本發(fā)明涉及干細(xì)胞技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種脫落乳牙干細(xì)胞的分離與體外增殖方法，通過人脫落乳牙干細(xì)胞進(jìn)行分離，然后利用有限稀釋法克隆純化人脫落乳牙干細(xì)胞，并使人脫落乳牙干細(xì)胞得到增殖。

背景技術(shù)：

干細(xì)胞是一種具有多分化潛能和自我復(fù)制功能的早期未分化細(xì)胞。根據(jù)細(xì)胞來源可將干細(xì)胞分為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞是最原始的干細(xì)胞，它位于個體發(fā)育的頂端，能夠分化為組成機體的所有類型的細(xì)胞，進(jìn)而形成機體的任何組織和器官，具有發(fā)育的全能性。但是胚胎干細(xì)胞的研究利用牽涉到一定的倫理問題。成體干細(xì)胞是成體組織中具有自我更新能力和定向分化潛能的細(xì)胞，其存在使組織和器官保持生長和衰退的動態(tài)平衡。大量研究表明成體干細(xì)胞已經(jīng)可以從多種組織器官中分離培養(yǎng)出來，其多向分化潛能及可塑性也得到了公認(rèn)。

隨著干細(xì)胞研究的進(jìn)一步發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)成體干細(xì)胞還存在于口腔組織的牙髓、牙周膜、牙胚、口腔上皮等組織。這些組織來源的成體干細(xì)胞同樣具有多向分化潛能，可以向骨、軟骨、脂肪等組織分化，但在細(xì)胞生物學(xué)特性以及分化潛能上又存在一定區(qū)別。其中，人脫落乳牙干細(xì)胞具有離成熟細(xì)胞近、可塑性強、免疫排斥小以及高度增殖能力和多向分化的潛能。

人脫落乳牙干細(xì)胞作為一種有很大潛能的干細(xì)胞，在牙髓干細(xì)胞的研究中有較大的應(yīng)用前景。因此，人脫落乳牙組織的分離和體外增殖成為干細(xì)胞分化的基礎(chǔ)，如何有效得獲得人脫落乳牙干細(xì)胞成為研究的關(guān)鍵。

為了解決上述問題，選擇并收集6-10歲健康兒童因滯留而拔除的，無牙 體牙髓疾病的乳牙，使用酶消化分離法得到原代人脫落乳牙干細(xì)胞，再利用有限稀釋克隆法分離純化，最終獲得純化后的人脫落乳牙干細(xì)胞。有益效果是：通過此方法獲得純化的人脫落乳牙干細(xì)胞，在一定條件下可向特定的細(xì)胞類型包括成骨細(xì)胞、成脂肪細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等分化，為牙髓干細(xì)胞的研究提供更廣闊的空間。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種脫落乳牙干細(xì)胞的分離與體外增殖方法。

為實現(xiàn)上述方法，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

脫落乳牙干細(xì)胞的分離與體外增殖方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：

步驟a，選擇并收集6-10歲健康兒童因滯留而拔除的，無牙體牙髓疾病的乳牙。拔除后立即放入裝有含pbs試劑的試管中保存?zhèn)溆?，?小時內(nèi)進(jìn)行取材；

步驟b，取出所述乳牙，無菌條件下沿牙齒長軸劈開牙冠，取出冠根部牙髓，在超凈臺內(nèi)切除根尖部的牙髓組織，置于含有不完全培養(yǎng)液的ep管內(nèi)，用無菌pbs反復(fù)洗滌后放入培養(yǎng)皿中。在培養(yǎng)皿中用眼科剪將牙髓組織剪成小塊，并置于無菌離心管中；

步驟c，將所述牙髓組織消化，離心分離，再經(jīng)培養(yǎng)獲得原代人脫落乳牙干細(xì)胞；

步驟d，采用有限稀釋法克隆純化所述原代人脫落乳牙干細(xì)胞，使所述原代人脫落乳牙干細(xì)胞增殖。

所述步驟c中還包括以下分步驟：

分步驟1，在所述無菌離心管中加入3mg/mli型膠原酶和4mg/mldispase酶各1ml，將所述無菌離心管置入恒溫(37℃)水浴箱中消化。多次搖晃，直 至所述牙髓組織呈絮狀；

分步驟2，所述牙髓組織經(jīng)消化后，在所述無菌離心管中以1000r/min離心10分鐘,使用所述pbs試劑洗滌2次且每次離心2分鐘，棄上清液從而洗凈消化酶得到沉淀；

分步驟3，用培養(yǎng)液將所述沉淀充分混勻，反復(fù)吹打以離散細(xì)胞團(tuán)塊，通過高壓滅菌后的細(xì)胞篩網(wǎng)，獲得單細(xì)胞懸液；

分步驟4，將所述單細(xì)胞懸液接種于塑料培養(yǎng)瓶中，在37℃,5％co2等溫箱標(biāo)準(zhǔn)條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)48-72小時后，棄去培養(yǎng)液，用所述pbs試劑洗滌三次，以去除未貼壁的細(xì)胞；

分步驟5,對上述細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，每隔3天換完全培養(yǎng)液一次。用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞，記錄細(xì)胞形態(tài)及生長情況并拍照；

分步驟6，當(dāng)細(xì)胞90％長滿瓶底時，使用濃度為0.25％的胰蛋白酶室溫消化3-5分鐘,在所述離心管中以1000r/min離心5分鐘，棄上清液得到原代人脫落乳牙干細(xì)胞。

