本申請(qǐng)要求于2014年5月30日遞交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)枮?2/005,662的優(yōu)先權(quán)的權(quán)益，其全部?jī)?nèi)容在此通過引證并入本文。

技術(shù)領(lǐng)域

本申請(qǐng)一個(gè)或多個(gè)方面涉及的是樣品制備，更為詳細(xì)地，涉及的是用于處于密閉的容器中的樣品的機(jī)器裂解的裝置和方法。

背景技術(shù)：

生物或環(huán)境樣本的分析通常需要樣品衍生分子存在于溶液中。然而，多種類型的樣品(動(dòng)物或植物組織、土壤樣品等)具有一個(gè)相對(duì)牢固的結(jié)構(gòu)，其感興趣的分子被包含在細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)中，因此其是不可用于溶解的。難以提取的樣本的實(shí)施例可以是植物種子、完整的昆蟲以及纖維組織等。用于分析這種樣本的制備通常涉及通過研磨、均質(zhì)化或者在適合的試劑中進(jìn)行浸漬操作來使抽樣結(jié)構(gòu)進(jìn)行機(jī)械裂解。

雖然多數(shù)分析方法中抽樣分子的分離和檢測(cè)是高度自動(dòng)化的，但其最初樣品制備步驟通常需要操作人員參與和手動(dòng)操作。一般來說，大的樣本和單細(xì)胞生物的懸浮液，例如哺乳動(dòng)物或植物細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)菌或真菌，是在大規(guī)模批量模式或連續(xù)高流量均質(zhì)機(jī)中處理的，或者使用高能超聲系統(tǒng)，也成為超聲空化。少量的細(xì)胞懸浮液的小組織樣品在這些設(shè)備中難以有效處理。由于分析方法的敏感性增加、發(fā)現(xiàn)研究或臨床診斷應(yīng)用需要對(duì)越來越多的少量的生物材料(例如小組織活檢)進(jìn)行分析，制備這種用于分析樣品的新方法是必需的。然而，小樣品的處理的專門設(shè)備是有限制的，例如較低的均質(zhì)化效率、樣品丟失或操作者接觸到潛在的危險(xiǎn)樣品等。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

根據(jù)一個(gè)多個(gè)方面，樣品制備裝置可以包括具有內(nèi)部表面、頂部和被用于樣品制備的壓力腔室接收，可拆卸地連接到所述管狀物的頂部的端蓋，以及從所述端蓋延伸進(jìn)入所述管狀物的錐形伸長(zhǎng)部件，所述的錐形伸長(zhǎng)部件配置用于與所述管狀物的內(nèi)部表面和在所述管狀物的底部的樣品接觸，其中所述管狀物是可變形的，似的在壓力的操作下，所述的管狀物相對(duì)所述錐形伸長(zhǎng)部件變形，從而促進(jìn)所述樣品的裂解。

根據(jù)一個(gè)或多個(gè)方面，樣品制備試劑盒可以包括具有孔的陣列的多孔板，每個(gè)孔包括內(nèi)壁和底部，所述的多孔板配置用于在每個(gè)孔的底部包含樣品并被用于樣品制備的壓力腔室接收，襯墊配置用于與所述多孔板配合從而為每個(gè)孔形成端蓋，多個(gè)錐形伸長(zhǎng)部件從所述襯墊延伸進(jìn)入所述孔的陣列，所述的錐形伸長(zhǎng)部件配置用于與所述孔的內(nèi)部表面和所述孔的底部的樣品接觸，其中所述的多孔板是可變形的使得在壓力的操作下，所述的孔相對(duì)于所述錐形伸長(zhǎng)部件變形從而促進(jìn)所述樣品的裂解。

根據(jù)一個(gè)或多個(gè)方面，樣品制備方法可以包括將樣品引入到具有內(nèi)壁、頂部和底部的管狀物內(nèi)，所述的管狀物配置為被用于樣品制備的壓力循環(huán)技術(shù)系統(tǒng)接收，可拆卸地將端蓋連接到所述的管狀物上，所述端蓋包括延伸進(jìn)入所述管狀物內(nèi)的錐形伸長(zhǎng)部件，所述的錐形伸長(zhǎng)部件配置用于與所述管狀物的內(nèi)部表面接觸以及將所述樣品限制在所述管狀物的底部，使所述管狀物承受循環(huán)壓力，所述的循環(huán)壓力從升高的流體靜壓P1變化為實(shí)質(zhì)上較低的壓力P2，使得所述的內(nèi)壁和管狀物的底部交替地壓縮所述的錐形伸長(zhǎng)部件和對(duì)所述錐形伸長(zhǎng)部件解壓，從而促進(jìn)所述樣品的裂解，在壓力循環(huán)之后，從所述樣品中分離出一種成分并將所述分離后的樣品成分引入下游的分離和/或分析設(shè)備。

下述詳細(xì)討論了本申請(qǐng)的其他方面、實(shí)施方案以及這些示范性的方面和實(shí)施方案的優(yōu)點(diǎn)。在此公開的任何實(shí)施方案可以以任何方式與在此公開的至少一個(gè)對(duì)象、目的和需求一致的其他方案結(jié)合，參考“一個(gè)(an)實(shí)施方案”、“一些實(shí)施方案”、“一個(gè)可替換的實(shí)施方案”、“不同的實(shí)施方案”、“一個(gè)(one)實(shí)施方案”或者類似的并不一定是相互排斥的，其是為了表明在至少一個(gè)實(shí)施方案中可能包括的與所述實(shí)施方案連接的特定的特征、結(jié)構(gòu)或者特性。這些術(shù)語的出現(xiàn)并不一定都是指相同的實(shí)施方案。所包括的附圖是為了提供說明和各方面和實(shí)施方案的進(jìn)一步理解，其被并入并構(gòu)成說明書的一部分。附圖，連同說明書的其他部分，用于解釋所描述和要求的方面和實(shí)施方案的原理和操作。

附圖說明

在下文中討論的至少一個(gè)方案的各方面參考以下附圖，所述附圖并未按照比例繪制。所包括的附圖是為了提供說明和各方面和實(shí)施方案的進(jìn)一步理解，其被并入并構(gòu)成說明書的一部分，但不應(yīng)視為任何特定實(shí)施方案限定的定義。附圖，連同說明書的其他部分，用于解釋所描述和要求的方面和實(shí)施方案的原理和操作。在所述附圖中，在不同附圖中示出的每個(gè)相同或基本相同的部件使用相同的序號(hào)。為了清晰的目的，不是每個(gè)部件在每幅附圖中都被標(biāo)記。在附圖中：

附圖1-2c是根據(jù)至少一個(gè)實(shí)施方案的代表性的視圖；

附圖3是根據(jù)至少一個(gè)實(shí)施方案的示意圖；

附圖4a和4b是當(dāng)除了被支撐的頂部端蓋外所有側(cè)面受到流體靜壓時(shí)，根據(jù)至少一個(gè)實(shí)施方案的側(cè)視圖；

附圖5a和5b是相對(duì)于所述樣品每個(gè)方向上受到均勻的流體靜壓時(shí)，根據(jù)至少一個(gè)實(shí)施方案的側(cè)視圖；

附圖6是根據(jù)至少一個(gè)實(shí)施方案由于流體靜壓引起的演示容器變形的計(jì)算機(jī)生成的模型；

附圖7a和7b是根據(jù)至少一個(gè)實(shí)施方案的收縮和擴(kuò)張的插入物的側(cè)視圖；

附圖8a是根據(jù)不同實(shí)施方案的插入物形狀的側(cè)視圖；

附圖8b是根據(jù)本發(fā)明的方面具有的四個(gè)樣品均質(zhì)化結(jié)果；

附圖9是根據(jù)一個(gè)實(shí)施例顯示插入物直徑大小和蛋白質(zhì)產(chǎn)量之間的關(guān)系的圖表；

附圖10是根據(jù)一個(gè)實(shí)施例顯示在壓力循環(huán)的數(shù)量和蛋白質(zhì)產(chǎn)量之間的關(guān)系的圖表；

附圖11是根據(jù)一個(gè)實(shí)施例的至少一個(gè)實(shí)施方案顯示壓力、壓力循環(huán)的數(shù)量和蛋白質(zhì)產(chǎn)量之間的關(guān)系的圖表；

