本發(fā)明涉及一種新的芳香族酰胺類衍生物及其可藥用的鹽或含有其的藥物組合物、及其制備方法。本發(fā)明還涉及所述類衍生物及其可藥用的鹽或含有其的藥物組合物在制備治療劑，bruton酪氨酸激酶抑制劑，和在制備治療和/或預(yù)防腫瘤與炎癥等疾病的藥物中的用途。
背景技術(shù)：
：bruton酪氨酸激酶(btk)是一種重要的介導(dǎo)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的酶，存在于漿細(xì)胞，包括b細(xì)胞中。b細(xì)胞是通過b細(xì)胞受體(bcr)被活化的，而btk在bcr介導(dǎo)的信號通路中起了決定性的作用。b細(xì)胞上的bcr被活化后，引起btk的激活，導(dǎo)致下游的磷脂酶c(plc)濃度增加，并激活ip3和dag信號通路。這一信號通路可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖、粘附和存活，在b細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)展過程中起重要的作用。btk突變體在人群中的存在證明了btk可以成為藥物靶點(diǎn)。性聯(lián)無丙種球蛋白血癥(xla)是一種罕見的遺傳疾病，存在于1/250,000的男性中。在這種疾病中，btk的功能被抑制，從而導(dǎo)致了b細(xì)胞的產(chǎn)生或成熟受阻?；加衳la疾病的男性，體內(nèi)基本沒有b細(xì)胞，循環(huán)抗體也很少，容易出現(xiàn)嚴(yán)重甚至致命的感染。由此可見，btk在b細(xì)胞的生長和分化中起著極其重要的作用。btk抑制劑通過抑制btk的活性，可以抑制b淋巴瘤細(xì)胞的增殖，破壞瘤細(xì)胞的粘附，促進(jìn)瘤細(xì)胞的凋亡，使btk在b細(xì)胞有關(guān)的癌癥中成為令人注目的藥物靶點(diǎn)，尤其對b細(xì)胞淋巴瘤和白血病，比如非霍奇金淋巴瘤(non-hodgkin′slymphoma，nhl)、慢性淋巴細(xì)胞白血病(chroniclymphocyticleukemia，cll)、和抗復(fù)發(fā)性或難治性套細(xì)胞淋巴瘤(mantlecelllymphoma，mcl)等。目前市場上唯一的具有btk特異性抑制的藥物是pharmacyclics/jnj的ibrutinib。ibrutinib是一種非可逆的小分子btk抑制劑，對治療mcl、cll、wm有非常明顯的療效，而且安全。其它進(jìn)入臨床針對細(xì)胞淋巴瘤的btk抑制劑還有celgene公司的cc-292、acerta公司的acp-196、ono公司的ono-4059、beigene公司的bgb-3111等等。btk抑制劑除了可以抗b細(xì)胞淋巴瘤和白血病，還可以抑制b細(xì)胞自身抗體和細(xì)胞因子的產(chǎn)生。在自身免疫性疾病中，b細(xì)胞呈遞自身抗原，促進(jìn)t細(xì)胞活化分泌致炎癥因子造成組織損傷，同時(shí)又激活b細(xì)胞產(chǎn)生大量抗體，觸發(fā)自身免疫反應(yīng)。t和b細(xì)胞相互作用形成正反饋調(diào)節(jié)鏈，導(dǎo)致自身免疫反應(yīng)失控，加重組織病理損傷。研究顯示，體內(nèi)存在著調(diào)節(jié)性b細(xì)胞，可通過分泌白細(xì)胞介素10(il-10)或轉(zhuǎn)化生長因子β1(tgf-β1)及其他機(jī)制，負(fù)向調(diào)控免疫應(yīng)答，抑制免疫介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。