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一種新型小分子肽和其在阿爾茲海默癥檢測中的應(yīng)用的制作方法

文檔序號:11702350閱讀:589來源:國知局
一種新型小分子肽和其在阿爾茲海默癥檢測中的應(yīng)用的制作方法與工藝

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域,更具體地,涉及一種新型可與人ad7c-ntp特異性結(jié)合的小分子肽及其應(yīng)用。



背景技術(shù):

阿爾茲海默癥是一種中樞神經(jīng)退行性疾病,多發(fā)于老年人,主要癥狀為漸進性記憶丟失、認(rèn)知功能障礙、智力水平的慢性缺失。據(jù)統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明,65歲以上老人中發(fā)病率約為6%-12%,80歲以上的老人發(fā)病率為20%-40%,每年新增的癡呆人數(shù)達到近770萬人,且每二十年老年癡呆患者數(shù)量增長一倍。到2020年,患者數(shù)目將高達6000萬人;預(yù)計到2050年,將有約1.2億人受到老年癡呆的影響。2013年,我國65歲以上的老年人人口數(shù)量達到1.4億,我國目前至少有600萬老年癡呆癥患者,加之中國人口基數(shù)大、老齡化程度高,因此對于中國來說,該疾病也是一個強大的負(fù)擔(dān)。2010年全球癡呆成本約6040億美元,相當(dāng)于全球總gdp的1%,其增長幅度可能會比患病率還要高,因而給家庭、社會帶來了巨大的經(jīng)濟、人力負(fù)擔(dān)。因此,阿爾茲海默癥的及時診斷與治療越來越受到廣泛的關(guān)注與重視,早期診斷也成為了一個熱點的話題。

到目前為止,阿爾茲海默癥的診斷存在著如下的問題:1.基于美國精神醫(yī)學(xué)學(xué)會出版的《精神疾病診斷與統(tǒng)計手冊》為基礎(chǔ)的結(jié)合量表診斷,在可信度、有效度、方便性等方面受到很大的局限;同時,量表存在一定的主觀性,對于病人的心理因素、文化差異、地域差異、年齡等相關(guān)因素影響較大,所以可能造成針對不同醫(yī)護人員與患者造成診斷結(jié)果不一的情況。2.基于病理學(xué)的檢查需要獲取腦組織,這一有創(chuàng)性檢查實施難度較大,且難以讓患者與其家屬接受,可行性較差。3.對于影像學(xué)檢查來說,腦核磁共振(mri)是老年癡呆臨床鑒別診斷最主要的工具,可以很好的顯示出腦的形態(tài)的改變,是ad檢測很好的指標(biāo),但是該種方法需要持續(xù)觀測,因此需要定期檢查,這對于一些家庭可能會造成較大的經(jīng)濟負(fù)擔(dān),因此普及性不強。pet檢查可以診斷與ad相關(guān)的代謝異常,但是價格昂貴,不適用于常規(guī)的檢查。功能核磁共振(fmri)可以在ad早期提供更多的信息,但受其它功能影響較大,因此在臨床上其診斷價值還需要進一步提高。

對于早期診斷來說,又具有如下局限:1.標(biāo)志物存在于腦脊液中,獲取困難,取材受到嚴(yán)重的影響,因此臨床上難以運用。2.目前檢測采用的磷酸化的tau蛋白無特異性,在其它神經(jīng)系統(tǒng)疾病中也有變化,難以診斷。3.其它如igfbp6、cxcl8、icam-1等的標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)以及酶的測定對診斷沒有指導(dǎo)意義,僅限于描述性研究,并無實用價值。

ntp又稱為神經(jīng)絲纖維蛋白,是人體大腦中一類磷蛋白,可以與神經(jīng)絲蛋白(ptp)發(fā)生交叉反應(yīng),該類蛋白與神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)生與分化和神經(jīng)變性以及突出丟失有關(guān)。suzannedelamonte等首次在ad患者的腦脊液中發(fā)現(xiàn)ad7c-ntp蛋白,該蛋白大小為41kd,含有375個氨基酸。隨著研究發(fā)現(xiàn),腦脊液與尿液中該蛋白的表達水平與ad的嚴(yán)重程度呈顯著性相關(guān)關(guān)系,因此ad7c-ntp作為ad的一個生化指標(biāo),是一個敏感性和特異性極強的蛋白,對ad的檢測有著極其重要的作用,這種無創(chuàng)性檢測對于老年人常規(guī)體檢有著非常廣闊的前景。

