì)胞懸液來準(zhǔn)備具有鈍針的26號的10μLHamilton注射器(HamiltonCompany,Reno,NV目錄號80300)。在打開切口部位后，將注射器插入導(dǎo)螺桿開口中并且以恒定緩慢的壓力注射細(xì)胞。注射完成之后，將注射器就地額外30秒以使顱內(nèi)壓力消散，然后慢慢移除。縫合切口并將小鼠從異氟烷暴露中移除。植入之日被指定為研究第0天。在第1和第4天，如上所述經(jīng)由非侵入式生物發(fā)光成像對腫瘤進(jìn)行成像以確保成功的腫瘤植入。然后將小鼠分成三個組以均勻地分布相對腫瘤通量，接著隨機(jī)分配以接受Cetux-CAR+T細(xì)胞治療、Nimo-CAR+T細(xì)胞治療和無治療。U87-ffLuc-mKate或U87med-ffLuc-mKate的非侵入式生物發(fā)光成像。對顱內(nèi)神經(jīng)膠質(zhì)瘤進(jìn)行非侵入式和依序成像并用作相對腫瘤負(fù)荷的量度。在215μgD-熒光素鉀鹽(CaliperLifeSciences,Perkin-Elmer)皮下注射之后十分鐘，使用Xenogen譜(CaliperLifeSciences,Perkin-Elmer)和LivingImage軟件(2.50版,CaliperLifeSciences,Perkin-Elmer)測量腫瘤通量(光子/s/cm2/球面度)。在包括整個小鼠顱骨區(qū)的所劃定的目標(biāo)區(qū)域中測量腫瘤通量。將CAR+T細(xì)胞顱內(nèi)遞送到建立的U87-ffLuc-mKate或U87med-ffLuc-mKate神經(jīng)膠質(zhì)瘤中。在建立腫瘤第5天開始顱內(nèi)神經(jīng)膠質(zhì)瘤異種移植物的治療并持續(xù)每周一次，總共3次T細(xì)胞注射。已完成3個刺激周期的CAR+T細(xì)胞通過流式細(xì)胞術(shù)被證實有>85％CAR表達(dá)，然后使用自動細(xì)胞計數(shù)器(Cellometer，自動T4細(xì)胞計數(shù)器，Nexcelcom)通過臺盼藍(lán)排除對活細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。將CAR+T細(xì)胞在300xg下旋轉(zhuǎn)5分鐘，并且以0.6x106/μL的濃度再懸浮于無菌PBS中。如上所述為顱骨切口對小鼠做準(zhǔn)備，并通過異氟烷暴露來麻醉。在準(zhǔn)備小鼠時，通過在距離注射器末端2.5mm處放置塑料防護(hù)器并且裝載含有3x106個T細(xì)胞的5μL細(xì)胞懸液來準(zhǔn)備具有鈍針的26號的10μLHamilton注射器(HamiltonCompany，目錄號80300)。將注射器插入導(dǎo)螺桿中，延伸2.5mm到顱內(nèi)腔中，并且在緩慢的恒壓下注射。在注射器排空之后，將其就地保持額外30秒以使顱內(nèi)壓力消散。注射之后，縫合封閉切口并將小鼠從異氟烷暴露中移除。評價小鼠存活期。當(dāng)小鼠出現(xiàn)進(jìn)行性重量減輕(>25％體重)、快速的重量減輕(在48小時內(nèi)>10％體重減輕)或后肢麻痹、或以下疾病臨床癥狀的任意兩個時將小鼠處死：共濟(jì)失調(diào)、蜷縮姿勢、不規(guī)則的呼吸率、所暴露腫瘤的潰瘍、或直徑超過1.5cm的可觸知的腫瘤。統(tǒng)計學(xué)在GraphPadPrism,6.03版中進(jìn)行所有統(tǒng)計分析。所有體外細(xì)胞培養(yǎng)實驗的統(tǒng)計分析，包括細(xì)胞因子產(chǎn)生、存活力、增殖及表面表型的流式細(xì)胞術(shù)分析、細(xì)胞擴(kuò)增的動力學(xué)、長期細(xì)胞毒性、以及通過具有供體匹配和多重比較的Tukey氏事后檢驗的雙因素ANOVA的鉻釋放測定。功能與抗原密度的相關(guān)性是通過具有針對線性趨勢的事后檢驗的單因素ANOVA進(jìn)行。使用具有重復(fù)測量和針對多重比較的Sidak氏后檢驗的雙因素ANOVA進(jìn)行腫瘤的體內(nèi)生物發(fā)光成像分析。通過對數(shù)秩(Mantel-Cox)檢驗進(jìn)行動物存活期數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。結(jié)果的顯著性定義如下：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。實施例2–通過裝載有抗CD3的人工抗原呈遞細(xì)胞的T細(xì)胞的數(shù)值擴(kuò)增通過由DNA整合實現(xiàn)的穩(wěn)定CAR表達(dá)的抗原依賴性刺激可用于將CAR+T細(xì)胞數(shù)值擴(kuò)增至臨床上可行的數(shù)量。經(jīng)由RNA轉(zhuǎn)移的CAR表達(dá)的瞬時特性需要將T細(xì)胞數(shù)值擴(kuò)增至臨床上可行的數(shù)量以便在CAR的RNA轉(zhuǎn)移之前實現(xiàn)。為了測定aAPC數(shù)值擴(kuò)增不依賴于抗原的T細(xì)胞的能力，經(jīng)由高親和力Fc受體CD64的穩(wěn)定表達(dá)將抗CD3(OKT3)裝載到K562上(圖1A)。K562還表達(dá)CD86、41BB-L、以及膜結(jié)合的IL-15用于額外的T細(xì)胞共刺激。為了確定aAPC密度在共培養(yǎng)中刺激T細(xì)胞擴(kuò)增的影響，將來源于健康人供體的外周血單核細(xì)胞(PBMC)與低密度(10個T細(xì)胞比1個aAPC，10:1)或高密度(1個T細(xì)胞比2個aAPC，1:2)的γ-輻照的aAPC在IL-2存在下共培養(yǎng)。在9天之后用aAPC再刺激T細(xì)胞。aAPC添加兩個周期之后，當(dāng)用aAPC10:1和1:2刺激時T細(xì)胞進(jìn)行數(shù)值擴(kuò)增；然而，在更高密度的aAPC(1:2)下的T細(xì)胞實現(xiàn)統(tǒng)計上優(yōu)良的數(shù)值擴(kuò)增(10:1＝1083±420倍擴(kuò)增，1:2＝1891±376倍擴(kuò)增，平均值±S.D.，n＝6)(p<0.0001)(圖1B)。在較低密度的aAPC下擴(kuò)增的T細(xì)胞與在更多aAPC下擴(kuò)增的T細(xì)胞相比含有更高比例的CD8+T細(xì)胞(10:1＝53.9±11.6％CD8，1:2＝28.1±16.2％CD8，平均值±S.D.，n＝6)(p<0.001)(圖2A)。CD8+T細(xì)胞當(dāng)用任一比率的aAPC刺激時顯示相似的T細(xì)胞倍數(shù)擴(kuò)增，然而，CD4+T細(xì)胞當(dāng)用更少的aAPC刺激時顯示更低的倍數(shù)擴(kuò)增(10:1＝369±227CD4+倍擴(kuò)增，1:2＝1267±447CD4+倍擴(kuò)增，平均值±S.D.，n＝6)(p<0.0001)(圖2B)。為了確定降低的倍數(shù)擴(kuò)增是否歸因于在具有較少aAPC的培養(yǎng)物中增加的CD4+T細(xì)胞死亡，用膜聯(lián)蛋白V和碘化丙啶(PI)對CD4+和CD8+T細(xì)胞進(jìn)行染色并且通過流式細(xì)胞術(shù)來分析以確定細(xì)胞存活力。當(dāng)用低或高密度aAPC刺激時，在CD4+或CD8+T細(xì)胞中活細(xì)胞的比例無差異(圖2C)。為了確定降低的CD4+T細(xì)胞倍數(shù)擴(kuò)增是否歸因于降低的增殖速率，在用aAPC刺激之后9天對T細(xì)胞進(jìn)行染色用于細(xì)胞內(nèi)Ki-67表達(dá)并且通過流式細(xì)胞術(shù)來分析。當(dāng)用低或者高密度的aAPC刺激時，CD8+T細(xì)胞顯示相似的增殖，然而，當(dāng)用低密度aAPC刺激時相比于高密度aAPC，CD4+T細(xì)胞顯示減少的增殖(圖2D)。這些數(shù)據(jù)表明用低密度aAPC刺激T細(xì)胞與用高密度aAPC刺激的T細(xì)胞相比產(chǎn)生更少的總T細(xì)胞擴(kuò)增，其特征為由于CD4+T細(xì)胞響應(yīng)于低密度aAPC而增殖減少所致的增加的CD8+T細(xì)胞比例。實施例3–在更低密度aAPC下擴(kuò)增的T細(xì)胞顯示比用更高密度aAPC擴(kuò)增的T細(xì)胞更多的記憶樣表型。為了確定用低密度或高密度aAPC進(jìn)行的擴(kuò)增是否影響T細(xì)胞表型，使用nCounter分析(NanostringTechnologies,Seattle,WA)通過多路數(shù)字圖譜表征分析一組mRNA轉(zhuǎn)錄物(淋巴細(xì)胞特異性編碼集)的表達(dá)。