附圖12a和12b是根據(jù)一個(gè)實(shí)施例顯示樣品大小和蛋白質(zhì)產(chǎn)量之間的關(guān)系的圖表；

附圖13是根據(jù)一個(gè)實(shí)施例顯示插入物、超聲處理的插入物和僅超聲處理的效果的比較的圖表；

附圖14是根據(jù)一個(gè)實(shí)施例的比較插入效果的圖表；

附圖15是根據(jù)一個(gè)實(shí)施例顯示具有插入物的壓力循環(huán)和不具有插入物的壓力循環(huán)的蛋白質(zhì)產(chǎn)量之間的關(guān)系的圖表；

附圖16是根據(jù)一個(gè)實(shí)施例顯示壓力值和蛋白質(zhì)產(chǎn)量之間的圖表和表格；

附圖17是根據(jù)一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案的可變形端蓋和伸長(zhǎng)部件組件的示意圖；以及

附圖18是根據(jù)一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案的盒子托架的示意圖。

具體實(shí)施方式

根據(jù)一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案，各領(lǐng)域中的前端樣品制備可以在樣品分析之前進(jìn)行，例如基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)以及代謝組學(xué)等。用于樣品制備的各種實(shí)施方案可以被用于與壓力循環(huán)技術(shù)(PCT)結(jié)合，從而增強(qiáng)蛋白質(zhì)、DNA、RNA、脂質(zhì)和小分子，以及分子復(fù)合物(例如，亞細(xì)胞器、染色質(zhì)、多聚核糖體、肌原纖維、模組分等)從固體組織中的提取，尤其是相對(duì)較小的樣品中的提取。在PCT技術(shù)中，當(dāng)樣品受到在流體靜力反應(yīng)室中的環(huán)境壓力和高壓的交替循環(huán)時(shí)，裂解發(fā)生。例如，高壓可以在大約20,000psi到大約100,000psi的范圍內(nèi)。根據(jù)不同的實(shí)施方案，壓力可圍繞杵插入物壓縮非剛性管狀容器，使得所述管狀容器的壁移動(dòng)接近所述的杵的表面并壓碎樣品材料。樣品材料的其他機(jī)械裂解導(dǎo)致了更為有效的樣品制備過程。在一些實(shí)施方案中，相對(duì)于所述管狀容器來說，需要沒有直線運(yùn)動(dòng)，例如進(jìn)出運(yùn)動(dòng)(in-and-out motion)，或者所述杵的圓周運(yùn)動(dòng)，以此促進(jìn)樣品制備。在至少一些實(shí)施方案中，來自壓力生物科學(xué)公司(Pressure Biosciences,Inc)的商業(yè)上可用的PCT機(jī)器可用于促進(jìn)樣品壓縮，從而在樣品制備期間導(dǎo)致增強(qiáng)的樣品裂解。在一些實(shí)施方案中，在樣品制備期間，所述的操作者并不手動(dòng)操作插入件。各種分離和分析步驟可以在下游進(jìn)行。舉例來說，可以實(shí)施色譜分離、質(zhì)譜分析和數(shù)據(jù)分析方法。在至少一些實(shí)施方案中，充足的蛋白質(zhì)可能被有益地釋放用于以前在常規(guī)設(shè)備中不易處理的細(xì)針活檢樣品的下游的質(zhì)譜分析，其導(dǎo)致了樣品材料損失和交叉污染。一些實(shí)施方案可能被發(fā)現(xiàn)在生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)、診斷、法醫(yī)學(xué)、藥物發(fā)明和設(shè)計(jì)、生物治療特性、土壤&植物生物學(xué)、疫苗開發(fā)和組織學(xué)應(yīng)用等領(lǐng)域中使用。

根據(jù)一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案，流體靜壓和/或機(jī)械力可用于裂解。伸長(zhǎng)部件，例如杵，永久地或可拆卸地連接到端蓋上，可便于樣品制備。在一些實(shí)施方案中，變形是由來自四周的均勻的流體靜壓引起的。在其他實(shí)施方案中，當(dāng)端蓋被固定在頂蓋上時(shí)，變形是由來自底部和/或側(cè)面的壓力引起的。在一些實(shí)施方案中，變形是由從頂部通過柔性端蓋的具有附著的杵的壓力引起的。所述的管狀物可以在剛性孔中支撐。在其他的實(shí)施方案中，變形是由從頂部通過柔性端蓋的具有附著的杵的機(jī)械力引起的。所述的管狀物可以在剛性孔中支撐。在其他的實(shí)施方案中，變形可以是通過從頂部通過柔性端蓋的具有附著的杵的壓力引起的。

根據(jù)一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案，樣品可以被放置到樣品容器中，例如來自壓力生物科學(xué)公司的商業(yè)上可用的PCTμTubeTM。所述的樣品容器的尺寸和形狀一般可與PCT設(shè)備一致。所述的樣品容器可以由任何惰性材料制成，一般與預(yù)期樣品一致且一般可承受PCT處理。在至少一些實(shí)施方案中，所述的容器可由在非常高的流體靜壓下顯著收縮的材料制成。所述的材料一般為非剛性的。所述材料也可以在寬泛的溫度范圍內(nèi)保持完整性，例如從-200℃到100℃。化學(xué)抗性和可忽略的蛋白質(zhì)和核酸吸附有助于確保幾乎完整的樣品回收，這對(duì)小樣本來說尤為重要。舉例來說，所述的容器可由氟化乙烯丙烯共聚物(FEP)塑料制成。在一些實(shí)施方案中，所述容器的表面，例如內(nèi)部表面，可被改進(jìn)從而提供感興趣的分子(例如，蛋白質(zhì)、核酸或脂類)的選擇性結(jié)合，并在樣品均質(zhì)化期間促進(jìn)所述分子的富集。

根據(jù)一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案，任何樣品有利于在此描述的樣品制備可使用的類型。在一些實(shí)施例中，所述的樣品可以是聚合物材料。例如，所述的樣品可以是丙烯酰胺或者瓊脂糖凝膠。在一些實(shí)施方案中，所述的樣品可以是生物樣品。例如，所述的生物樣品可以是植物樣品、動(dòng)物或微生物細(xì)胞樣品，或者組織樣品。在一些實(shí)施方案中，所述的組織樣品可以是心臟或者骨骼肌組織、脈管組織、皮膚組織、腫瘤組織以及軟組織的至少一種。例如，所述的軟組織可以是肝、脾、腦、肺、腸或胃組織。組織樣品可以在外科介入期間通過穿孔或穿刺活檢的方式從有機(jī)體中提取，在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，或者通過固定和隨后移除固定劑和存儲(chǔ)基質(zhì)獲得。樣品也可以通過激光捕獲顯微切割技術(shù)從固定的或新鮮冷凍病理切片中獲得。樣品也可以表現(xiàn)為整個(gè)有機(jī)體(節(jié)肢動(dòng)物、線蟲等)以完全適合樣品容器。在至少一些實(shí)施方案中，所述的樣品可以是活檢組織樣品，例如來自于小針穿刺活檢或者穿孔活檢。所述的樣品可能涉及的是正常或者病變的標(biāo)本，從而輔助精準(zhǔn)醫(yī)療。在其他實(shí)施例中，待同質(zhì)化的標(biāo)本可以是過濾紙的穿孔上的干燥的血點(diǎn)、含有上皮細(xì)胞的藥簽(swab)、含有觸摸樣品的法醫(yī)學(xué)上的藥簽、聚丙烯酰胺或者瓊脂糖凝膠的穿孔后的蛋白質(zhì)或核酸點(diǎn)/帶。所述的樣品可以是固體的、凝膠的、半流質(zhì)的或者懸浮的。