所以，b細(xì)胞可以作為自身免疫性疾病，比如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoidarthritis，ra)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemiclupuserythematosus，sle)、過敏性疾病(例如食道炎、eosoniphilicesophagitis)等的藥物靶點(diǎn)。當(dāng)前市場上還沒有用于免疫性疾病的btk特異抑制劑，但有幾個(gè)正處于臨床階段，比如celgene公司的cc-292、acerta公司的acp-196、hanmi的hm-71224、principia的prn-1008、merckserono的m-2951和pharmacyclics的一個(gè)化合物。全球非霍奇金淋巴瘤的市場將從2007年的33億美元增長到2017年的47億美元(年均增長3.7％)。作為基于b細(xì)胞抗體的生物制劑，在nhl治療領(lǐng)域的銷售額將從2007年的28億美元增長到2017年的32億美元。但是作為一種生物制劑，和lymphostatb，在大范圍b細(xì)胞清除方面都有不足，也沒有合適的口服用量。針對自身免疫性疾病，如抗類風(fēng)濕類口服藥物的潛在市場更大?，F(xiàn)在基于抗腫瘤壞死因子(tnf)的藥物，市場是50億美元，不過目前基于抗tnf的藥物，例如和是特異性針對t細(xì)胞的，都采用皮下注射的方式。針對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎治療的市場，從2009年到2017年將增長約兩倍，達(dá)到134億美元。用于其他疾病治療，如紅斑狼瘡等的潛在市場也非常大。因此btk抑制劑具有十分廣闊的前景。由于btk在多個(gè)信號通路中所起的重要作用，btk抑制劑的開發(fā)吸引了眾多生物制藥公司的關(guān)注，目前已公開了一系列的btk抑制劑的專利申請，其中包括wo2007087068、wo2010126960、wo2011019780、wo2011090760、wo2012135801、wo2012158764、wo2013060098、wo2013081016、wo2013010869、wo2013113097、cn103113375、wo2014068527、wo2014125410、wo2014173289、wo2013118986、wo2015017502和wo2015048689等，但仍需要開發(fā)新的具有更好藥效的化合物。經(jīng)過不斷努力，本發(fā)明設(shè)計(jì)具有通式(i)所示的結(jié)構(gòu)的化合物，并發(fā)現(xiàn)具有此類結(jié)構(gòu)的化合物表現(xiàn)出優(yōu)異的效果和作用。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種通式(i)所示的化合物或其互變異構(gòu)體、內(nèi)消旋體、外消旋體、對映異構(gòu)體、非對映異構(gòu)體、其混合物形式、及其可藥用的鹽：其中：環(huán)a和b1各自獨(dú)立地選自芳基或雜芳基，其中所述芳基或雜芳基任選被一個(gè)或多個(gè)g1所取代；b2獨(dú)立地選自h、c3-8環(huán)基、3-8元雜環(huán)基、芳基或雜芳基，其中所述環(huán)基、雜環(huán)基、芳基或雜芳基任選被一個(gè)或多個(gè)g2所取代；l1獨(dú)立地選自-c0-2烷基-、-cr2r3-、-c1-2烷基(r1)(oh)-、-c(o)-、-cr1r2o-、-ocr1r2-、-scr1r2-、-cr1r2s-、-nr1-、-nr1c(o)-、-c(o)nr1-、-nr1conr2-、-cf2-、-o-、-s-、-s(o)m-、-nr1s(o)m-或-s(o)mnr1-；l2獨(dú)立地選自-c0-4烷基-、-c(o)-、-o-、-nr3-、-nr3c(o