顯著的差異基因表達(dá)通過p<0.01和在用低密度(10:1T細(xì)胞:aAPC)或高密度(1:2T細(xì)胞:aAPC)aAPC擴(kuò)增的分選CD4+或CD8+T細(xì)胞中倍數(shù)變化大于1.5來確定。用高密度aAPC擴(kuò)增的CD4+和CD8+T細(xì)胞顯示與T細(xì)胞活化有關(guān)的基因表達(dá)的增加，如在CD4+T細(xì)胞中的CD38和粒酶A以及在CD8+T細(xì)胞中的CD38和NCAM-1(圖3)。相比之下，用低密度aAPC擴(kuò)增的CD4+和CD8+T細(xì)胞顯示與中心記憶或首次用于試驗T細(xì)胞有關(guān)的基因表達(dá)增加，包括Wnt信號傳導(dǎo)途徑轉(zhuǎn)錄因子Lef1和Tcf7、CCR7、CD28及IL7Rα(Gattinoni等人,2009；Gattinoni等人,2012)。為了進(jìn)一步評估用低或高密度aAPC擴(kuò)增的T細(xì)胞的差異表型，通過流式細(xì)胞術(shù)就表型標(biāo)記物對T細(xì)胞進(jìn)行分析并且通過CCR7和CD45RA的共表達(dá)評估亞群，其中CCR7+CD45RA+表示首次用于試驗表型，CCR7+CD45RAneg表示中央記憶表型，CCR7negCD45RAneg表示效應(yīng)記憶，并且CCR7negCD45RA+表示CD45RA+效應(yīng)記憶表型(Geginat等人,2003)。用低密度aAPC擴(kuò)增的CD4+T細(xì)胞含有顯著更少的具有效應(yīng)記憶表型的T細(xì)胞(10:1＝61.9±9.1％，1:2＝92.1±3.9％，平均值±S.D.，n＝3)(p<0.05)，但更多的中央記憶表型(10:1＝36.5±9.4％，1:2＝13.6±2.4％，平均值±S.D.，n＝3)(p<0.05)T細(xì)胞(圖4A)。類似地，用低密度aAPC擴(kuò)增的CD8+T細(xì)胞含有顯著更少的具有效應(yīng)記憶表型的T細(xì)胞(10:1＝66.1±12.5％，1:2＝89.1±1.7％，平均值±S.D.，n＝3)(p<0.05)，但更多的中央記憶表型(10:1＝32.3±11.7％，1:2＝6.5±2.8％，平均值±S.D.，n＝3)(p<0.05)。用低密度aAPC刺激的顯著更少的CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生粒酶B(p<0.001)，而用低密度aAPC刺激的更少的CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生粒酶B(p<0.05)或穿孔素(p<0.001)(圖4B)。當(dāng)用PMA/離子霉素刺激時，用低和高密度aAPC擴(kuò)增的CD4+T細(xì)胞顯示IFN-γ、TNF-α及IL-2的等量產(chǎn)生，而用低密度aAPC刺激的CD8+T細(xì)胞顯示顯著更少的IFN-γ(p<0.001)和TNF-α(p<0.05)產(chǎn)生，但更多的IL-2(p<0.05)產(chǎn)生(圖4C)。總的來說，這些數(shù)據(jù)顯示用低密度aAPC擴(kuò)增的T細(xì)胞與用更高密度aAPC擴(kuò)增的T細(xì)胞相比含有增加比例的具有中央記憶表型的T細(xì)胞、效應(yīng)分子粒酶B和穿孔素的產(chǎn)生減少以及效應(yīng)細(xì)胞因子IFN-γ和TNF-α產(chǎn)生減少。實施例4–T細(xì)胞的數(shù)值擴(kuò)增產(chǎn)生TCRαβ多樣性的最小變化使用nCounter分析(NanostringTechnologies,Seattle,WA)通過多路數(shù)字圖譜表征在用低和高密度aAPC擴(kuò)增之前和之后以圖譜表征TCRα和TCRβ多樣性，并且將每條TCRα和TCRβ鏈的相對豐度計算為總T細(xì)胞群的百分比。在用低和高密度aAPC離體擴(kuò)增之后，CD4+和CD8+T細(xì)胞表達(dá)不同的TCRα和TCRβ等位基因，表明所得的群體保持寡克隆TCRα和TCRβ庫(圖5和圖6)。在用低和高密度aAPC擴(kuò)增之前和之后在T細(xì)胞的TCRβ鏈中使用ImmunoSEQ平臺(AdaptiveTCRTechnologies,Seattle,WA)進(jìn)行CDR3區(qū)的高通量測序以確定離體擴(kuò)增是否在T細(xì)胞的克隆組合物中產(chǎn)生變化。對擴(kuò)增之前和之后的單獨CDR3序列的相對計數(shù)作圖并且用線性回歸擬合。如果擴(kuò)增之前和之后的CDR3序列數(shù)目相同，那么線性回歸的斜率預(yù)期將為1.0。在用低密度aAPC擴(kuò)增的T細(xì)胞中，線性回歸的斜率是0.75±0.001，而在用高密度aAPC擴(kuò)增的T細(xì)胞中，線性回歸的斜率是0.29±0.003(圖7)。這表明用低密度aAPC擴(kuò)增的T細(xì)胞群保持比用高密度aAPC擴(kuò)增的T細(xì)胞更多的來自輸入T細(xì)胞群的CDR3序列?？傊?dāng)用低和高密度aAPC擴(kuò)增時，T細(xì)胞的離體擴(kuò)增產(chǎn)生寡克隆T細(xì)胞群，但用低密度aAPC擴(kuò)增的T細(xì)胞可在擴(kuò)增之后顯示較少的克隆損失。實施例5–RNA轉(zhuǎn)移到用aAPC數(shù)值擴(kuò)增的T細(xì)胞中為了測定用低和高密度aAPC刺激的T細(xì)胞通過電轉(zhuǎn)移接受RNA的能力，使用多種電穿孔程序(包括程序EO-115，制造商推薦的用于以aAPC刺激之后4天的受刺激的T細(xì)胞的程序)，使用AmaxaNucleofector4D轉(zhuǎn)染系統(tǒng)(Lonza,Cologne,Germany)電轉(zhuǎn)移編碼綠色熒光蛋白(GFP)的體外轉(zhuǎn)錄的RNA。用GFP的平均熒光強(qiáng)度(MFI)針對通過PI染色測定的T細(xì)胞存活力作圖揭示在RNA轉(zhuǎn)移之后GFP表達(dá)與T細(xì)胞存活力的負(fù)相關(guān)。與用低密度aAPC刺激的T細(xì)胞相比，用高密度aAPC刺激的T細(xì)胞顯示通過RNA轉(zhuǎn)移導(dǎo)致的GFP表達(dá)減少和響應(yīng)于所測試的每個電穿孔程序存活力降低(圖8A)。因此，用低密度aAPC(10個T細(xì)胞比1個aAPC)刺激的T細(xì)胞用于所有進(jìn)一步實驗中。因為需要在RNA轉(zhuǎn)移之前進(jìn)行T細(xì)胞數(shù)值擴(kuò)增以獲得供輸注的臨床上相關(guān)的T細(xì)胞數(shù)量，所以評價通過每9天循環(huán)添加aAPC經(jīng)歷多輪刺激的T細(xì)胞通過電轉(zhuǎn)移接受RNA轉(zhuǎn)錄物的能力。在每個連續(xù)輪次的刺激中，RNA電轉(zhuǎn)移之后的GFP表達(dá)減少(圖8B，左圖)。然而，兩輪刺激之后，T細(xì)胞與經(jīng)歷單輪刺激或三輪刺激的T細(xì)胞相比顯示電轉(zhuǎn)移之后的提高的存活力(圖8B，右圖)。因此，用10個T細(xì)胞比1個aAPC的兩輪刺激的刺激方案被選出用于進(jìn)一步優(yōu)化RNA轉(zhuǎn)錄物轉(zhuǎn)移。因為RNA與DNA相比對細(xì)胞的毒性較小并且更容易轉(zhuǎn)移到許多細(xì)胞類型中(165)，所以這就是RNA轉(zhuǎn)移效率可在不損害T細(xì)胞存活力下通過減小制造商推薦的用于刺激T細(xì)胞的電穿孔程序EO-115的強(qiáng)度而得以提高的原因。通過將表達(dá)GFP的細(xì)胞百分比針對通過PI染色測定的存活力進(jìn)行繪圖，鑒定在電穿孔之后24小時產(chǎn)生～100％GFP表達(dá)以及與未電穿孔的T細(xì)胞相似的T細(xì)胞存活力的程序為程序DQ-115(圖8C)。在用優(yōu)化方案電穿孔之后評價T細(xì)胞表型以確定RNA的電轉(zhuǎn)移是否將改變T細(xì)胞表型。在有或沒有RNA轉(zhuǎn)錄物下的電穿孔之后沒有檢測到T細(xì)胞表型的變化(圖8D)。因此，開發(fā)一種平臺用于將RNA轉(zhuǎn)移到經(jīng)由與aAPC共培養(yǎng)的數(shù)值擴(kuò)增之后的T細(xì)胞中，該平臺產(chǎn)生RNA轉(zhuǎn)錄物的高表達(dá)而不損害T細(xì)胞存活力。實施例6-通過DNA或RNA轉(zhuǎn)移修飾的T細(xì)胞的CAR表達(dá)和表型為了比較通過RNA和DNA修飾制造的CAR+T細(xì)胞的CAR表達(dá)和功能，由西妥昔單抗(一種臨床上可用的抗EGFR單克隆抗體)的scFv產(chǎn)生EGFR特異性CAR。