相對(duì)較小的樣品可以被所述樣品容器容納。例如，樣品量可以少于大約30mg。在一些實(shí)施方案中，樣品量可以小于10mg。在至少一些實(shí)施方案中，樣品量可以在大約0.5到大約3.0mg的范圍內(nèi)。在其他實(shí)施方案中，樣品量可以是只有一個(gè)或幾個(gè)細(xì)胞。除了容納小樣品量以外，樣品損失可以被最小化。熱量和/或高剪切應(yīng)力的產(chǎn)生也是可以避免的，從而保持提取組分的完整性。

根據(jù)一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案，隨后，一種或多種試劑可能被引入所述的樣品容器。可使用移液管來實(shí)現(xiàn)該目的。可使用相對(duì)較低的提取試劑的體積，例如，低至大約20μL到大約30μL。多種試劑可以實(shí)現(xiàn)。所述的試劑可以是，例如，常用于蛋白質(zhì)提取的任何試劑，例如，RIPA緩沖液、尿素緩沖液、鹽酸胍緩沖液、磷酸鹽緩沖鹽水或者有機(jī)溶劑。其他的緩沖液和試劑，例如，三羥甲基氨基甲烷(Tris)、Tris-EDTA緩沖液(TE)以及碳酸氫銨也可以使用。在一些實(shí)施方案中，在樣品裂解之前可將內(nèi)源酶活性的特異性抑制劑添加到提取緩沖液中從而保護(hù)樣品成分免于暴露和損壞，在所述樣品裂解或溶解的過程或在完成期間，內(nèi)源酶被釋放。

根據(jù)一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案，可向所述樣品容器中引入一種或多種酶。所述的酶可以是天然存在的或者設(shè)計(jì)合成的。代表性的酶可以包括胰蛋白酶(trypsin)、N-糖酰胺酶F(PNGase F)、內(nèi)蛋白酶賴氨酸-C(Endoproteinase Lys-C)、糜蛋白酶(trypsin)、內(nèi)蛋白酶Glu-C。代表性的酶也可以包括，例如，內(nèi)蛋白酶Asp-N、內(nèi)蛋白酶Arg-C、胃蛋白酶(pepsin)和木瓜蛋白酶(papain)等。

試劑也可以包括用于同時(shí)消化某些樣品成分的酶。在一些實(shí)施方案中，所述的酶可以是用于消化樣品中的DNA的脫氧核糖核酸酶(DNase)，或者用于消化RNA的核糖核酸酶(RNase)。在一些實(shí)施方案中，所述的酶可以是benzonase核酸內(nèi)切酶，或者一般的蛋白酶，例如鏈霉蛋白酶(Pronase)或者蛋白酶K(Proteinase K)，用于無用的蛋白質(zhì)的消化。在其他實(shí)施方案中，所述的酶可以是特異性蛋白酶，例如，用于樣品樣肽分離的胰蛋白酶，或者用于細(xì)菌或真菌細(xì)胞壁的溶解的酶，例如，溶菌酶(lysozyme)和消解酶(zymolase)。

根據(jù)一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案，在所述的容器內(nèi)至少可以在所述的樣品的上方留有一定量的空氣，以便提供可壓縮性，從而允許所述管狀物的變形，正如在此所討論的那樣。當(dāng)所述的樣品容器被適當(dāng)填充時(shí)，樣品材料和試劑可以填充大約2/3樣品容器。剩余的1/3樣品容器可以填充剩余的空氣。

根據(jù)一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案，然后，一個(gè)伸長(zhǎng)部件可以引入到被填充的樣品容器中以便于有效分解軟組織從而通過壓力驅(qū)動(dòng)的機(jī)械解體來增強(qiáng)細(xì)胞溶解。在一些非限制性實(shí)施方案中，所述的伸長(zhǎng)部件一般可為錐形，例如，與杵相似。本文實(shí)施的可以是各種尺寸和形狀的。所述的伸長(zhǎng)部件可以由任何材料制成。在一些實(shí)施方案中，所述的伸長(zhǎng)部件可由惰性材料制成。在一些實(shí)施方案中，所述的伸長(zhǎng)部件可以包括一個(gè)部件，其可專門與感興趣的樣品成分結(jié)合，例如，富集或純化所述樣品。所述的材料一般要比所述的樣品堅(jiān)硬，目的是在樣品制備期間使其裂解。在一些實(shí)施方案中，為了實(shí)現(xiàn)相同的目的，所述的材料也可以是與非剛性容器的堅(jiān)硬程度等同或比其硬。在至少一些非限制性實(shí)施方案中，所述的伸長(zhǎng)部件可由聚四氟乙烯(PTFE)制成，例如，杜邦公司(DuPont Corp)的商業(yè)上可用的手動(dòng)工具或者機(jī)械手可用于將所述的伸長(zhǎng)部件插入所述的樣品容器。所述的伸長(zhǎng)部件可整體耦合或者可拆卸地耦合到樣品容器的可變形端蓋。

根據(jù)一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案，所述樣品容器和伸長(zhǎng)部件的其中之一或二者通常可為一次性使用的。因此，二者之一或二者可為一次性的，例如，消耗品。二者之一或二者可批量性的單獨(dú)提供?？商鎿Q的，也可以提供二者之一或二者的陣列，例如以支架形式。例如，多個(gè)樣品容器和/或伸長(zhǎng)部件可以標(biāo)準(zhǔn)形式提供，例如，96單元支架，其與標(biāo)準(zhǔn)樣品制備和分析設(shè)備一致從而便于使用。在一些實(shí)施方案中，所述的樣品容器可以包括可寫表面。

根據(jù)一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案，被填充的樣品容器包括插入的伸長(zhǎng)部件，然后其可以被放置并固定到PCT腔室。在一些實(shí)施方案中，多個(gè)樣品容器可以被放置到PCT盒中用于多樣品處理。然后，所述的盒可被放置到所述的PCT腔室。然后，PCT程序可在PCT設(shè)備上運(yùn)行。在一些實(shí)施方案中，所述的PCT程序可涉及的是從升高的流體靜壓P1變化為實(shí)質(zhì)上較低的壓力P2的循環(huán)壓力。在至少一些實(shí)施方案中，所述的PCT設(shè)備可以是如上所述的在至少一些實(shí)施方案中，所述的PCT設(shè)備和/或PCT程序和/或樣品容器可根據(jù)美國(guó)專利號(hào)6,111,096、6,120,985和7,626,017，以及美國(guó)公開號(hào)為2010-0281955-A1中任一專利申請(qǐng)所描述，上述所有美國(guó)專利均被轉(zhuǎn)讓給壓力生物科學(xué)公司，其全部?jī)?nèi)容在此全部并入本文。

在所述的PCT程序完成時(shí)，所述的PCT腔室可被打開，均質(zhì)化的樣品可被取回用于進(jìn)一步處理、分離、提取和/或分析。均質(zhì)化的樣品可以包括與原始樣品材料的結(jié)構(gòu)不同的結(jié)構(gòu)。在一些實(shí)施方案中，所述的細(xì)胞間基質(zhì)和器連接可能被分解。在一些實(shí)施方案中，所述的細(xì)胞膜可能被破壞，從而將蛋白質(zhì)、脂類、膜、細(xì)胞器、細(xì)菌、病毒以及核酸等成分釋放到所述的溶劑或提取試劑中。

在至少一些實(shí)施方案中，PCT適配器工作站可用于簡(jiǎn)化處理。試劑盒可以是符合人體工程學(xué)設(shè)計(jì)的，其包括使用戶能夠一次處理多個(gè)樣品的工具和硬件。例如，如上所述的PCT盒或樣品架可被組裝從而接收一個(gè)或多個(gè)樣品容器。所述的盒可以支撐堆疊的陣列并允許通過基于陣列和/或等級(jí)(level)的唯一位置來識(shí)別樣品。所述的盒可以將所述的端蓋楔入所述管狀物的頂部部分以及將所述管狀物的頂部部分楔入所述的孔中以確保當(dāng)流體靜壓的作用下發(fā)生管狀物的變形時(shí)，每個(gè)管狀物是緊密密封的。試劑盒可以包括，例如，一個(gè)或多個(gè)樣品管狀物和一個(gè)或多個(gè)伸長(zhǎng)部件。所述的試劑盒也可以包括其他部件，例如，試劑源和/或酶源。