所述步驟d中還包括以下分步驟：

分步驟01，取所述原代人脫落乳牙干細(xì)胞中處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，用特定培養(yǎng)基倍比稀釋，調(diào)整細(xì)胞濃度并充分吹打混勻，接種于96孔培養(yǎng)板；

分步驟02，經(jīng)24小時后，在所述96孔培養(yǎng)板中標(biāo)記單個細(xì)胞孔，每2-3天更換所述培養(yǎng)液。待80-90％長滿所述96孔培養(yǎng)板的孔底后，使用所述濃度為0.25％的胰蛋白酶消化，擴(kuò)大培養(yǎng)。

本發(fā)明的有益效果是：通過本方法獲得純化的人脫落乳牙干細(xì)胞，在一定條件下可向特定的細(xì)胞類型包括成骨細(xì)胞、成脂肪細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等分化，為牙髓干細(xì)胞的研究提供更廣闊的空間。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實施例1的整體流程示意圖；

圖2是本發(fā)明實施例1的消化，離心分離，培養(yǎng)的過程示意圖；

圖3是本發(fā)明實施例1中原代人脫落乳牙干細(xì)胞在顯微鏡下的示意圖；

圖4是本發(fā)明實施例1中使用有限稀釋法克隆純化原代人脫落乳牙干細(xì)胞的過程示意圖。

具體實施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實施例，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

參照圖1所示脫落乳牙干細(xì)胞的分離與體外增殖方法，該方法包括以下步驟：選擇并收集6-10歲健康兒童因滯留而拔除的，無牙體牙髓疾病的乳牙1。拔除后立即放入裝有含pbs試劑2的試管3中保存?zhèn)溆?，?小時內(nèi)進(jìn)行取材。之后取出所述乳牙1，無菌條件下沿牙齒長軸劈開牙冠，取出冠根部牙髓4，在超凈臺5內(nèi)切除根尖部的牙髓組織6，置于含有不完全培養(yǎng)液的ep管7內(nèi)，用無菌pbs試劑2反復(fù)洗滌后放入培養(yǎng)皿8中。在培養(yǎng)皿8中用眼科剪9將牙髓組織剪成小塊，并置于無菌離心管10中。然后將所述牙髓組織消化，離心分離，再經(jīng)培養(yǎng)獲得原代人脫落乳牙干細(xì)胞11。采用有限稀釋法克隆純化所述原代人脫落乳牙干細(xì)胞11，使所述原代人脫落乳牙干細(xì)胞11增殖。

參照圖2所示所述牙髓組織消化，離心分離，再經(jīng)培養(yǎng)獲得原代人脫落乳牙干細(xì)胞的過程還包括以下步驟：

在所述無菌離心管10中加入3mg/mli型膠原酶和4mg/mldispase酶各1ml，將所述無菌離心管10置入恒溫(37℃)水浴箱12中消化。多次搖晃，直至所述牙髓組織呈絮狀；

所述牙髓組織6經(jīng)消化后，在所述無菌離心管10中以1000r/min離心10分鐘,使用所述pbs試劑2洗滌2次且每次離心2分鐘，棄上清液從而洗凈消化酶得到沉淀13；

用培養(yǎng)液將所述沉淀充分混勻，反復(fù)吹打以離散細(xì)胞團(tuán)塊，通過高壓滅菌后的細(xì)胞篩網(wǎng)14，獲得單細(xì)胞懸液15；

將所述單細(xì)胞懸液15接種于塑料培養(yǎng)瓶16中，在37℃,5％co2等溫箱標(biāo)準(zhǔn)條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)48-72小時后，棄去培養(yǎng)液，用所述pbs試劑洗滌三次，以去除未貼壁的細(xì)胞；

對上述細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，每隔3天換完全培養(yǎng)液一次。參照圖3所示用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞，記錄細(xì)胞形態(tài)及生長情況并拍照；

當(dāng)細(xì)胞90％長滿瓶底時，使用濃度為0.25％的胰蛋白酶室溫消化3-5分鐘,在所述離心管10中以1000r/min離心5分鐘，棄上清液得到原代人脫落乳牙干細(xì)胞11。

參照圖4所示有限稀釋法克隆所述原代人脫落乳牙干細(xì)胞的過程包括以下步驟：

取所述原代人脫落乳牙干細(xì)胞11中處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，用特定培養(yǎng)基17倍比稀釋，調(diào)整細(xì)胞濃度并充分吹打混勻，接種于96孔培養(yǎng)板18；

經(jīng)24小時后，在所述96孔培養(yǎng)板18中標(biāo)記單個細(xì)胞孔，每2-3天更換所述培養(yǎng)液。待80-90％長滿所述96孔培養(yǎng)板的孔底后，使用所述濃度為0.25％的胰蛋白酶19消化，擴(kuò)大培養(yǎng)。

對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實施例的細(xì)節(jié)，而且在不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實現(xiàn)本發(fā)明。因此，無論從哪一點來看，均應(yīng)將實施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權(quán)利要求的等同要件的含義和范圍內(nèi)的所有變化囊括在本發(fā)明內(nèi)。

此外，應(yīng)當(dāng)理解，雖然本說明書按照實施方式加以描述，但并非每個實施方式僅包含一個獨立的技術(shù)方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)將說明書作為一個整體，各實施例中的技術(shù)方案也可以經(jīng)適當(dāng)組合，形成本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的其他實施方式。