西妥昔單抗的scFv融合至IgG4絞鏈區(qū)、CD28跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域、以及CD3-ζ胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域以形成第二代CAR，稱為Cetux-CAR，并且在睡美人轉(zhuǎn)座子中表達(dá)用于永久性DNA整合以及在T7啟動子下在pGEM/A64載體中用于RNA轉(zhuǎn)錄物的體外轉(zhuǎn)錄。T細(xì)胞的RNA修飾通過在第二刺激之后四天將體外轉(zhuǎn)錄的Cetux-CAR電轉(zhuǎn)移到用裝載OKT3的K562aAPC刺激兩次的T細(xì)胞中來實現(xiàn)(圖9A)。在電轉(zhuǎn)移之后24小時評估CAR表達(dá)。對于穩(wěn)定的DNA整合，將在SB轉(zhuǎn)座子中表達(dá)的Cetux-CAR用SB11轉(zhuǎn)座酶電穿孔到人原代T細(xì)胞中，SB11轉(zhuǎn)座酶是一種剪切和粘貼酶，其將CAR從轉(zhuǎn)座子上切除并在反向TA重復(fù)序列處插入宿主T細(xì)胞基因組中。用γ-輻照的EGFR+K562aAPC循環(huán)刺激產(chǎn)生CAR-表達(dá)T細(xì)胞隨時間的選擇性擴(kuò)增，并且在由5個循環(huán)aAPC添加周期組成的28天之后，每7天評估T細(xì)胞的CAR表達(dá)(圖9B)。如通過流式細(xì)胞術(shù)對于CAR的IgG4絞鏈區(qū)所測定的在CD4+和CD8+中通過RNA修飾和DNA修飾的Cetux-CAR的表達(dá)并非統(tǒng)計上不同的(p>0.05)，然而，RNA修飾在表達(dá)強(qiáng)度上產(chǎn)生更大的變化(圖10A)。在Cetux-CAR-表達(dá)T細(xì)胞中，CD4+和CD8+T細(xì)胞的比例在用RNA或DNA修飾的T細(xì)胞之間并非統(tǒng)計上不同的，然而，與RNA修飾的CAR+T細(xì)胞相比，在DNA修飾的CAR+T細(xì)胞中存在的CD4+和CD8+T細(xì)胞的比例存在更大可變性(圖10B)。為了比較通過RNA修飾或DNA修飾的表達(dá)Cetux-CAR的T細(xì)胞群的表型，通過流式細(xì)胞術(shù)分析表型標(biāo)記物。CD4+RNA-修飾的CAR+T細(xì)胞比CD4+DNA-修飾的CAR+T細(xì)胞具有顯著更多的具有中央記憶表型的T細(xì)胞(CCR7+CD45RAneg)(DNA-修飾的＝6.6±1.9％，RNA-修飾的＝49.6±3.0％，平均值±S.D.，n＝3)(p<0.0001)，但具有顯著更少的具有效應(yīng)記憶表型的T細(xì)胞(CCR7negCD45RAneg)(DNA-修飾的＝89.8±2.6％，RNA-修飾的＝48.1±3.3％，平均值±S.D.，n＝3)(p<0.0001)(圖10C)。類似地，CD8+RNA-修飾的CAR+T細(xì)胞比CD8+DNA-修飾的CAR+T細(xì)胞具有顯著更多的具有中央記憶表型的T細(xì)胞(DNA-修飾的＝10.4±4.9％，RNA-修飾的＝32.8±4.2％，平均值±S.D.，n＝3)(p<0.001)，但具有顯著更少的具有效應(yīng)記憶表型的T細(xì)胞(DNA-修飾的＝83.5±5.4％，RNA-修飾的＝51.1±6.6％，平均值±S.D.，n＝3)(p>0.0001)。通過RNA修飾的CD4+Cetux-CAR+T細(xì)胞與CD4+Cetux-CAR+T細(xì)胞相比還顯示顯著更高的抑制性受體程序性死亡受體1(PD-1)表達(dá)(p<0.01)，但CD57(一種T細(xì)胞衰老標(biāo)記物)的相似低表達(dá)(圖10D)。CD8+Cetux-CAR+T細(xì)胞表達(dá)低水平的PD-1和CD57并且在RNA-修飾的與DNA-修飾的CAR+T細(xì)胞之間不存在可察覺的差異。最終，細(xì)胞毒性分子穿孔素和粒酶B的表達(dá)在通過Cetux-CAR的DNA或RNA轉(zhuǎn)移修飾的CD4+和CD8+T細(xì)胞中是相似的(圖10E)。總之，CAR+T細(xì)胞的RNA-修飾和DNA-修飾產(chǎn)生相似的CAR表達(dá)水平，盡管RNA轉(zhuǎn)移造成CAR表達(dá)強(qiáng)度可變性增加。RNA-修飾的T細(xì)胞與DNA-修飾的T細(xì)胞相比表達(dá)更多的中央記憶表型CD4+和CD8+T細(xì)胞、較少的效應(yīng)記憶表型CD4+和CD8+T細(xì)胞，并且在CD4+CAR+T細(xì)胞上具有抑制性受體PD-1的更高表達(dá)。實施例7–DNA-修飾的CAR+T細(xì)胞與RNA-修飾的CAR+T細(xì)胞相比產(chǎn)生更多細(xì)胞因子并展現(xiàn)稍微更大的細(xì)胞毒性響應(yīng)于被修飾以表達(dá)截短的EGFR(tEGFR+EL4)或不相關(guān)抗原CD19的小鼠T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系EL4及包括人成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞系U87、T98G、LN18及人表皮樣癌細(xì)胞系A(chǔ)431的EGFR+細(xì)胞系來評估RNA-修飾或DNA-修飾的CAR+T細(xì)胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生。更少的通過RNA轉(zhuǎn)移修飾的CD8+CAR+T細(xì)胞響應(yīng)于所有EGFR-表達(dá)細(xì)胞系產(chǎn)生IFN-γ(圖11A，左圖)。因為更少的RNA-修飾的T細(xì)胞響應(yīng)于用PMA/離子霉素進(jìn)行的抗原非依賴性刺激產(chǎn)生IFN-γ，所以減少的IFN-γ產(chǎn)生不可能歸因于CAR對抗原的敏感性降低，而寧可說是通過RNA-修飾表達(dá)CAR的T細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的能力下降。注意到DNA-修飾的CAR+T細(xì)胞在T細(xì)胞刺激不存在下還顯示IFN-γ的更高本底產(chǎn)生。類似地，與DNA-修飾的CD8+CAR+T細(xì)胞相比，更少的RNA-修飾的CD8+CAR+T細(xì)胞響應(yīng)于來自T98G、LN18、A431的EGFR-特異性刺激以及來自PMA/離子霉素的抗原非依賴性刺激產(chǎn)生TNF-α(圖11A，右圖)。因為RNA-修飾的CAR+T細(xì)胞相對于DNA-修飾的CAR+T細(xì)胞顯示降低的產(chǎn)生細(xì)胞因子的能力，所以比較RNA-修飾的與DNA-修飾的T細(xì)胞的細(xì)胞毒性以確定RNA-修飾的CAR+T細(xì)胞相對于DNA-修飾的CAR+T細(xì)胞的細(xì)胞毒性潛力。響應(yīng)于CD19+EL4細(xì)胞，RNA-修飾的和DNA-修飾的CAR+T細(xì)胞具有低水平的本底殺傷，盡管在高效應(yīng)物與靶標(biāo)比率(E:T＝20:1)下，RNA-修飾的CAR+T細(xì)胞顯示比DNA-修飾的CAR+T細(xì)胞顯著更多的本底裂解(p<0.05)(圖11B)。類似地，RNA-修飾和DNA-修飾的CAR+T細(xì)胞顯示針對B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系NALM-6的低水平和相等水平的本底裂解。響應(yīng)于tEGFR+EL4和A431，在由RNA-修飾或DNA-修飾的CAR+T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性中不存在可察覺的差異。響應(yīng)于三種神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87、T98G及LN18，DNA-修飾的CAR+T細(xì)胞顯示比僅在低E:T比率下檢測的RNA-修飾的CAR+T細(xì)胞稍微增加的細(xì)胞毒性。因為RNA-修飾的T細(xì)胞比DNA-修飾的T細(xì)胞在供體與供體之間在CAR表達(dá)方面具有更多的可變性，所以評估如通過CAR表達(dá)的中值熒光強(qiáng)度所測定的CAR表達(dá)對A431的特異性裂解的影響。將CAR表達(dá)的中值熒光強(qiáng)度針對A431的特異性裂解作圖，并且線性回歸關(guān)系產(chǎn)生顯著不等于零的斜率，且因此顯示在CAR表達(dá)與特異性裂解之間沒有檢測到顯著的趨勢(斜率＝0.0237±0.030，p＝0.4798)(圖11C)。