在操作過程中，樣品可以被所述伸長(zhǎng)部件的一端包圍在樣品容器的底部。正如在此進(jìn)一步討論的那樣，由于樣品容器在所述伸長(zhǎng)部件上、圍繞所述伸長(zhǎng)部件和/或緊靠所述伸長(zhǎng)部件的變形，隨著每個(gè)壓力循環(huán)，所述的樣品被壓碎。這種機(jī)械作用，與高壓下的緩沖液的提取能力相結(jié)合，導(dǎo)致了有效的均質(zhì)化和提取。在高流體靜壓之下，空氣也完全溶解到水中，這也有利于樣品的制備。

可使用一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案作為替換的或者使用高能量的機(jī)械破壞過程作為替換，例如，均質(zhì)化、超聲空化(超聲降解法)以及振動(dòng)珠磨(vibrational bead beating)等。在一些實(shí)施方案中，本文提出的裝置和方法可以與樣品的機(jī)械壓碎力結(jié)合，所述的機(jī)械壓碎力是將所述樣品通過窄的環(huán)形縫隙反復(fù)按壓在剛性表面上，由于所述樣品容器和伸長(zhǎng)部件的相對(duì)性狀，其形成了在封閉容器內(nèi)的抽樣的均質(zhì)化，相當(dāng)于或優(yōu)于由常規(guī)方法裂解的樣品。

根據(jù)一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案，完全封閉的單一的一次性容器的使用可被用于樣品采集、機(jī)械破壞、保證樣品完整性的提取、連續(xù)保管、防止污染，以及保護(hù)使用者免受潛在危險(xiǎn)樣品材料曝光。本文討論了在伸長(zhǎng)部件插入物和樣品容器之間產(chǎn)生直線運(yùn)動(dòng)的各種裝置和方法，同時(shí)保持所述的樣品緊密密封，用于通過可控的機(jī)械破壞作用對(duì)生物樣品成分進(jìn)行提取。

根據(jù)一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案，用于分析的樣品可以使用在此描述的用于提取的裝置和方法在封閉系統(tǒng)中制備。在一些實(shí)施方案中，在樣品制備之前，溶解或提取緩沖液被加入到所述的樣品容器內(nèi)。溶解或提取緩沖液的選擇基于期望的分析應(yīng)用。例如，提取緩沖液可基于樣品制備對(duì)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)或蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)的確認(rèn)來選擇。在一些實(shí)施方案中，樣品可被壓碎、均質(zhì)、制成泥、浸漬、混合、淆雜，或者以其他方式因其他目的被機(jī)械操作。

通過可控的機(jī)械破壞作用，樣品被均質(zhì)化且組分被提取。在一些實(shí)施方案中，可控的機(jī)械破壞作用可通過具有相對(duì)堅(jiān)硬的插入物附著的彈性端蓋的強(qiáng)制位移產(chǎn)生。所述的插入物可以是本文描述的伸長(zhǎng)元件。在不同的實(shí)施方案中，所述的插入物可以描述為活塞、柱塞、撞錘(rammer)、擴(kuò)孔器(reamer)、搗碎器(masher)、木槌(mallet)、沖擊器(impinger)、杵或者粉碎機(jī)(disrupter)。所述的插入物具有附著到端蓋的第一端，以及配置用于與用于制備的樣品接觸的第二端。所述的端蓋可以密封所述的樣品容器從而使所述的樣品截至與周圍壓力和環(huán)境隔離。在一些實(shí)施方案中，所述的端蓋是彈性的，以適應(yīng)因流體靜力壓縮引起的線性變形。在至少一個(gè)實(shí)施方案中，所述的端蓋可以是插入物的一部分。在其他實(shí)施方案中，運(yùn)動(dòng)可由誘導(dǎo)樣品孔收縮的壓力產(chǎn)生，其可使孔的底部接觸到所述插入物的尖端。所述的壓力可以一次或重復(fù)使用，例如在一個(gè)或多個(gè)壓力循環(huán)中，來優(yōu)化所需樣品的破壞的水平。在不同的實(shí)施方案中，所述的樣品孔可稱為容器(container)、容器(vessel)、支架(holder)或者管狀物。本文公開的一些實(shí)施方案中，所述的樣品孔可以由彈性或變形材料制成。在一些實(shí)施方案中，所述的樣品孔的彈性模量在大約80,000psi到100,000psi。在其他實(shí)施方案中，其可以為半剛性或剛性材料。例如，所述的樣品孔可以是聚四氟乙烯(PTFE)或氟化乙烯丙烯共聚物(FEP)。所述的樣品孔可以比樣品材料堅(jiān)硬。例如，所述的樣品孔可以具有至少R55的洛氏硬度(Rockwell)。

所述的插入物一般可以由比樣品更為堅(jiān)硬的任何材料制成。在一些實(shí)施方案中，所述的插入物可由堅(jiān)硬的材料制成，例如不銹鋼等金屬合金、玻璃、陶瓷或者可替換的實(shí)施方案可能涉及的是將堅(jiān)硬的物體或者砂礫插入所述的孔中，從而增加堅(jiān)硬的表面的硬度。在一些實(shí)施方案中，插入物的直徑可以大大減小并可以暫時(shí)懸浮在樣品容器的柔性膜上。在所述端蓋上方的部件或者端蓋的薄片，例如薄膜或墊子，可以沿所述膜的內(nèi)圓周以圓周運(yùn)動(dòng)施加壓力，從而在水平平面內(nèi)產(chǎn)生振蕩運(yùn)動(dòng)。在另外的實(shí)施方案中，在所述端蓋上方的部件或者端蓋的薄片，例如薄膜或墊子，可以以往復(fù)垂直運(yùn)動(dòng)施加壓力，例如在封閉的容器內(nèi)將相同運(yùn)動(dòng)傳遞到所述的伸長(zhǎng)部件。

在樣品已被均質(zhì)化后，提取的組分可以被轉(zhuǎn)移到用于細(xì)胞和組織成分的檢測(cè)和量化、藥物或環(huán)境污染物及其代謝產(chǎn)物的下游分析方法。在一些實(shí)施方案中，提取的組分的下游分析可以通過使用凝膠電泳、蛋白質(zhì)印跡(Western Blotting)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、化學(xué)親和力或者免疫親和性的富集實(shí)現(xiàn)。在一些實(shí)施方案中，提取的組分的下游分析可以通過使用色譜法(例如，薄層分析法、氣相色譜和高效液相色譜法)、微陣列、質(zhì)譜或串聯(lián)質(zhì)譜法(例如，液相色譜-質(zhì)譜法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法)實(shí)現(xiàn)。在一些實(shí)施方案中，提取的組分的下游分析可以通過使用聚合酶鏈反應(yīng)和短串聯(lián)重復(fù)法實(shí)現(xiàn)。

在一些非限定性的實(shí)施方案中，一次性插入物可以通過柔性蓋墊(通常是硅或者類似材料)以所需的陣列(通常為9mm間距)保存。所述的蓋墊可以作為陣列的樣品孔的平面的端蓋。當(dāng)所述的蓋墊受力或受到壓力，所述的蓋墊可以變形并推動(dòng)所述插入物進(jìn)一步進(jìn)入到相關(guān)的孔中，導(dǎo)致在每個(gè)孔中的內(nèi)容物的均質(zhì)化的動(dòng)作。在一些實(shí)施方案中，所述的孔可在具有與每個(gè)孔的輪廓匹配的單獨(dú)腔室內(nèi)在支架內(nèi)被支撐。所述的支架可由剛性材料制成，例如塑料或金屬。在一些實(shí)施方案中，所述的金屬可為耐腐蝕的。例如，所述的金屬可以是黃銅、不銹鋼和鋁的至少一種。所述的支架的目的是支撐所述的孔和防止孔壁的撕裂，并促進(jìn)所述容器和所述端蓋之間的干涉配合和在所述容器、所述端蓋或二者同時(shí)的變形期間維持密封。在一些實(shí)施方案中，可以沒有支架的存在。