)-或-nr3s(o)m-；x獨(dú)立地選自c0-4烷基、c3-8環(huán)基、3-8元雜環(huán)基、芳基或雜芳基，其中所述烷基、環(huán)基、雜環(huán)基、芳基或雜芳基任選被一個(gè)或多個(gè)g3所取代；y獨(dú)立地選自-c(o)-、-nr4c(o)-、-s(o)m-或-nr4s(o)m-；r獨(dú)立地選自h、d、烷基、環(huán)基、雜環(huán)基、芳基或雜芳基，其中所述烷基、環(huán)基、雜環(huán)基、芳基或雜芳基任選被一個(gè)或多個(gè)g4所取代；r1、r2、r3和r4各自獨(dú)立地選自h、d、c1-8烷基、c3-8環(huán)基、3-8元雜環(huán)基、芳基或雜芳基，其中所述烷基、環(huán)基、雜環(huán)基、芳基或雜芳基任選被一個(gè)或多個(gè)g5所取代；g1、g2、g3、g4和g5各自獨(dú)立地選自h、d、鹵素、氰基、烷基、烯基、炔基、環(huán)基、雜環(huán)基、芳基、雜芳基、-or5、-oc(o)nr5r6、-c(o)or5、-c(o)nr5r6、-c(o)r5、-nr5r6、-nr5c(o)r6、-nr5c(o)nr6r7、-s(o)mr5或-nr5s(o)mr6，其中所述烷基、烯基、炔基、環(huán)基、雜環(huán)基、芳基或雜芳基任選被一個(gè)或多個(gè)選自d、鹵素、氰基、c1-8烷基、c3-8環(huán)烷基、3-8元雜環(huán)基、-or7、-oc(o)nr7r8、-c(o)or7、-c(o)nr7r8、-c(o)r7、-nr7r8、-nr7c(o)r8、-nr7c(o)nr8r9、-s(o)mr7、-nr7s(o)mr8的取代基所取代；r5、r6、r7、r8和r9各自獨(dú)立地選自h、c1-6烷基、c1-6雜烷基、c3-8環(huán)基、3-8元單環(huán)雜環(huán)基、單環(huán)雜芳基或單環(huán)芳基；且m為1或2。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，一種通式(i)所示的化合物或其互變異構(gòu)體、內(nèi)消旋體、外消旋體、對映異構(gòu)體、非對映異構(gòu)體、其混合物形式、及其可藥用的鹽，其為通式(ii)所述的化合物或其互變異構(gòu)體、內(nèi)消旋體、外消旋體、對映異構(gòu)體、非對映異構(gòu)體、其混合物形式、及其可藥用的鹽：其中：環(huán)b為z1和z2各自獨(dú)立地選自ch或n；z3為o或s；b1、b2、l1、l2、x、y和r的定義如權(quán)利要求1中所述。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，一種通式(i)所示的化合物或其互變異構(gòu)體、內(nèi)消旋體、外消旋體、對映異構(gòu)體、非對映異構(gòu)體、其混合物形式、及其可藥用的鹽，其為通式(iii)所述的化合物或其互變異構(gòu)體、內(nèi)消旋體、外消旋體、對映異構(gòu)體、非對映異構(gòu)體、其混合物形式、及其可藥用的鹽：其中：b1和b2為苯環(huán)或六元雜芳環(huán)；環(huán)b、l2、x、y、r、g1和g2的定義如權(quán)利要求1-2中所述。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，一種通式(i)所示的化合物或其互變異構(gòu)體、內(nèi)消旋體、外消旋體、對映異構(gòu)體、非對映異構(gòu)體、其混合物形式、及其可藥用的鹽，其為通式(iv)所述的化合物或其互變異構(gòu)體、內(nèi)消旋體、外消旋體、對映異構(gòu)體、非對映異構(gòu)體、其混合物形式、及其可藥用的鹽：其中：p1和p2各自獨(dú)立地選自c(ra)或n；ra為h或烷基；n和o各自獨(dú)立地選自0、1或2；環(huán)b、b1、b2、l2、y和r的定義如權(quán)利要求1-3中所述。