總之，這些研究結(jié)果表明DNA-修飾的CAR+T細(xì)胞相對于RNA-修飾的CAR+T細(xì)胞具有效應(yīng)細(xì)胞因子IFN-γ和TNF-α的顯著增加的產(chǎn)生，當(dāng)在低E:T比率下存在時可顯示稍微更大的細(xì)胞毒性，并且在RNA-修飾的CAR+T細(xì)胞中的CAR表達(dá)的可變性不顯著影響靶標(biāo)的特異性裂解。實施例8–Cetux-CAR通過T細(xì)胞的RNA修飾的瞬時表達(dá)為了測定通過RNA轉(zhuǎn)移的CAR表達(dá)的穩(wěn)定性，通過RNA轉(zhuǎn)移修飾T細(xì)胞以表達(dá)CAR，并且通過流式細(xì)胞術(shù)測量隨時間的CAR表達(dá)。RNA轉(zhuǎn)移之后，T細(xì)胞上Cetux-CAR的表達(dá)隨時間減少，并且在電轉(zhuǎn)移之后96小時，CAR以低水平表達(dá)(圖12A)。因為RNA轉(zhuǎn)錄物在T細(xì)胞增殖期間在子細(xì)胞之間分配，所以T細(xì)胞增殖的刺激應(yīng)加速通過RNA修飾表達(dá)的CAR的損失。為了確定細(xì)胞因子刺激對CAR表達(dá)水平的影響，在RNA轉(zhuǎn)移之后24小時將外源性IL-2和IL-21添加到RNA-修飾的CAR+T細(xì)胞培養(yǎng)物中，并通過流式細(xì)胞術(shù)監(jiān)測CAR表達(dá)。用IL-1和IL-21刺激CAR+T細(xì)胞加速CAR表達(dá)的損失(圖12B)。72小時之后，在RNA-修飾的T細(xì)胞上的CAR表達(dá)較低，并且在轉(zhuǎn)移之后96小時，T細(xì)胞不再以可檢測的水平表達(dá)CAR。在RNA轉(zhuǎn)移之后24小時用tEGFR+EL4刺激RNA-修飾的CAR+T細(xì)胞甚至進(jìn)一步加速CAR表達(dá)的損失(圖12C)。雖然在添加tEGFR+EL4之前在RNA-修飾的CAR+T細(xì)胞中檢測到高水平的CAR，但在tEGFR+EL4添加之后24小時(RNA轉(zhuǎn)移之后48小時)CAR表達(dá)是低的。總而言之，這些數(shù)據(jù)表明通過RNA轉(zhuǎn)移的CAR表達(dá)在RNA轉(zhuǎn)移之后長達(dá)120小時是瞬時的、可檢測的、低水平的，然而，通過細(xì)胞因子或抗原識別刺激T細(xì)胞加速了CAR表達(dá)的損失。實施例9–Cetux-CAR通過RNA修飾的瞬時表達(dá)減少細(xì)胞因子產(chǎn)生和對EGFR-表達(dá)細(xì)胞的細(xì)胞毒性在RNA轉(zhuǎn)移之后24和120小時測量通過RNA轉(zhuǎn)移被修飾以表達(dá)Cetux-CAR的T細(xì)胞的活性以確定CAR表達(dá)的損失響應(yīng)于EGFR-表達(dá)細(xì)胞對T細(xì)胞活性的影響。盡管當(dāng)在RNA轉(zhuǎn)移之后24小時和120小時評價時，RNA-修飾的T細(xì)胞顯示通過PMA/離子霉素刺激的等同的IFN-γ產(chǎn)生，在RNA轉(zhuǎn)移之后24小時通過T細(xì)胞響應(yīng)于tEGFR+EL4的IFN-γ產(chǎn)生在RNA轉(zhuǎn)移之后120小時消除(24小時＝14.2±2.5％，120小時＝1.1±0.03％，平均值±S.D.，n＝3)(p＝0.012)(圖13A)。相比之下，DNA-修飾的CAR+T細(xì)胞在所評價的兩個時間點響應(yīng)于tEGFR+EL4顯示相等的IFN-γ產(chǎn)生(24小時＝40.3±9.6％，120小時＝48.6±10.0％，平均值±S.D.，n＝3)(p＝0.490)。類似地，測量針對表皮樣癌細(xì)胞系A(chǔ)431和表達(dá)EGFR的人正常腎上皮細(xì)胞(HRCE)的特異性細(xì)胞毒性。RNA-修飾和DNA-修飾的CAR+T細(xì)胞顯示A431的等同特異性裂解和針對HRCE的類似細(xì)胞毒性，在更高的效應(yīng)物與靶標(biāo)比率下在統(tǒng)計上是等同的(20:1和10:1，p>0.05)(圖13B)。類似于對其他細(xì)胞系的觀察結(jié)果，DNA-修飾的CAR+T細(xì)胞在較低的E:T比率下介導(dǎo)比RNA-修飾的CAR+T細(xì)胞稍微更高的HRCE的特異性裂解(5:1，p<0.05；2.5:1，p<0.01；1.25:1，p<0.05)。然而，在RNA轉(zhuǎn)移之后120小時，當(dāng)消除RNA-修飾的T細(xì)胞的CAR表達(dá)時，DNA-修飾的T細(xì)胞在所評估的每個E:T比率下響應(yīng)于A431和HRCE而介導(dǎo)顯著更高的特異性裂解(A431，所有E:T比率，p<0.0001；HRCE，所有E:T比率，p<0.0001)。盡管DNA-修飾的T細(xì)胞在每個時間點在HRCE的特異性裂解方面沒有顯示變化(10:1E:T比率，24小時＝45.5±8.0％，120小時＝51.6±7.8％，p>0.05，n＝3)，RNA-修飾的T細(xì)胞截至RNA轉(zhuǎn)移之后120小時顯著減少HRCE的特異性裂解(10:1E:T比率，24小時＝39.5±5.9％，120小時＝19.8±10.2％，平均值±S.D.，n＝3)(圖13C)。這些數(shù)據(jù)表明RNA-修飾的而不是DNA-修飾的T細(xì)胞響應(yīng)于EGFR-表達(dá)靶標(biāo)的活性由于CAR表達(dá)的損失而降低。實施例10–Cetux-CAR+與Nimo-CAR+T細(xì)胞在表型上是相似的來源于尼妥珠單抗的第二代CAR(稱為Nimo-CAR)是通過將尼妥珠單抗的scFv與IgG4絞鏈區(qū)、CD28跨膜結(jié)構(gòu)域及CD28和CD3ζ細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域融合而在睡美人轉(zhuǎn)座子中以與Cetux-CAR相同的構(gòu)型生成。Cetux-CAR和Nimo-CAR通過用SB11轉(zhuǎn)座酶將每個轉(zhuǎn)座子電穿孔到外周血單核細(xì)胞(PBMC)中在原代人T細(xì)胞中表達(dá)。具有Cetux-CAR或Nimo-CAR的穩(wěn)定整合的T細(xì)胞通過用γ輻照的tEGFR+K562人工抗原呈遞細(xì)胞(aAPC)的每周循環(huán)刺激而選擇性地增殖(圖14A)。兩種CAR在與aAPC共培養(yǎng)的28天內(nèi)都介導(dǎo)CAR+T細(xì)胞的～1000倍擴(kuò)增，產(chǎn)生幾乎全部都表達(dá)CAR的T細(xì)胞(Cetux-CAR＝90.8±6.2％，Nimo-CAR＝90.6±6.1％；平均值±SD，n＝7)(圖14B和14C)。表達(dá)CAR的Cetux-CAR和Nimo-CAR+T細(xì)胞的比例在數(shù)值擴(kuò)增28天之后在統(tǒng)計上是類似的(p＝0.92，學(xué)生雙尾t檢驗)。由中值熒光強(qiáng)度表示的CAR表達(dá)的密度是通過流式細(xì)胞術(shù)來測量的并且在Cetux-CAR+與Nimo-CAR+T細(xì)胞群之間在統(tǒng)計上是類似的(Cetux-CAR＝118.5±25.0A.U.，Nimo-CAR＝112.6±21.2A.U.；平均值±SD，n＝7)(p＝0.74)(圖14D)。為了確定CARscFv對T細(xì)胞功能的影響，建立Cetux-CAR+和Nimo-CAR+T細(xì)胞的電穿孔和增殖以產(chǎn)生表型上類似的T細(xì)胞群。每個供體產(chǎn)生可變比率的CD4+與CD8+T細(xì)胞(表1)，然而，在Cetux-CAR+與Nimo-CAR+T細(xì)胞之間在CD4/CD8比率上不存在統(tǒng)計學(xué)差異(p＝0.44，學(xué)生雙尾t檢驗)(圖15A)。分化標(biāo)記物CD45RO、CD45RA、CD28、CD27、CCR7及CD62L的表達(dá)在統(tǒng)計上不顯著(p>0.05)，并且表示異質(zhì)T細(xì)胞群(圖18B)。同樣，發(fā)現(xiàn)衰老的標(biāo)記物CD57和KLRG1及抑制性受體程序性死亡受體1(PD-1)是低的并且在Cetux-CAR+與Nimo-CAR+T細(xì)胞群之間在統(tǒng)計上是不同的(p>0.05)(圖15C)?？傊?，這些研究結(jié)果表明Cetux-CAR+與Nimo-CAR+T細(xì)胞在電穿孔和增殖之后沒有可檢測的表型差異(包括CAR表達(dá))，使得能夠直接比較。表1.在Cetux-CAR+和NimoCAR+T細(xì)胞中CD4與CD8的比率。