在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述孔的支架的位置可以是固定的，并且可以向所述蓋墊施加一個(gè)力或者壓力以形成所述蓋墊的偏轉(zhuǎn)，隨后進(jìn)行所述插入物的向下運(yùn)動(dòng)。向下力可由液體處理機(jī)器人的臂提供。在其他實(shí)施方案中，頂板可被固定，所述的孔或孔的支架可被移動(dòng)。

在其他實(shí)施方案中，所述的頂板和孔支架都可以保持靜止，并且所述的支架可以被加壓以使每個(gè)孔在徑向和軸向上折疊。這也將導(dǎo)致所述插入物的尖端和所述孔的底部之間的空間被減少。在一些實(shí)施方案中，非常高的流體靜壓，例如大約10,000psi，或者更大的流體靜壓，例如20,000psi，或者更大的流體靜壓，可被施加從而加強(qiáng)提取。施加到所述樣品容器的最小的壓力可能取決于試樣的性質(zhì)。舉例來說，施加到所述樣品容器上的最小壓力可能取決于所述試樣的硬度。施加到所述樣品容器上的最小壓力可能取決于所述樣品容器和所述插入物的組合物。在一些實(shí)施方案中，所述最小壓力可能是5000psi。施加到所述樣品容器上的最大壓力可能取決于所述設(shè)備的技術(shù)規(guī)格。在一些實(shí)施方案中，所述最大壓力可能是100,000psi。在一些實(shí)施方案中，最大壓力可能被施加到所有樣品上，除非所需的是部分均質(zhì)化。在本文討論的其他實(shí)施方案中，所述的插入物可被擴(kuò)張展開從而導(dǎo)致所述樣品的機(jī)械破壞。

根據(jù)一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案，樣品制備過程可以在與現(xiàn)代流通處理設(shè)備兼容的隔離容器和樣品容器陣列中進(jìn)行。例如，樣品容器可以以中心距測(cè)量間隔大約9mm的間距的陣列布置。這可與用于微孔板的ANSI-SBS標(biāo)準(zhǔn)兼容。在一些方面，所述的技術(shù)可能涉及樣品沒有旋轉(zhuǎn)的機(jī)械故障。樣品制備和后續(xù)的用于分析的提取可能都在封閉或密封的容器中進(jìn)行，實(shí)質(zhì)上與外部環(huán)境隔離。

根據(jù)一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案，可以根據(jù)特定情況修改所述的管狀物的間距和陣列結(jié)構(gòu)。例如，代替9mm間隔的矩形陣列的是可以使用一些其他的間距的圓形陣列。

這種技術(shù)可同時(shí)施用于大量的樣品用于高吞吐量的處理。舉例來說，在工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)格式排列的樣品，如96孔PCR板可被處理。在一些實(shí)施方案中，使用的是96孔美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)微孔板?；阚E的外部尺寸在外角的1.7mm內(nèi)測(cè)量，其可以是大約127mm長(zhǎng)、大約85mm寬。所述板的底部法蘭的四個(gè)外角可能有一個(gè)大約3mm的外側(cè)半徑。如上所述，所述的孔可以以中心距間隔大約9mm間距的陣列排布。所公開的機(jī)制能夠從感興趣的生物樣品中提取蛋白質(zhì)、DNA和其他分析物，包括RNA和脂類。值得注意的是，根據(jù)不同的實(shí)施方案，傳統(tǒng)的研缽和杵的旋轉(zhuǎn)動(dòng)作并不是必須的。在某些實(shí)施方案中，線性運(yùn)動(dòng)也不是必須的。

熱量和/或高剪切應(yīng)力的產(chǎn)生可以避免提取的組分的完整性。在一些實(shí)施方案中，所述過程的溫度是由護(hù)套(jacket)、珀?duì)柼?peltier)或其他類型的冷卻器主動(dòng)維護(hù)的。在一些實(shí)施方案中，所述的護(hù)套可含有水、防凍液或任何其他液體。在壓力循環(huán)過程中，由于水的壓縮和樣品被淹沒在水中，絕熱生成相對(duì)較低。例如，如果所述的過程是在室溫下進(jìn)行的，且水作為壓力介質(zhì)，則絕熱產(chǎn)生可能在大約1℃到大約20℃之間。與此相反，在樣品均質(zhì)化的典型的機(jī)械方式中，設(shè)備的動(dòng)能被轉(zhuǎn)換為所述樣品的內(nèi)部能量，或者熱量。同樣的，超聲波均質(zhì)化使用空化能量來破壞樣品組分?？栈矔?huì)將動(dòng)能變成熱能。在樣品均質(zhì)化和空化的傳統(tǒng)機(jī)械方式中，如果不是間歇冷卻，樣品可能會(huì)達(dá)到100℃。

在一些實(shí)施方案中，如附圖1、2a-2c所示，待破壞的小試樣105被限制在所述樣品容器101的底部和插入物部件102之間形成的窄腔104中，直到其通過在所述插入物部件和容器壁之間的環(huán)形間隙6進(jìn)入在所述插入物部件上方的空間107被擠壓。這個(gè)過程可以由所述插入物部件在垂直尺寸上的往復(fù)運(yùn)動(dòng)驅(qū)動(dòng)，如附圖2所示。所述的插入物部件被附著到所述的可變形的端蓋材料103上，其中所述的可變形的端蓋材料103具有足夠的柔性以使此運(yùn)動(dòng)發(fā)生。在一些實(shí)施方案中，施加到所述柔性端蓋上的機(jī)械力可促進(jìn)所述插入物的運(yùn)動(dòng)。在其他實(shí)施方案中，將帶有樣品、提取溶液和剩余空氣的整個(gè)封閉的容器放置到流體靜壓容器中并受到交變的流體靜壓循環(huán)。柔性端蓋103的柔性變形是由于所述試樣容器的內(nèi)外部壓力差造成的，進(jìn)而導(dǎo)致所述插入物部件在所述試樣容器內(nèi)部的往復(fù)運(yùn)動(dòng)，同時(shí)所述容器保持緊密閉合。

在一些實(shí)施方案中，如附圖3所示，插入物支架309被附著到可變形的端蓋材料303上。插入物之間的形狀和尺寸設(shè)置為在插入物部件302的近端接收和支撐插入節(jié)點(diǎn)308。

在其他的實(shí)施方案中，如附圖4和5所示，所述的樣品容器用不可變形端蓋封閉，其延伸進(jìn)入所述的容器并包括所述的插入物部件。當(dāng)封閉的管狀物受到高流體靜壓時(shí)，所述的管狀物變形并且其尺寸變小。所述插入物部件的尺寸，其由較少的可壓縮材料制成，保持相對(duì)不變。由于所述管狀物相對(duì)于所述插入物部件的軸向運(yùn)動(dòng)，樣品材料在所述插入物部件和管壁之間被壓縮并通過由此產(chǎn)生的環(huán)形間隙擠壓。所述管狀物內(nèi)空氣的存在導(dǎo)致了所述的管狀物相對(duì)于所述插入物部件的更大的壓縮，從而導(dǎo)致更大程度的機(jī)械運(yùn)動(dòng)和樣品均質(zhì)化。在其他實(shí)施方案中，交替形狀的插入物主體包括凹入?yún)^(qū)域，從而允許更多的空氣保留在封閉的管狀物內(nèi)。從外部壓縮的管狀物的FEA計(jì)算機(jī)模擬(附圖6)確定了軸向收縮和擴(kuò)張?jiān)诮惶娴牧黧w靜壓條件下是所述管狀物的優(yōu)選變形。具體到所述管狀物設(shè)計(jì)和材料的可壓縮性或其他參數(shù)可能影響所述變形的性質(zhì)。

附圖4a提出了由于流體靜壓的應(yīng)用涉及局部收縮的示意圖。施加壓力后，樣品容器401的壁壓縮到壓縮后的樣品容器421。此外，樣品402被擠壓到所述的壁從而產(chǎn)生均質(zhì)化的樣品422。