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，一種通式(i)所示的化合物或其互變異構(gòu)體、內(nèi)消旋體、外消旋體、對映異構(gòu)體、非對映異構(gòu)體、其混合物形式、及其可藥用的鹽，其中其中r獨(dú)立地選自h、d、烷基或雜烷基。本發(fā)明的典型化合物包括，但并不限于：或其互變異構(gòu)體、內(nèi)消旋體、外消旋體、對映異構(gòu)體、非對映異構(gòu)體、其混合物形式、及其可藥用的鹽。本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種藥物組合物，其含有治療有效量的通式(i)所示的化合物或其互變異構(gòu)體、內(nèi)消旋體、外消旋體、對映異構(gòu)體、非對映異構(gòu)體、其混合物形式、及其可藥用的鹽及藥學(xué)上可接受的載體，稀釋劑和賦形劑。本發(fā)明的另一方面涉及通式(i)所示的化合物或其互變異構(gòu)體、內(nèi)消旋體、外消旋體、對映異構(gòu)體、非對映異構(gòu)體、其混合物形式、及其可藥用的鹽，或包含其的藥物組合物在制備bruton酪氨酸激酶抑制劑中的用途。本發(fā)明的另一方面涉及通式(i)所示的化合物或其互變異構(gòu)體、內(nèi)消旋體、外消旋體、對映異構(gòu)體、非對映異構(gòu)體、其混合物形式、及其可藥用的鹽，或包含其的藥物組合物在制備治療和/或預(yù)防腫瘤與炎癥等疾病的藥物中的用途。本發(fā)明還涉及一種治療和/或預(yù)防腫瘤與炎癥等疾病的方法，該方法包括給予需要治療的患者治療有效量的通式(i)所示的化合物或其互變異構(gòu)體、內(nèi)消旋體、外消旋體、對映異構(gòu)體、非對映異構(gòu)體、其混合物形式、及其可藥用的鹽，或包含其的藥物組合物。本發(fā)明的另一方面涉及作為治療和/或預(yù)防腫瘤與炎癥等疾病的藥物的通式(i)所示的化合物或其互變異構(gòu)體、內(nèi)消旋體、外消旋體、對映異構(gòu)體、非對映異構(gòu)體、其混合物形式、及其可藥用的鹽。具體實(shí)施方式除非有相反陳述，否則下列用在說明書和權(quán)利要求書中的術(shù)語具有下述含義。在本文中使用的表示方式“cx-y”表示碳原子數(shù)的范圍，其中x和y均為整數(shù)，例如c3-8環(huán)基表示具有3-8個(gè)碳原子的環(huán)基，-c0-2烷基表示具有0-2個(gè)碳原子的烷基，其中-c0烷基是指化學(xué)單鍵。“烷基”指飽和的脂族烴基團(tuán)，包括1至20個(gè)碳原子的直鏈和支鏈基團(tuán)，例如可以是1至18個(gè)碳原子、1至12個(gè)碳原子、1至8個(gè)碳原子、1至6個(gè)碳原子或1至4個(gè)碳原子的直鏈和支鏈基團(tuán)。在本文中“烷基”可以是一價(jià)的、二價(jià)的或三價(jià)基團(tuán)。非限制性實(shí)施例包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、1，1-二甲基丙基、1，2-二甲基丙基、2，2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1，1，2-三甲基丙基、1，1-二甲基丁基、1，2-二甲基丁基、2，2-二甲基丁基、1，3-二甲基丁基、2-乙基丁基、及其各種支鏈異構(gòu)體等。非限制性實(shí)施例還包括亞甲基、次甲基、亞乙基、次乙基、亞丙基、次丙基、亞丁基、次丁基及其各種支鏈異構(gòu)體。烷基可以是任選取代的或未取代的?！