通過流式細(xì)胞術(shù)測定擴(kuò)增28天之后Cetux-CAR+和Nimo-CAR+T細(xì)胞中CD4和CD8的表達(dá)。數(shù)據(jù)來自7個獨立的供體。實施例11–Cetux-CAR+和Nimo-CAR+T細(xì)胞對CAR依賴性T細(xì)胞活化具有相同能力為了證實Cetux-CAR和Nimo-CAR響應(yīng)于EGFR刺激的功能性，將CAR+T細(xì)胞與A431表皮樣癌細(xì)胞系一起孵育，該細(xì)胞系據(jù)報告表達(dá)高水平的EGFR，約1x106個EGFR分子/細(xì)胞(Garrido等人,2011)。Cetux-和Nimo-CAR+T細(xì)胞在與A431共培養(yǎng)期間產(chǎn)生IFN-γ，IFN-γ在阻斷結(jié)合至EGFR的抗EGFR單克隆抗體存在下是減少的(圖16A)。為了證實Cetux-CAR和Nimo-CAR能夠等同地活化T細(xì)胞，生成可由不依賴于scFv結(jié)構(gòu)域的兩種CAR識別的靶標(biāo)。這通過在無限增殖的小鼠T細(xì)胞系EL4上表達(dá)對CAR(CAR-L)的IgG4區(qū)有特異性的活化抗體的scFv區(qū)而實現(xiàn)(Rushworth等人,2014)。比較通過CAR-L+EL4的T細(xì)胞的活化與通過表達(dá)tEGFR的EL4細(xì)胞系的活化。進(jìn)行定量流式細(xì)胞術(shù)以測量在EL4上表達(dá)的tEGFR的密度。在此方法中，通過流式細(xì)胞術(shù)測量來自具有用熒光抗體標(biāo)記的已知抗體結(jié)合能力的微球的熒光強(qiáng)度并用于生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，其定義已知抗體結(jié)合能力與平均熒光強(qiáng)度(MFI)之間的線性關(guān)系。然后該標(biāo)準(zhǔn)曲線可用于由用相同熒光抗體標(biāo)記的未知樣品的平均熒光強(qiáng)度得到抗原表達(dá)的平均密度。tEGFR+EL4表達(dá)相對較低密度的tEGFR，約45,000個分子/細(xì)胞(圖16B)。Cetux-CAR+和Nimo-CAR+CD8+T細(xì)胞顯示響應(yīng)于CAR-L+EL4的IFN-γ的統(tǒng)計上相似的量，表明對于CAR依賴性活化的等同能力(p>0.05)(圖16C)。雖然Cetux-CAR+T細(xì)胞響應(yīng)于EGFR+產(chǎn)生IFN-γ，但不存在來自Nimo-CAR+T細(xì)胞的可察覺的IFN-γ產(chǎn)生(圖16C)，這與響應(yīng)于低抗原密度影響T細(xì)胞活化的CAR的scFv的親和力一致。除測量細(xì)胞因子產(chǎn)生之外，還就T細(xì)胞活化的分子下游(Erk1/2和p38)的磷酸化對CD8+T細(xì)胞進(jìn)行分析。在Cetux-CAR+與Nimo-CAR+T細(xì)胞之間在響應(yīng)于CAR-L+EL4的Erk1/2(p>0.05)或p38(p>0.05)的磷酸化方面不存在統(tǒng)計上的差異(圖16D)。盡管Cetux-CAR+T細(xì)胞展現(xiàn)響應(yīng)于tEGFR+EL4的Erk1/2和p38的磷酸化，Nimo-CAR+T細(xì)胞不能明顯磷酸化任一個分子。類似地，Cetux-CAR和Nimo-CAR兩者都顯示針對CAR-L+EL4等同的特異性裂解(10:1E:T比率，Cetux-CAR＝64.5±6.7％，Nimo-CAR＝57.5±12.9％，平均值±SD，n＝4)(p>0.05)。盡管Cetux-CAR+T細(xì)胞顯示響應(yīng)于tEGFR+EL4比非特異性靶標(biāo)CD19+EL4顯著的特異性裂解(tEGFR+EL4＝57.5±9.4％，tCD19+EL4＝17.3±13.0，平均值±SD，n＝4)(p<0.0001)，對于Nimo-CAR+T細(xì)胞不存在tEGFR+EL4的顯著裂解(tEGFR+EL4＝21.2±16.9％，CD19+EL4＝12.3±13.0，平均值±SD，n＝4)(p>0.05)(圖16E)。內(nèi)源性低親和力T細(xì)胞應(yīng)答可需要更久與抗原相互作用以實現(xiàn)效應(yīng)功能(Rosette等人,2001)，因此，CAR+T細(xì)胞控制tEGFR+和CAR-L+EL4細(xì)胞生長的能力是通過將T細(xì)胞與EL4以1:1的比率混合并且評估在長期共培養(yǎng)期間T細(xì)胞與EL4細(xì)胞的比例來評估的。Cetux-CAR+T細(xì)胞和Nimo-CAR+T細(xì)胞等同地控制CAR-L+EL4的生長(p>0.05)，如5天之后CAR-L+EL4細(xì)胞在共培養(yǎng)物中的低比例所示(圖16F)。Cetux-CAR+T細(xì)胞控制tEGFR+EL4的生長，導(dǎo)致5天之后在共培養(yǎng)物中小于10％的tEGFR+EL4。Nimo-CAR+T細(xì)胞不太能夠控制tEGFR+EL4細(xì)胞生長，導(dǎo)致5天之后tEGFR+EL4占80％的共培養(yǎng)物，顯著多于與Cetux-CAR+T細(xì)胞的共培養(yǎng)物(p<0.01)。因此，Nimo-CAR+T細(xì)胞對tEGFR+EL4上的低tEGFR密度的應(yīng)答減少不太可能是由于活化時間的不足?？傊@些數(shù)據(jù)表明Cetux-CAR+和Nimo-CAR+T細(xì)胞對EGFR具有功能特異性并且可通過CAR依賴性、scFv非依賴性刺激同等地被活化。Cetux-CAR+T細(xì)胞能夠響應(yīng)于tEGFR+EL4上的低tEGFR密度進(jìn)行特異性活化；然而，EGFR表達(dá)的此密度不足以活化Nimo-CAR+T細(xì)胞以產(chǎn)生細(xì)胞因子、磷酸化下游分子Erk1/2和p38、或引發(fā)特異性裂解。實施例12–Nimo-CAR+T細(xì)胞的活化和功能應(yīng)答受到靶細(xì)胞上的EGFR表達(dá)密度的影響為了研究EGFR表達(dá)密度對Cetux-CAR+和Nimo-CAR+T細(xì)胞活化的影響，針對具有一系列EGFR表達(dá)密度的細(xì)胞系比較T細(xì)胞功能：NALM-6、U87、LN18、T98G及A431。首先，通過定量流式細(xì)胞術(shù)評估EGFR表達(dá)密度(圖17A)。NALM-6，一種B細(xì)胞白血病細(xì)胞系，不表達(dá)EGFR。U87，一種人成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞系，表達(dá)低密度的EGFR(～30,000個分子/細(xì)胞)。LN18和T98G(兩種人成膠質(zhì)細(xì)胞瘤細(xì)胞系)表達(dá)中等密度的EGFR(分別為～160,000和～205,000個分子/細(xì)胞)，并且發(fā)現(xiàn)A431表達(dá)高密度的EGFR(～780,000個分子/細(xì)胞)，類似于先前的報告(Garrido等人,2011)。Cetux-CAR+和Nimo-CAR+CD8+T細(xì)胞顯示響應(yīng)于具有高EGFR密度的A431(p>0.05)和具有中等EGFR密度的LN18(p>.05)的統(tǒng)計上相似的IFN-γ產(chǎn)生。然而，Nimo-CAR+T細(xì)胞顯示相對于Cetux-CAR+T細(xì)胞響應(yīng)于具有中等EGFR密度的T98G(p<0.001)和具有低EGFR密度的U87(p<0.001)的減少的IFN-γ產(chǎn)生(圖17B)。類似地，盡管Cetux-CAR+和Nimo-CAR+T細(xì)胞顯示統(tǒng)計上相當(dāng)?shù)腁431細(xì)胞(5:1E:T比率，p>0.05)和T98G細(xì)胞(5:1E:T比率，p>0.05)裂解，Nimo-CAR+T細(xì)胞顯示對于LN18細(xì)胞特異性裂解能力一定程度的降低(5:1E:T比率，p<0.05)和對于U87細(xì)胞特異性裂解的能力降低(5:1E:T比率，p<0.01)(圖17C)。這些數(shù)據(jù)支持Nimo-CAR+T細(xì)胞的活化受到EGFR表達(dá)密度的影響。然而，評估在不同細(xì)胞本底環(huán)境中針對EGFR密度的功能是不理想的，這是由于不同的細(xì)胞系可具有不同T細(xì)胞活化傾向并且對T細(xì)胞介導(dǎo)的裂解具有不同易感性。