附圖4b提出了由于流體靜壓的應(yīng)用涉及局部收縮的示意圖。在所述壁的下部的流體靜壓導(dǎo)致了孔的徑向收縮、孔長(zhǎng)的軸向收縮和樣品向上的移動(dòng)并經(jīng)過所述的插入物。每個(gè)試樣被放置到多孔樣品容器412的單獨(dú)的可變形壁中。隨后，孔的陣列被容器端蓋陣列413關(guān)閉，其中容器端蓋陣列413含有附著其中的剛性插入物414，其伸入到每個(gè)孔中。在每個(gè)孔建立密封之后，整個(gè)多孔容器被放置到流體靜壓腔室411中并用剛性腔蓋410關(guān)閉。然后，加壓流體被引導(dǎo)進(jìn)入所述的壓力腔室415，包圍所述的樣品孔，造成樣品孔壁對(duì)剛性插入物的壓縮，導(dǎo)致試樣破碎和均質(zhì)化。如果需要的話，所述的過程可重復(fù)多次。在該實(shí)施方案中，由于所述的端蓋陣列被支撐在剛性腔蓋上，其并不會(huì)顯著變形。

附圖5a提出了涉及均勻流體靜力收縮的示意圖。當(dāng)施加壓力時(shí)，樣品容器503的壁壓向壓縮的樣品容器523，并且可變形端蓋508壓向壓縮的可變形端蓋528。除此之外，樣品507壓在所述的壁上從而產(chǎn)生均質(zhì)的樣品527。

附圖5b示出了涉及均勻的流體靜力收縮的示意圖。每個(gè)試樣被置于多孔樣品容器503的單獨(dú)的可變形孔中。隨后，每個(gè)孔被可變形的容器端蓋陣列504封閉，其中所述的可變形的容器端蓋陣列504含有附著的剛性插入物505，其伸入到每個(gè)孔中。在每個(gè)孔的密封建立之后，整個(gè)多孔容器被放置到流體靜壓腔室502中并由腔蓋501封閉。然后，加壓的流體被引導(dǎo)進(jìn)入壓力腔室506，包圍所述的樣品孔，造成樣品孔壁對(duì)剛性插入物的壓縮，導(dǎo)致試樣的粉碎和均質(zhì)化。除此之外，在容器端蓋陣列之上的流體靜壓造成所述單獨(dú)的端蓋向每個(gè)孔的內(nèi)部變形并進(jìn)一步均質(zhì)化所述的試樣。如果需要的話，該過程可以被多次重復(fù)。

在一些實(shí)施方案中，插入物可以穿過端蓋并通過壓縮來密封，即隔膜。這將允許向所述過程中添加旋轉(zhuǎn)動(dòng)作，然后所述的插入物可以獨(dú)立于端蓋移動(dòng)。

附圖7a和7b示出了涉及擴(kuò)展的插入物的實(shí)施方案。端蓋/插入物組件的組合可以通過壓力的膨脹徑向擴(kuò)展。這可以粉碎在所述插入物和所述孔的壁之間的樣品。所述的孔可被支撐以使其不能移動(dòng)。端蓋(704)和插入物(705)組件的組合的使用，可通過壓力膨脹來進(jìn)行軸向和徑向的擴(kuò)展。擴(kuò)展所述的插入物將粉碎在所述插入物和所述孔的壁之間的樣品。所述的孔壁(703)將被支撐在剛性塊(701)上，因此其不能夠向外移動(dòng)。通過在模塊蓋(702)中的歧管(707)，流體或氣體進(jìn)入所述的插入物內(nèi)部腔室(706)，膨脹被介導(dǎo)。

根據(jù)一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案，裝置可以與多個(gè)下游的反應(yīng)步驟集成，例如，在樣品均質(zhì)化后的還原、烷基化和酶消化等。均質(zhì)化的樣品可以保持在所述的樣品停留在所述的樣品管中，同時(shí)端蓋包括減小尺寸的伸長(zhǎng)部件，如長(zhǎng)度可用于為所需實(shí)際的逐步添加提供更多的空間。

這些實(shí)施例和其他實(shí)施例的功能和優(yōu)點(diǎn)將通過以下非限制性實(shí)施例來更為充分地理解。所述的實(shí)施例的目的在性質(zhì)上是說明性的，其不應(yīng)被視為為在此討論的實(shí)施例的保護(hù)范圍的限定。

實(shí)施例

實(shí)施例1：優(yōu)化插入物形狀

腎組織樣品被放置在用于分析制備的樣品容器中。大約3-6mg的腎組織樣品被放置到8個(gè)樣品容器的每個(gè)中。所述的樣品容器被放置到充滿水的腔室中，其在20,000psi的壓力下加壓10個(gè)循環(huán)。每個(gè)循環(huán)包括20秒處于20,000psi，隨后10秒處于大氣壓力。組織破壞的程度進(jìn)行了視覺評(píng)估。如附圖8b所示，未粉碎的組織塊是深色的并保留在所述管狀物的底部。粉碎的組織均漿為淺色的并沿所述管狀物的壁被粉碎。

如附圖8a和8b所示，至少幾種插入物形狀是可以使用的。如附圖8b所示，間隙尺寸對(duì)樣品均質(zhì)化的程度的影響進(jìn)行了評(píng)估。樣品管狀物內(nèi)徑保持不變，為0.125”。通過改變插入物的直徑，插入物和管狀物的壁之間的間隙的量被改變。使用直徑為0.100”、0.112”和0.124”的直的插入物表明在插入物和管狀物的壁之間的緊密配合對(duì)良好的組織破壞是必要的。具有相同尖端直徑的不同形狀的插入物的比較表明了所述樣品擠壓通過在插入物和管狀物的壁之間的環(huán)形間隙有助于顯著的均質(zhì)化機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)還表明了在本設(shè)計(jì)中，所述尖端的直徑是重要的因素。使用錐形的插入物具有附加的優(yōu)點(diǎn)，所述管狀物內(nèi)部的可用的樣品體積大于使用直的插入物，從而導(dǎo)致了在加壓期間更大程度上的管狀物的變形。

實(shí)施例2：優(yōu)化插入物配合

各種直徑的錐形插入物被用于均質(zhì)化肝組織樣品。肝組織樣品被放置到內(nèi)徑為0.125英寸的樣品容器中用于分析制備。大約0.5到大約1.5mg的肝組織樣品被放置到80個(gè)樣品容器的每個(gè)中。所述的樣品容器被放置到充滿水的腔室中，其在35,000psi下加壓60個(gè)循環(huán)。每個(gè)循環(huán)包括20秒在35,000psi，隨后10秒大氣壓力。組織破壞的程度被視覺評(píng)估，同時(shí)，所提取的蛋白質(zhì)的產(chǎn)量通過Bradford法測(cè)量并通過每毫克(mg)組織重量的微克(μg)蛋白質(zhì)表示。附圖9示出了尖端直徑(因此，也可表示所述環(huán)狀間隙的尺寸)對(duì)組織破壞和從所述組織試樣中提取蛋白質(zhì)的效率的影響的效果。使用不同直徑的錐形插入物表明了太緊的配合導(dǎo)致了低效的組織破壞，可能是由于將組織壓緊在管狀物的底部，并且不允許足夠的間隙用于組織被沿著所述管狀物的側(cè)壁向上擠壓通過所述插入物的尖端。在附圖9中可以看出，在0.118-0.122英寸之間的插入物直徑產(chǎn)生的蛋白質(zhì)產(chǎn)量高于在0.114-0.118英寸之間的插入物直徑。在0.114-0.118英寸之間的插入物直徑產(chǎn)生的蛋白質(zhì)產(chǎn)量高于在0.110-0.114英寸之間的插入物直徑，而在0.110-0.114英寸之間的插入物直徑產(chǎn)生的蛋白質(zhì)產(chǎn)量高于在0.122-0.126英寸之間的插入物直徑。