碍h(huán)基”指飽和或部分不飽和單環(huán)或多環(huán)環(huán)狀烴取代基，其包括3至12個(gè)環(huán)原子，例如可以是3至12個(gè)、3至10個(gè)或3至6個(gè)環(huán)原子，或者可以是3、4、5、6元環(huán)。單環(huán)環(huán)基的非限制性實(shí)施例包含環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)戊烯基、環(huán)己基、環(huán)己烯基、環(huán)己二烯基、環(huán)庚基、環(huán)庚三烯基、環(huán)辛基等。環(huán)基可以是任選取代的或未取代的。“雜環(huán)基”指飽和或部分不飽和單環(huán)或多環(huán)環(huán)狀烴取代基，其包括3至20個(gè)環(huán)原子，例如可以是3至16個(gè)、3至12個(gè)、3至10個(gè)、3至6個(gè)或5至6個(gè)環(huán)原子，其中一個(gè)或多個(gè)環(huán)原子選自氮、氧或s(o)m(其中m是整數(shù)0至2)的雜原子，但不包括-o-o-、-o-s-或-s-s-的環(huán)部分，其余環(huán)原子為碳。優(yōu)選包括3至12個(gè)環(huán)原子，其中1～4個(gè)是雜原子，更優(yōu)選雜環(huán)烷基環(huán)包含3至10個(gè)環(huán)原子，最優(yōu)選5元環(huán)或6元環(huán)，其中1～4個(gè)是雜原子，更優(yōu)選1～3個(gè)是雜原子，最優(yōu)選1～2個(gè)是雜原子。單環(huán)雜環(huán)基的非限制性實(shí)施例包含吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、嗎啉基、硫代嗎啉基、高哌嗪基和氮雜環(huán)丁烷基等。多環(huán)雜環(huán)基包括螺環(huán)、稠環(huán)和橋環(huán)的雜環(huán)基?！奥蓦s環(huán)基”指5至20元，單環(huán)之間共用一個(gè)原子(稱螺原子)的多環(huán)雜環(huán)基團(tuán)，其中一個(gè)或多個(gè)環(huán)原子選自氮、氧或s(o)m(其中m是整數(shù)0至2)的雜原子，其余環(huán)原子為碳。這些可以含有一個(gè)或多個(gè)雙鍵，但沒有一個(gè)環(huán)具有完全共扼的π電子系統(tǒng)。優(yōu)選為6至14元，更優(yōu)選為7至10元。根據(jù)環(huán)與環(huán)之間共用螺原子的數(shù)目將螺環(huán)烷基分為單螺雜環(huán)基、雙螺雜環(huán)基或多螺雜環(huán)基，優(yōu)選為單螺環(huán)烷基和雙螺環(huán)烷基。更優(yōu)選為4元/4元、4元/5元、4元/6元、5元/5元或5元/6元單螺環(huán)烷基。螺環(huán)烷基的非限制性實(shí)施例包含“稠雜環(huán)基”指5至20元，系統(tǒng)中的每個(gè)環(huán)與體系中的其他環(huán)共享毗鄰的一對原子的多環(huán)雜環(huán)基團(tuán)，一個(gè)或多個(gè)環(huán)可以含有一個(gè)或多個(gè)雙鍵，但沒有一個(gè)環(huán)具有完全共扼的π電子系統(tǒng)，其中一個(gè)或多個(gè)環(huán)原子選自氮、氧或s(o)m(其中m是整數(shù)0至2)的雜原子，其余環(huán)原子為碳。優(yōu)選為6至14元，更優(yōu)選為7至10元。根據(jù)組成環(huán)的數(shù)目可以分為雙環(huán)、三環(huán)、四環(huán)或多環(huán)稠雜環(huán)烷基，優(yōu)選為雙環(huán)或三環(huán)，更優(yōu)選為5元/5元或5元/6元雙環(huán)稠雜環(huán)基。