實施例13–Nimo-CAR+T細(xì)胞功能的活化與EGFR表達(dá)密度直接并且正相關(guān)為了確定EGFR表達(dá)密度對同基因細(xì)胞本底的影響，開發(fā)一系列表達(dá)變化密度的EGFR的U87細(xì)胞系：未修飾的、親代U87(～30,000個EGFR分子/細(xì)胞)、U87low(130,000個EGFR分子/細(xì)胞)、U87med(340,000個EGFR分子/細(xì)胞)、以及U87high(630,000個EGFR分子/細(xì)胞)(圖18A)。為了比較scFv依賴性CAR刺激之后Erk1/2和p38的磷酸化，確保在刺激U87和U87high之后在Nimo-CAR+T細(xì)胞與Cetux-CAR+T細(xì)胞之間在磷酸化動力學(xué)方面沒有差別。兩種CD8+CAR+T細(xì)胞都顯示在相互作用之后45分鐘Erk1/2和p38的峰值磷酸化并且磷酸化在截至相互作用之后120分鐘時開始減少(圖18B)。在Cetux-CAR+T細(xì)胞與Nimo-CAR+T細(xì)胞之間在磷酸化動力學(xué)方面不存在可察覺的差別并且未來的實驗評估相互作用之后45分鐘Erk1/2和p38的磷酸化以用于所有未來的實驗。Cetux-CAR+CD8+T細(xì)胞響應(yīng)于所有四個U87細(xì)胞系對Erk1/2和p38進(jìn)行磷酸化并且顯示與EGFR表達(dá)密度無相關(guān)性(單因素ANOVA，對于線性趨勢采用事后檢驗；Erk1/2，p＝0.88；p38，p＝0.09)(圖18C)。相比之下，Nimo-CAR+CD8+T細(xì)胞對Erk1/2和p38的磷酸化直接與EGFR表達(dá)密度相關(guān)(單因素ANOVA，對于線性趨勢采用事后檢驗，Erk1/2p＝0.0030和p38p＝0.0044)。注意到Nimo-CAR+T細(xì)胞顯示比Cetux-CAR+T細(xì)胞顯著更少的pfErk1/2和p38的磷酸化，甚至響應(yīng)于U87high上的高EGFR密度時也如此(Erk1/2，p<0.0001；p38,p<0.01)。類似地，Cetux-CAR+CD8+T細(xì)胞響應(yīng)于U87、U87low、U87med及U87high時產(chǎn)生IFN-γ和TNF-α，并且產(chǎn)生與EGFR表達(dá)密度不相關(guān)(單因素ANOVA，對于線性趨勢采用事后檢驗；IFN-γ，p＝0.5703和TNF-α，p＝0.6189)(圖18D)。相比之下，Nimo-CAR+CD8+T細(xì)胞在與EGFR表達(dá)密度直接相關(guān)下產(chǎn)生IFN-γ和TNF-α(單因素ANOVA，對于線性趨勢采用事后檢驗；IFN-γ，p＝0.0124和TNF-α，p＝0.0006)。Cetux-CAR+CD8+T細(xì)胞響應(yīng)于U87(IFN-γ，p<0.0001；TNFα，p<0.01)或U87low(IFN-γ，p<0.001；TNFα，p<0.01)的刺激產(chǎn)生比Nimo-CAR+CD8+T細(xì)胞顯著更多的細(xì)胞因子，然而，Cetux-CAR+T細(xì)胞和Nimo-CAR+T細(xì)胞響應(yīng)于U87med(IFN-γ，p>0.05；TNFα，p>0.05)或U87high(IFN-γ，p>0.05；TNFα，p>0.05)的刺激顯示統(tǒng)計上相似的細(xì)胞因子產(chǎn)生。同樣，Cetux-CAR+T細(xì)胞顯示比Nimo-CAR+T細(xì)胞顯著更多的U87裂解(10:1E:T比率，p<0.0001)和U87low裂解(10:1E:T比率，p<0.05)，但在統(tǒng)計上相似的U87med(10:1E:T比率，p>0.05)和U87high(10:1E:T比率，p>0.05)的特異性裂解(圖18E)?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明Nimo-CAR+T細(xì)胞的活化直接與靶標(biāo)上的EGFR表達(dá)密度相關(guān)。因此，Cetux-CAR+與Nimo-CAR+T細(xì)胞響應(yīng)于高EGFR密度顯示相等的T細(xì)胞活化，但Nimo-CAR+T細(xì)胞響應(yīng)于低EGFR密度顯示顯著減少的活化。因為內(nèi)源性、低親和力T細(xì)胞應(yīng)答可能需要更久的與抗原的相互作用以獲得效應(yīng)功能(Rossette等人,2001)，經(jīng)證實在Cetux-CAR+T細(xì)胞與Nimo-CAR+T細(xì)胞之間觀察到的T細(xì)胞活性的差異不是由于對T細(xì)胞的相似要求。CAR+T細(xì)胞與靶標(biāo)的長期相互作用基本上沒有增加細(xì)胞因子產(chǎn)生并且沒有改變Cetux-CAR+與Nimo-CAR+CD8+T細(xì)胞之間的細(xì)胞因子產(chǎn)生的關(guān)系(圖19A)。類似地，評估Cetux-CAR+和Nimo-CAR+T細(xì)胞隨時間控制U87和U87high生長的能力并發(fā)現(xiàn)Cetux-CAR+和Nimo-CAR+T細(xì)胞顯示統(tǒng)計上相似的控制U87high生長的能力，導(dǎo)致相對于在CAR+T細(xì)胞不存在下生長的對照，80％的細(xì)胞數(shù)目減少(p>0.05)。Cetux-CAR+T細(xì)胞在內(nèi)源性低EGFR表達(dá)下控制U87生長，導(dǎo)致相對于CAR+T細(xì)胞不存在下生長的對照，40％的細(xì)胞數(shù)目減少。然而，Nimo-CAR+T細(xì)胞顯示顯著更少的U87生長控制，在細(xì)胞數(shù)目上沒有明顯的減少(p<0.001)(圖19B)。這些數(shù)據(jù)表明響應(yīng)于U87上的低EGFR的Nimo-CAR+T細(xì)胞活性沒有通過增加T細(xì)胞與靶標(biāo)的相互作用時間而改善，從而使得Nimo-CAR+T細(xì)胞活性降低不可能是由于對活化T細(xì)胞的長期相互作用的要求導(dǎo)致的。高于最小密度的CAR的表達(dá)為CAR依賴性T細(xì)胞活化所需，并且已顯示增加密度的CAR表達(dá)影響CAR對抗原的敏感性(Weijtens等人,2000；Turatti等人,2007)。因此，為了確定在更高密度下表達(dá)Nimo-CAR是否改善低EGFR密度的識別，應(yīng)設(shè)法在人原代T細(xì)胞中過度表達(dá)Cetux-CAR和Nimo-CAR。在電穿孔轉(zhuǎn)染中裝載DNA由于DNA對細(xì)胞的毒性而受限，然而，RNA的轉(zhuǎn)移相對無毒并且更易于通過增加遞送的CARRNA轉(zhuǎn)錄物的量而過度表達(dá)。因此，將Cetux-CAR和Nimo-CAR在體外轉(zhuǎn)錄為RNA物質(zhì)并且電轉(zhuǎn)移到人原代T細(xì)胞中。當(dāng)與供體-匹配的DNA-修飾的T細(xì)胞相比時，RNA轉(zhuǎn)移造成CAR表達(dá)的2-5倍增加(圖20A)。CAR的過度表達(dá)沒有致使Nimo-CAR+T細(xì)胞對U87上的低EGFR密度更敏感，并且Cetux-CAR和Nimo-CAR兩者均顯示響應(yīng)于U87high的相似的細(xì)胞因子產(chǎn)生(圖20B)。這表明增加Nimo-CAR+T細(xì)胞上的CAR密度不提高對低EGFR密度的敏感性。實施例14–Nimo-CAR+T細(xì)胞響應(yīng)于正常腎上皮細(xì)胞上的基礎(chǔ)EGFR水平具有降低的活性為了確定Nimo-CAR+T細(xì)胞是否響應(yīng)于正常細(xì)胞上的低的基礎(chǔ)EGFR水平具有減少的活化，響應(yīng)于正常人腎皮質(zhì)上皮細(xì)胞HRCE來評估Nimo-CAR+T細(xì)胞的活性。HRCE表達(dá)～15,000個EGFR分子/細(xì)胞，比腫瘤細(xì)胞系(包括U87)上的表達(dá)要低(圖21A)。盡管Cetux-CAR+T細(xì)胞響應(yīng)于HRCE產(chǎn)生IFN-γ和TNF-α，Nimo-CAR+T細(xì)胞響應(yīng)于HRCE產(chǎn)生顯著更少的IFN-γ或TNF-α(IFN-γ，p<0.05；TNF-α，p<0.01)(圖21B)。實際上，Nimo-CAR+T細(xì)胞沒有顯示超過無刺激時的本底產(chǎn)生的顯著的IFN-γ或TNF-α產(chǎn)生(IFN-γ，p>0.05；TNF-α，p>0.05)。Nimo-CAR+T細(xì)胞呈現(xiàn)由Cetux-CAR+T細(xì)胞進(jìn)行的響應(yīng)于HRCE小于50％的特異性裂解(Cetux-CAR＝81.1±4.5％，Nimo-CAR＝30.4±16.7％，平均值±SD，n＝3)，其顯著更少(10:1E:T比率，p<0.001)(圖21C)。