實(shí)施例3：優(yōu)化壓力循環(huán)的數(shù)量

大約0.6-1.7mg的大鼠肝臟的樣品和大約30μl的IEF提取試劑(在去離子水中的7M尿素、2M硫脲和4％CHAPS)被加入到每個(gè)管狀物中。在指定的循環(huán)數(shù)目下，在35,000psi的壓力下進(jìn)行壓力循環(huán)破壞。陰性對(duì)照是不間斷的組織塊，其被允許可以浸泡在所述

附圖10示出了壓力循環(huán)的次數(shù)對(duì)蛋白質(zhì)提取效率的影響。錐形插入物被用于在高壓管狀物壓縮產(chǎn)生的樣品破壞期間組織均質(zhì)化發(fā)生過程中檢測(cè)所述機(jī)制。

樣品以不同長(zhǎng)度的時(shí)間被均質(zhì)化，其使用了高壓為35,000psi和低壓為大氣壓力的0、10、60或99個(gè)循環(huán)。所述的樣品保持在所述的管狀物內(nèi)的總時(shí)間保持不變，只有壓力循環(huán)的數(shù)量是變化的。如附圖10所示，相對(duì)于總量為10的壓力循環(huán)，總量為60的壓力循環(huán)產(chǎn)生了較高的蛋白質(zhì)產(chǎn)量。通過使用99個(gè)壓力循環(huán)減少樣品破壞中的蛋白質(zhì)產(chǎn)量，過度均質(zhì)化的效果是明顯的。這種過度均質(zhì)化的效果可能是由于蛋白質(zhì)聚集或沉淀，同時(shí)在高流體靜壓下處于部分展開狀態(tài)。相比于沒有壓力循環(huán)，每種壓力循環(huán)的數(shù)量)—10、60和99—產(chǎn)生了更大的蛋白質(zhì)產(chǎn)量。

實(shí)施例4：優(yōu)化壓力循環(huán)的壓力和數(shù)量

少于2mg的大鼠肝臟的樣品和30μl的IEF提取試劑被加入到每個(gè)管狀物中。在指定的循環(huán)數(shù)目下，作為指定壓力，使用錐形插入物在35,000psi的壓力下進(jìn)行壓力循環(huán)破壞。陰性對(duì)照的處理與試驗(yàn)樣品相同，但不進(jìn)行壓力循環(huán)。

附圖11示出了膨脹/收縮循環(huán)的壓力和數(shù)目對(duì)從組織樣品中提取蛋白質(zhì)的效率的影響。

樣品使用不同程度的壓力和循環(huán)數(shù)目進(jìn)行均質(zhì)化。所述的樣品保持在所述的管狀物內(nèi)的總時(shí)間保持不變，只有壓力循環(huán)的數(shù)量是變化的。通過使用99個(gè)壓力循環(huán)略微減少樣品破壞中的蛋白質(zhì)產(chǎn)量，過度均質(zhì)化的效果是明顯的。這種過度均質(zhì)化的效果可能是由于壓力誘導(dǎo)蛋白質(zhì)聚集或蛋白質(zhì)沉淀。相比于10,000psi，35,000psi處理后的樣品的蛋白質(zhì)產(chǎn)量略微改善，這表明了在較高的壓力之下，更為劇烈的管狀物壓縮可以導(dǎo)致稍好的組織均質(zhì)化。

實(shí)施例5：減少樣本大小優(yōu)化效率

解凍后的大鼠肝臟和心肌組織樣品用PBS沖洗和吸干后稱重(每組n＝6)。大約30μL的裂解緩沖液被加入到每個(gè)樣品中。如附圖12a所示，使用所述的錐形插入物，相比于較大的樣品(每個(gè)樣品5-10mg)，將每個(gè)樣品的樣品質(zhì)量減少到≤2mg得到更佳的產(chǎn)量(如以每毫克組織質(zhì)量的微克蛋白質(zhì)測(cè)量)。如附圖12b所示，當(dāng)使用類似的質(zhì)量和體積條件時(shí)，使用所述的錐形插入物以使用陽性對(duì)照的產(chǎn)量類似的壓力從肝臟組織中獲得的蛋白質(zhì)產(chǎn)量(在附圖中標(biāo)記為“微杵”)。陽性對(duì)照是使用一次性塑料杵手動(dòng)均質(zhì)化的。陰性“浸泡”對(duì)照并沒有以任何方式斷開，所述組織在裂解緩沖液中以與其他樣品相同的總時(shí)間孵育。插入物被用于壓力循環(huán)。

實(shí)施例6：相比于聲波降解法，插入物更為有效

肝臟組織在IEF中使用常規(guī)協(xié)議(在40,000psi下60循環(huán))、單獨(dú)使用聲波降解法(在超聲浴中2x30s)或二者結(jié)合(40,000psi下30循環(huán)對(duì)30s聲波降解與40,000psi下30循環(huán)對(duì)30s聲波降解)提取。所有樣品包括在30μL裂解緩沖液中<2mg的組織。每組具有6個(gè)樣品。

如附圖13所示，相比于兩種方法的結(jié)合，常規(guī)微杵協(xié)議產(chǎn)生了更大的產(chǎn)量，而相比于單獨(dú)使用聲波降解法，兩種方法的結(jié)合產(chǎn)生更大的產(chǎn)量。

實(shí)施例7：插入物的再利用對(duì)蛋白質(zhì)產(chǎn)量的影響

兩批次插入物被用于具有大鼠肝臟組織的1-6-14。一個(gè)較老批次已經(jīng)多次使用，其包含的杵具有尖端直徑大約0.120英寸到大約0.123英寸。一個(gè)新的批次具有稍寬的杵直徑，大約為0.127英寸，其得到了稍低的整體產(chǎn)量。然后，他們被清洗并重新運(yùn)行14次，每次運(yùn)行60循環(huán)，共840循環(huán)。每次運(yùn)行時(shí)，所述的插入物從所述管狀物中移除并重新插入。然后，這些相同的20個(gè)“新”插入物被再次用于肝臟組織的1-10-14。

如附圖14所示，重新使用這些插入物不會(huì)改善或損壞其有效性。除此之外，這些結(jié)果表明老批次更好，而差異性并不是由于老批次的再利用。這些結(jié)果表明了在所述樣品容器和所述插入物之間的尺寸公差的重要性及所述插入物的最佳性能。如果間隙太大或太小，其均質(zhì)化的結(jié)果是不好的。

實(shí)施例8：具有插入物的壓力循環(huán)與不具有插入物的壓力循環(huán)的對(duì)比

在大約0.5和大約1.5mg之間的大鼠肝臟組織的樣品在PBS中沖洗和吸干后稱重(每組n＝12)。所有的樣品(除陰性對(duì)照外)在45,000psi壓力下60次循環(huán)處理。循環(huán)的長(zhǎng)度被調(diào)整以改進(jìn)在裂解緩沖液中的總培養(yǎng)時(shí)間。每次半分鐘的循環(huán)用于0.5小時(shí)樣品。每次1分鐘的循環(huán)用于1小時(shí)樣品。如附圖15所示，沒有插入物，無論所述組織樣品受到壓力與否，產(chǎn)量都是相同的，不管其他因素，例如體積(30μL對(duì)60μL)或者培養(yǎng)時(shí)間(0.5小時(shí)對(duì)1小時(shí))，暗示了壓力循環(huán)本身并不能有效地破壞組織結(jié)構(gòu)釋放細(xì)胞蛋白。只有對(duì)具有所述錐形插入物的樣品加壓，其產(chǎn)量才會(huì)顯著增加。

實(shí)施例9：壓力水平對(duì)具有錐形插入物的提取效果的影響

在大約0.5和大約1.5mg之間的組織樣品在PBS中沖洗和吸干后稱重(除非另有說明，否則每組n＝10)。30μL的裂解緩沖液添加到每個(gè)樣品中。在有壓力循環(huán)和無壓力循環(huán)下使用插入物。壓力循環(huán)是在指定壓力下進(jìn)行了30次循環(huán)。柱形圖示出了從肝臟組織中提取蛋白質(zhì)的平均±標(biāo)準(zhǔn)偏差。表格示出了從心肌組織中提取蛋白質(zhì)的產(chǎn)量和平均值的標(biāo)準(zhǔn)差(SEM)。0kpsi對(duì)照指示的是設(shè)置具有插入物，但無壓力循環(huán)。這并不同于“僅浸泡”對(duì)照。如附圖16所示，45kpsi的壓力產(chǎn)生的蛋白質(zhì)含量最高。