目前,基于ad7c-ntp檢測的方法均以ad7c-ntp的抗原決定簇肽段交聯(lián)血蘭蛋白作為抗原制備抗體,從而進一步檢測使用。該方法具有如下的缺陷:1.多克隆抗體特異性低、易發(fā)生交叉反應(yīng)。2.制備過程復(fù)雜、方法批間重復(fù)性差。3.價格較高、無普適性。



技術(shù)實現(xiàn)要素:

本發(fā)明的目的在于提供一種特異性結(jié)合ad7c-ntp的小肽及其應(yīng)用。

本發(fā)明提供了一種小肽,其序列為seqidno.1和seqidno.2中的任一項所示。

本發(fā)明的小分子親和肽,所述小分子親和肽與人ad7c-ntp特異性結(jié)合。進一步的,本發(fā)明的小肽可用于檢測ad7c-ntp。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比,具有以下優(yōu)點和有益效果:

1)高效:該小肽可以與ad7c-ntp特異性結(jié)合。

2)安全:該小分子親和肽分子量小(小于6肽),其殘基序列取自20種必需氨基酸。

3)經(jīng)濟:該小肽由固相合成而得,成本較低且便于質(zhì)量管控。

附圖說明

圖1為檢測dewh與ad7c-ntp結(jié)合能力以及結(jié)合率。

圖2為檢測wrdw與ad7c-ntp結(jié)合能力以及結(jié)合率。

具體實施方式

實施例1:小分子肽合成

1)活化樹脂:吸取0.75mlaf-amino-650m樹脂,加入10-15mldmf浸泡,使其充分溶脹。

2)縮合反應(yīng):連接下一個氨基酸,稱取fmoc-氨基酸的用量是1.4mmol/g樹脂,910mgtbtu,加入10mldmf和0.45ghobt混和均勻后,加入0.52mldiea配成反應(yīng)液,室溫下氮氣吹沸反應(yīng)2h。反應(yīng)完畢后,用異丙醇洗滌樹脂三次,然后用dmf洗滌樹脂三次。檢測氨基。

3)脫保護:浸泡樹脂的dmf壓濾除去,加入10ml含有20%哌啶的dmf溶液,氮氣吹沸反應(yīng)15min,然后壓濾除去,脫除氨基的fmoc基團,用10ml異丙醇洗滌樹脂三次,再用10mldmf洗滌三次,而后用茚三酮法檢測樹脂應(yīng)成黑色或紫色。

4)重復(fù)步驟2)-3)過程:按多肽的順序自c端向n端延伸多肽。重復(fù)脫保護.洗滌.縮合的過程至剩余的氨基酸連接完畢,完成多肽的連接。

5)除去其它保護:用氮氣將多肽-樹脂復(fù)合物吹干,按tfa/h2o/tis(95/2.5/2.5)的比例配成混和切割試劑,氮氣保護下吹沸40min,而后再將其用氮氣吹干,置于無水乙醇中,4℃保存。

根據(jù)上文方法共合成seqidno:1-2的2種小分子肽。

實施例2:親和吸附驗證

1)裝柱:將連接肽段的樹脂作為填料,做成柱子,在上安裝。

2)上樣:150mmpbs溶解蛋白,流速設(shè)為0.3ml/min,基線跑平后,上0.5mg蛋白質(zhì)。

3)堿洗脫:10min時,注入0.5mlph9.0、150mm硼酸洗脫。

4)酸洗脫:20min時,注入0.5mlph2.0100mm鹽酸洗脫。

6)計算洗脫比以及洗脫率。

結(jié)果見圖,圖1為dewh結(jié)果圖,圖2為wrdw結(jié)果圖,由實驗數(shù)據(jù),wrdw吸附率在90%以上,dewh吸附率在85%以上,二者均為特異性吸附。

申請人聲明,本發(fā)明通過上述實施例來說明本發(fā)明的詳細(xì)特征以及方法,但本發(fā)明并不局限于上述詳細(xì)特征以及方法,即不意味著本發(fā)明必須依賴上述詳細(xì)特征以及方法才能實施。所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該明了,對本發(fā)明的任何改進,對本發(fā)明所選用材料和步驟的等效替換以及輔助材料和步驟的增加、具體方式的選擇等,均落在本發(fā)明的保護范圍和公開范圍之內(nèi)。

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