這些研究結(jié)果表明Nimo-CAR+T細(xì)胞響應(yīng)于具有極低EGFR密度的細(xì)胞具有降低的T細(xì)胞功能。實施例15–Cetux-CAR+T細(xì)胞在刺激之后比Nimo-CAR+T細(xì)胞增殖更少，但不具有增加的AICD傾向受到結(jié)合親和力和抗原密度影響的內(nèi)源性TCR信號的強(qiáng)度可響應(yīng)于抗原刺激影響T細(xì)胞增殖(Gottschalk等人,2012；Gottschalk等人,2010)。為了評估用抗原刺激之后Cetux-CAR+T細(xì)胞和Nimo-CAR+T細(xì)胞的增殖應(yīng)答，在外源性細(xì)胞因子不存在下與U87或U87high共培養(yǎng)兩天之后通過流式細(xì)胞術(shù)測量Ki-67的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。響應(yīng)于U87上的低EGFR密度，Cetux-CAR+和Nimo-CAR+T細(xì)胞顯示統(tǒng)計上相似的增殖(p>0.05)(圖22A)。響應(yīng)于U87high，Nimo-CAR+T細(xì)胞顯示比Cetux-CAR+增加的增殖(p<0.01)，其在響應(yīng)于U87和U87high的增殖方面沒有顯示任何統(tǒng)計上的差異(p>0.05)。為了確定CAR親和力或抗原密度是否增加CAR+T細(xì)胞經(jīng)歷AICD的傾向，將Cetux-CAR+和Nimo-CAR+T細(xì)胞與U87或U87high在外源性細(xì)胞因子不存在下共培養(yǎng)并且通過膜聯(lián)蛋白V和7-AAD染色評估T細(xì)胞存活力。響應(yīng)于U87，Cetux-CAR+T顯示與未刺激的Cetux-CAR+T細(xì)胞相比存活力降低，然而，Nimo-CAR+T細(xì)胞在存活力方面沒有顯示任何可察覺的變化(圖22B)。響應(yīng)于U87high，Cetux-CAR+和Nimo-CAR+T細(xì)胞相對于未刺激的CAR+T細(xì)胞顯示統(tǒng)計上相似的存活力降低(p>0.05)。注意到用U87high刺激的Cetux-CAR+T細(xì)胞相對于用U87刺激的Cetux-CAR+T細(xì)胞在存活力方面沒有顯示任何統(tǒng)計上的差異(p>0.05)。這些數(shù)據(jù)表明抗原密度影響Nimo-CAR+T細(xì)胞而非Cetux-CAR+T細(xì)胞的AICD的誘發(fā)，從而支持Nimo-CAR的活性取決于抗原密度的先前數(shù)據(jù)。然而，響應(yīng)于能夠進(jìn)行Cetux-CAR+T細(xì)胞和Nimo-CAR+T細(xì)胞活化的高抗原密度，CAR的scFv結(jié)構(gòu)域的親和力似乎不影響AICD的誘發(fā)。實施例16–Cetux-CAR+T細(xì)胞顯示增強(qiáng)的CAR下調(diào)內(nèi)源性TCR可在與抗原相互作用之后下調(diào)，并且下調(diào)程度受TCR結(jié)合強(qiáng)度的影響(Cai等人,1997)。類似地，CAR可在與抗原相互作用之后下調(diào)，但親和力對CAR下調(diào)的影響是未知的(James等人,2008；James等人,2010)。因此，應(yīng)設(shè)法確定Cetux-CAR+T細(xì)胞是否對抗原誘導(dǎo)的下調(diào)具有更高傾向。為了實現(xiàn)此點，將Cetux-CAR+T細(xì)胞和Nimo-CAR+T細(xì)胞與U87或U87high共培養(yǎng)并相對于未刺激的對照監(jiān)測CAR表達(dá)。響應(yīng)于U87上的低EGFR密度，在相互作用12小時之后，Cetux-CAR表達(dá)顯著少于Nimo-CAR(Cetux-CAR＝68.0±27.8％，Nimo-CAR＝126.5±34.9％，平均值±SD，n＝3)(p<0.05)(圖23A，左圖)。截至與低密度EGFR相互作用48小時，Cetux-CAR回到T細(xì)胞表面，并且Cetux-CAR與Nimo-CAR在統(tǒng)計上相似比例的T細(xì)胞中表達(dá)(Cetux-CAR＝95.5±40.7，Nimo-CAR＝94.4±11.8％，平均值±SD，n＝3)(p>0.05)。響應(yīng)于U87high上的高EGFR密度，Cetux-CAR的表達(dá)相對于Nimo-CAR是顯著減少的，Nimo-CAR在相互作用12小時之后不顯示可察覺的下調(diào)(Cetux-CAR＝37.4±11.5％，Nimo-CAR＝124.4±15.3％，平均值±SD，n＝3)(p<0.01)(12小時，p<0.01；24小時，p<0.01；48小時，p<0.05)(圖23A，右圖)。然而，與低EGFR密度的刺激相反，Cetux-CAR在相互作用48小時之后沒有恢復(fù)表面表達(dá)且相對于Nimo-CAR表達(dá)保持統(tǒng)計上的減少(Cetux-CAR＝42.6±5.9％，Nimo-CAR＝95.7±11.6％，平均值±SD，n＝3)(p<0.05)。刺激之后在細(xì)胞內(nèi)檢測到Cetux-CAR和Nimo-CAR兩者，即使當(dāng)Cetux-CAR由T細(xì)胞表面減少時也如此，預(yù)示著減少的CAR表達(dá)是歸因于CAR的內(nèi)化而不是遺傳未修飾的T細(xì)胞的產(chǎn)物(圖23B)。響應(yīng)于通過CAR-L+EL4的CAR依賴性的、scFv非依賴性刺激，Cetux-CAR和Nimo-CAR顯示～20％的輕度和統(tǒng)計上相似的下調(diào)(圖23C)。類似于先前的結(jié)果，Cetux-CAR顯示響應(yīng)于tEGFR+EL4的略微下調(diào)，而Nimo-CAR顯示不可察覺的下調(diào)?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明Cetux-CAR相對于Nimo-CAR顯示更快速的和延長的下調(diào)，這取決于CAR的scFv結(jié)構(gòu)域與抗原的相互作用和抗原密度。實施例17–Cetux-CAR+T細(xì)胞對抗原重新攻擊具有降低的應(yīng)答在內(nèi)源性CD8+T細(xì)胞應(yīng)答中先前刺激的強(qiáng)度可與用抗原重新攻擊后的T細(xì)胞應(yīng)答相關(guān)(Lim等人,2002)。因此，評估Cetux-CAR+和Nimo-CAR+T細(xì)胞響應(yīng)于抗原重新攻擊的能力。將CAR+T細(xì)胞與U87或U87high共培養(yǎng)24小時，然后收獲并用U87或U87high重新攻擊以評價IFN-γ的產(chǎn)生。用U87和U87high初始攻擊之后，響應(yīng)于用U87和U87high兩者的重新攻擊，Cetux-CAR+T細(xì)胞具有減少的IFN-γ產(chǎn)生(圖24)。然而，在用U87或U87high初始攻擊之后，Nimo-CAR+T細(xì)胞響應(yīng)于用U87和U87high的重新攻擊保持IFN-γ產(chǎn)生。因此，Nimo-CAR+T細(xì)胞響應(yīng)于U87顯示統(tǒng)計上相似的IFN-γ產(chǎn)生(p>0.05)并且響應(yīng)于用U87high的重新攻擊顯示統(tǒng)計上更多的IFN-γ(用U87的初始攻擊，p<0.001；用U87high的初始攻擊，p<0.01)。這與響應(yīng)于初始攻擊的IFN-γ產(chǎn)生相反，其中Nimo-CAR+T細(xì)胞響應(yīng)于U87產(chǎn)生更少的IFN-γ(p<0.05)并且響應(yīng)于U87high顯示統(tǒng)計上相似的IFN-γ產(chǎn)生(p>0.05)。因此，Nimo-CAR+T細(xì)胞保持其識別和響應(yīng)于抗原的能力，而Cetux-CAR+T細(xì)胞具有響應(yīng)于與抗原的后續(xù)相遇的降低的能力，這可能至少部分由于CAR的下調(diào)并且可顯示在初始抗原暴露之后Cetux-CAR+T細(xì)胞的功能性耗竭傾向增大。實施例18–在NSG小鼠中使用U87細(xì)胞建立顱內(nèi)神經(jīng)膠質(zhì)瘤模型為了評估Cetux-CAR+T細(xì)胞和Nimo-CAR+T細(xì)胞的體內(nèi)抗腫瘤功效，建立經(jīng)修飾以表達(dá)螢火蟲熒光素酶(ffLuc)報道基因的U87細(xì)胞的顱內(nèi)神經(jīng)膠質(zhì)瘤異種移植物，用于通過生物發(fā)光(BLI)對相對腫瘤負(fù)荷進(jìn)行連續(xù)的、非侵入式成像。采用先前所述的導(dǎo)螺桿方法將腫瘤和T細(xì)胞定向輸注到精確的坐標(biāo)中(Lal等人,2000)。