實(shí)施例10：具有壓力和插入物的提取可與其他方法相結(jié)合用于在分析前的樣品制備

如附圖17所示的錐形插入物801，其是幾種可互換的插入物802、803、804中的一種，其可在壓力之下與樣品管狀物805一起使用。因此，無需將所述樣品從一個(gè)容器中轉(zhuǎn)移到其他容器中，其可進(jìn)行以下協(xié)議，從而減少了樣品損失、交叉污染和暴露于用戶的風(fēng)險(xiǎn)：

1.將組織放置到含有4M尿素的30μl裂解緩沖液的樣品管狀物內(nèi)并用錐形插入物密封。

2.將用插入物密封的管狀物放置到盒子901中，其設(shè)計(jì)用于在Barocycler機(jī)器壓力處理(附圖18)期間支撐所述的管狀物902。所述的盒子被設(shè)計(jì)用于保證所述管狀物的安全，同時(shí)防止端蓋的松動(dòng)(其可能會(huì)導(dǎo)致樣品泄漏(出)或壓力介質(zhì)的泄漏(入))。

3.用壓力循環(huán)處理所述樣品。

4.從Barocycler機(jī)器和盒子上移除管狀物。移除所述的錐形插入物。

5.向所述管狀物內(nèi)的均質(zhì)化后的樣品中加入10μl適當(dāng)?shù)木彌_液來稀釋裂解緩沖液中的尿素，從4M到3M。加入適當(dāng)?shù)拿?，例如蛋白酶賴氨?C(proteinase Lys-C)。

6.用端蓋密封所述的管狀物，其中所述端蓋足夠長(zhǎng)從而代替多余的空氣并防止管狀物在壓力之下的凹陷，但是又足夠短從而能夠容納所述的樣品體積，并且將所述密封的管狀物放置到設(shè)計(jì)用于在壓力處理期間支撐所述的管狀物的盒子中。

7.在適當(dāng)?shù)臈l件下使用壓力循環(huán)處理所述的樣品用于加速消化賴氨酸-C。

8.從Barocycler機(jī)器和盒子上移除管狀物。移除所述的長(zhǎng)端蓋。

9.向所述管狀物內(nèi)部分消化的樣品中加入100μl適當(dāng)?shù)木彌_液從而稀釋緩沖液中的尿素從3M到0.8M。添加適當(dāng)?shù)拿?，例如胰蛋白酶?/p>

10.用短的端蓋密封填滿后的管狀物，其中短的端蓋用于容納全部的樣品體積。將密封后的管狀物放置到設(shè)計(jì)用于在壓力處理期間支撐所述管狀物的盒子中。

11.在適當(dāng)條件下使用壓力循環(huán)處理所述的樣品從而用胰蛋白酶加速消化。

鑒于已經(jīng)對(duì)本發(fā)明的某些用于舉例說明的實(shí)施方案進(jìn)行了描述，對(duì)于本領(lǐng)域內(nèi)的任何一名普通技術(shù)人員來說是顯而易見的是，上述內(nèi)容僅僅是出于進(jìn)行解釋說明的目的，而非是對(duì)本發(fā)明的限制，而且僅僅是出于可以效仿的目的。本發(fā)明的各種不同的修改和其他的實(shí)施方案都是在本領(lǐng)域內(nèi)的任何一名普通技術(shù)人員可以理解的范圍之內(nèi)的，并且完全落入到本發(fā)明的范圍之內(nèi)。特別是，盡管本文在此所提供的實(shí)施例中的絕大部分都包括方法步驟或系統(tǒng)元件的特定組合，但人們可以理解的是，所述步驟和元件都可以以其他方式進(jìn)行組合，從而實(shí)現(xiàn)相同的目的。值得注意的是，本文所討論的裝置、系統(tǒng)和方法的實(shí)施方案并不限于以下介紹中所描述或附圖所示的組件的結(jié)構(gòu)和布置的細(xì)節(jié)的應(yīng)用。所述裝置、系統(tǒng)和方法能夠在其他的實(shí)施方案中以各種方式實(shí)施或進(jìn)行。在此提供的具體實(shí)現(xiàn)的實(shí)施例僅供說明，不應(yīng)視為限制。特別是，與任何一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案有關(guān)的步驟、元件和特征不應(yīng)當(dāng)被任何其他實(shí)施方案的相似角色所排斥。

本領(lǐng)域內(nèi)的任何一名普通技術(shù)人員都可以理解的是，本文在此所描述的各種參數(shù)和配置結(jié)構(gòu)都是出于可以效仿的目的，而實(shí)際的參數(shù)和/或配置結(jié)構(gòu)將取決于本發(fā)明中所使用的系統(tǒng)和技術(shù)的特定應(yīng)用。本領(lǐng)域內(nèi)的任何一名普通技術(shù)人員也都能意識(shí)到或者都可以確定的是，可以使用不止一種的常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法，與本發(fā)明的特定的實(shí)施方案相等的方案。因此，人們可以理解，本文在此描述的各種實(shí)施方案僅僅是處于可以效仿的目的，而且都在隨附的權(quán)利要求書的范圍之內(nèi)并與之等同；除了特定的描述之外，本發(fā)明也是可以實(shí)踐的。

而且，人們可以理解的是，本發(fā)明所針對(duì)的是本文在此描述的每一種特征，系統(tǒng)，子系統(tǒng)或者技術(shù)，以及本文在此描述的兩種或更多的特征，系統(tǒng)，子系統(tǒng)和/或者方法的任意的結(jié)合，如果所述的特征，系統(tǒng)，子系統(tǒng)和技術(shù)是相互協(xié)調(diào)的話，都可以被認(rèn)為是在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，并且都可以體現(xiàn)在權(quán)利要求中。更進(jìn)一步說，與一個(gè)實(shí)施方案結(jié)合在一起就討論的步驟，元素和特征都不應(yīng)當(dāng)被其他的實(shí)施方案中的相同的內(nèi)容所排斥。

在此使用的措辭和術(shù)語是用于說明的目的，并且不應(yīng)當(dāng)被視為限制。正如本文中所使用的，術(shù)語“數(shù)量眾多”是指兩個(gè)或更多的項(xiàng)目或部件。術(shù)語“包括(including)”、“包括(comprising)”、“攜帶(carrying)”、“具有(having)”、“包含(containing)”和“涉及(involving)”，無論是出現(xiàn)在說明書還是在權(quán)利要求書中，都是開放式的術(shù)語，即，它們是指“包括但不限于”的意思。因此，所述術(shù)語的使用意在涵蓋其所附的全部項(xiàng)目，及其等同物，以及其他的項(xiàng)目。僅僅是這樣一些傳統(tǒng)的措辭，例如，“由……組成”，“實(shí)質(zhì)上由……組成”是封閉式的或者半封閉式的傳統(tǒng)的措辭是分別與權(quán)利要求相關(guān)的。序數(shù)詞的使用，例如“第一”，“第二”，“第三”，以及在權(quán)利要求中的類似的序數(shù)詞是用于修改權(quán)利要求的，其本身并不意味著任何優(yōu)選性，順序性或者一個(gè)權(quán)項(xiàng)位于其他的權(quán)項(xiàng)或時(shí)間順序之前，其中方法的步驟先于執(zhí)行，實(shí)際上，這些術(shù)語的使用僅僅是進(jìn)行標(biāo)記，以便區(qū)分一個(gè)權(quán)項(xiàng)中的元素具有區(qū)別于另外一個(gè)具有相同的名稱的元素(是順序術(shù)語的使用)，從而對(duì)權(quán)利要求的元素進(jìn)行區(qū)分。