將導(dǎo)螺桿植入到NOD/Scid/IL2Rg-/-(NSG)小鼠頭蓋骨的右側(cè)額葉中并使小鼠恢復(fù)兩周(圖25A)。導(dǎo)螺桿植入至T細(xì)胞治療和通過BLI評估相對腫瘤負(fù)荷的時間線描繪在圖25B中。將250,000個通過tEGFR的強(qiáng)制表達(dá)而具有內(nèi)源性低EGFR或中等EGFR表達(dá)的U87細(xì)胞以2.5mm的深度注射穿過導(dǎo)螺桿的中心。在T細(xì)胞治療之前對小鼠進(jìn)行成像以評估腫瘤負(fù)荷，并將小鼠分層以均勻地分配腫瘤負(fù)荷到三個組中：不接受治療、治療Cetux-CAR+T細(xì)胞的小鼠或接受Nimo-CAR+T細(xì)胞的小鼠。注射腫瘤之后五天，將4x106個T細(xì)胞的初始劑量注射穿過導(dǎo)螺桿中心。每周通過導(dǎo)螺桿施用后續(xù)的T細(xì)胞劑量一次，持續(xù)總共三個T細(xì)胞劑量。在每次T細(xì)胞治療之后六天時的BLI測量被用于評價相對腫瘤負(fù)荷。治療之后，就終點標(biāo)準(zhǔn)對小鼠進(jìn)行評估，包括在24小時期間大于5％身體質(zhì)量的快速重量減輕、大于25％身體質(zhì)量的進(jìn)行性重量減輕、或明顯的臨床疾病征象，包括共濟(jì)失調(diào)、呼吸困難以及后肢麻痹。當(dāng)滿足終點標(biāo)準(zhǔn)(提示臨近動物死亡)時將小鼠處死，并且相對于不接受治療的小鼠評價Cetux-CAR+T細(xì)胞治療的小鼠和Nimo-CAR+T細(xì)胞治療的小鼠的存活期。實施例19–Nimo-CAR+T細(xì)胞抑制具有中等EGFR密度的異種移植物的生長，與Cetux-CAR+T細(xì)胞類似，但無T細(xì)胞相關(guān)毒性U87med注射之后四天，通過BLI對小鼠成像以評價腫瘤負(fù)荷(圖26A)。將小鼠分配到三個組中以均勻地分布相對腫瘤負(fù)荷，然后隨機(jī)分派治療：無治療、Cetux-CAR+T細(xì)胞或Nimo-CAR+T細(xì)胞(圖26B)。在T細(xì)胞治療當(dāng)天，通過流式細(xì)胞術(shù)分析已在EGFR+aAPC上經(jīng)歷3輪刺激和數(shù)值擴(kuò)增的CAR+T細(xì)胞的表型以測定CAR表達(dá)以及CD8+與CD4+T細(xì)胞的比率(圖26C)。CAR表達(dá)在Cetux-CAR+T細(xì)胞與Nimo-CAR+T細(xì)胞之間是相似的(分別為92％和85％)。Cetux-CAR+和Nimo-CAR+T細(xì)胞都含有CD4+與CD8+T細(xì)胞的混合物，然而Cetux-CAR+T細(xì)胞含有比Nimo-CAR+T細(xì)胞少約20％的CD8+T細(xì)胞(分別為31.8％和51.2％)。Cetux-CAR+T細(xì)胞和Nimo-CAR+T細(xì)胞兩者都能夠抑制腫瘤生長，如通過BLI所測定(第18天；Cetux-CAR，p<0.01和Nimo-CAR，p<0.05)(圖27A、B)。在Cetux-CAR+T細(xì)胞與Nimo-CAR+T細(xì)胞控制腫瘤生長的能力之間不存在差異(p>0.05)。當(dāng)所有沒有接受治療的小鼠都已死于疾病時，通過BLI評價的降低的腫瘤負(fù)荷在腫瘤注射后過去的100天內(nèi)在用Cetux-CAR+T細(xì)胞治療的3/7小鼠和用Nimo-CAR+T細(xì)胞治療的4/7小鼠中是明顯的。Cetux-CAR+T細(xì)胞治療的小鼠在兩個獨立實驗的T細(xì)胞治療的7天內(nèi)展示顯著的毒性，導(dǎo)致6/14小鼠死亡(p＝0.0006)(圖28A)。總體上，Cetux-CAR+T細(xì)胞治療與未治療的小鼠相比在統(tǒng)計上沒有改善存活期，可能是由于T細(xì)胞治療后不久的早期死亡(未治療的中值存活期＝88天，Cetux-CAR中值存活期＝105天，p＝0.19)(圖28B)。有趣的是，存活曲線描繪一個拐點，在該點之前，Cetux-CAR+T細(xì)胞治療與未治療的小鼠相比導(dǎo)致縮短的存活期，而在該點之后，經(jīng)受得住初始T細(xì)胞毒性的小鼠顯示改善的存活期。當(dāng)僅考慮經(jīng)受得住初始T細(xì)胞相關(guān)毒性的小鼠時，Cetux-CAR+T細(xì)胞相對于未治療的小鼠改善3/4小鼠(p＝0.0065)。相比之下，Nimo-CAR+T細(xì)胞在4/7小鼠中介導(dǎo)有效的腫瘤消退和延長存活期而沒有注意到任何毒性(未治療的中值存活期＝88天，Nimo-CAR中值存活期＝158天，p＝0.0269)。這些結(jié)果表明Cetux-CAR+T細(xì)胞和Nimo-CAR+T細(xì)胞在控制具有中等抗原密度的腫瘤的生長方面是有效的，然而，Cetux-CAR+T細(xì)胞在T細(xì)胞治療之后不久顯示明顯的毒性。實施例20–Cetux-CAR+T細(xì)胞而非Nimo-CAR+T細(xì)胞抑制具有低EGFR密度的異種移植物的生長用U87注射小鼠，接著在四天后，通過BLI評價相對腫瘤負(fù)荷(圖29A)。將相對腫瘤負(fù)荷均勻分配到三個組中并且隨機(jī)分派治療：無治療、Cetux-CAR+T細(xì)胞或Nimo-CAR+T細(xì)胞(圖29B)。在T細(xì)胞治療當(dāng)天，通過流式細(xì)胞術(shù)分析已在EGFR+aAPC上經(jīng)歷3輪刺激和數(shù)值擴(kuò)增的CAR+T細(xì)胞的表型以測定CAR表達(dá)以及CD8+與CD4+T細(xì)胞的比率(圖29C)。CAR表達(dá)在Cetux-CAR+T細(xì)胞與Nimo-CAR+T細(xì)胞之間是相似的(分別為92％和85％)。Cetux-CAR+和Nimo-CAR+T細(xì)胞都含有CD4+與CD8+T細(xì)胞的混合物，然而，Cetux-CAR+T細(xì)胞含有比Nimo-CAR+T細(xì)胞少約20％的CD8+T細(xì)胞(分別為31.8％和51.2％)。小鼠接受T細(xì)胞治療并且如先前所述通過BLI評價腫瘤(圖25B)。用Cetux-CAR+T細(xì)胞治療小鼠造成與未治療的小鼠相比腫瘤負(fù)荷的明顯降低(第25天，p<0.01)(圖30A和30B)。相反，用Nimo-CAR+T細(xì)胞的治療與未治療的小鼠相比沒有顯著降低腫瘤負(fù)荷(Nimo-CAR，p>0.05)。在用Cetux-CAR+T細(xì)胞治療的小鼠中降低的腫瘤負(fù)荷是瞬時的，然而，在T細(xì)胞治療中止之后，腫瘤恢復(fù)生長。Cetux-CAR+T細(xì)胞治療與沒有接受治療的小鼠相比顯著延長3/6小鼠中的存活期(未治療的中值存活期＝38.5天，Cetux-CAR中值存活期＝53天，p＝0.0150)(圖31)。相反，用Nimo-CAR+T細(xì)胞的治療沒有顯著改善存活期(未治療的中值存活期38.5天，Nimo-CAR中值存活期46天，p＝0.0969)。這些數(shù)據(jù)表明盡管CetuxCART細(xì)胞針對低抗原密度是有效的，Nimo-CAR+T細(xì)胞沒有有效地識別低密度EGFR表達(dá)。***參考文獻(xiàn)以下參考文獻(xiàn)提供了示例性的方法或其他可以補(bǔ)充本文所示內(nèi)容的細(xì)節(jié)，本文在此程度上將這些文獻(xiàn)通過引用特別并入本文。美國專利4,690,915美國專利6,225,042美國專利6,355,479美國專利6,362,001美國專利6,410,319美國專利6,489,458美國專利6,790,662美國專利7,109,304美國專利申請公布號2009/0004142美國專利申請公布號2009/0017000國際公布號WO2007/103009國際公布號WO2012/100346Adams，G.P.，R.Schier，A.M.McCall，H.H.Simmons，E.M.Horak，R.K.Alpaugh，J.D.Marks，andL.M.Weiner.2001.Highaffinityrestrictsthelocalizationandtumorpenetrationofsingle-chainfvantibodymolecules.Cancerresearch61：4750-4755.Ahmed，N.，V.S.Salsman，Y.Kew，D.Shaffer，S.Powell，Y.J.Zhang，R.G.Grossman，H.E.Heslop，andS.Gottschalk.2010.HER2-specificTcellstargetprimaryglioblastomastemcellsandi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