稠雜環(huán)基的非限制性實(shí)施例包含所述雜環(huán)基環(huán)可以稠合于芳基、雜芳基或環(huán)烷基環(huán)上，其中與母體結(jié)構(gòu)連接在一起的環(huán)為雜環(huán)基，非限制性實(shí)施例包含：等。雜環(huán)基可以是任選取代的或未取代的。“芳基”指6至14元全碳單環(huán)或稠合多環(huán)(也就是共享毗鄰碳原子對的環(huán))基團(tuán)，具有共扼的π電子體系的多環(huán)(即其帶有相鄰對碳原子的環(huán))基團(tuán)，優(yōu)選為6至10元，例如苯基和萘基，最優(yōu)選苯基。所述芳基環(huán)可以稠合于雜芳基、雜環(huán)基或環(huán)烷基環(huán)上，其中與母體結(jié)構(gòu)連接在一起的環(huán)為芳基環(huán)，非限制性實(shí)施例包含：芳基可以是取代的或未取代的?！半s芳基”指包含1至4個(gè)雜原子，5至14個(gè)環(huán)原子的雜芳族體系，其中雜原子包括氧、硫和氮。優(yōu)選為5至10元。更優(yōu)選雜芳基是5元或6元，例如呋喃基、噻吩基、吡啶基、吡咯基、n-烷基吡咯基、嘧啶基、吡嗪基、咪唑基、四唑基、噁唑基、異噁唑基、噻唑基、異噻唑基等，所述雜芳基環(huán)可以稠合于芳基、雜環(huán)基或環(huán)烷基環(huán)上，其中與母體結(jié)構(gòu)連接在一起的環(huán)為雜芳基環(huán)，非限制性實(shí)施例包含：雜芳基可以是任選取代的或未取代的?！胞u素”指氟、氯、溴或碘?！扒杌敝?cn。“任選”或“任選地”意味著隨后所描述地事件或環(huán)境可以但不必發(fā)生，該說明包括該事件或環(huán)境發(fā)生或不發(fā)生地場合。例如，“任選被烷基取代的雜環(huán)基團(tuán)”意味著烷基可以但不必須存在，該說明包括雜環(huán)基團(tuán)被烷基取代的情形和雜環(huán)基團(tuán)不被烷基取代的情形?！叭〈摹敝富鶊F(tuán)中的一個(gè)或多個(gè)氫原子，優(yōu)選為最多5個(gè)，更優(yōu)選為1～3個(gè)氫原子彼此獨(dú)立地被相應(yīng)數(shù)目的取代基取代。不言而喻，取代基僅處在它們的可能的化學(xué)位置，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠在不付出過多努力的情況下確定(通過實(shí)驗(yàn)或理論)可能或不可能的取代。例如，具有游離氫的氨基或羥基與具有不飽和(如烯屬)鍵的碳原子結(jié)合時(shí)可能是不穩(wěn)定的。“藥物組合物”表示含有一種或多種本文所述化合物或其生理學(xué)上/可藥用的鹽或前體藥物與其他化學(xué)組分的混合物，以及其他組分例如生理學(xué)/可藥用的載體和賦形劑。藥物組合物的目的是促進(jìn)對生物體的給藥，利于活性成分的吸收進(jìn)而發(fā)揮生物活性。實(shí)施例本發(fā)明通式(i)所述的化合物或其可藥用的鹽的制備，可通過以下實(shí)施例中所述的示例性方法以及本領(lǐng)域技術(shù)人員所用的相關(guān)公開文獻(xiàn)操作完成，但這些實(shí)施例并非限制著本發(fā)明的范圍?；衔锏慕Y(jié)構(gòu)是通過核磁共振(nmr)或質(zhì)譜(ms)來確定的。nmr的測定是用brukeravance-400或varianoxford-300核磁儀，測定溶劑為氘代二甲基亞砜(dmso-d6)、氘代氯仿(cdcl3)、氘代甲醇(cd3od)，內(nèi)標(biāo)為四甲基硅烷(tms)，化學(xué)位移是以10-6(ppm)作為單位給出。ms的測定用agilentsqd(esi)質(zhì)譜儀(生產(chǎn)商：agilent，型號：6110)或shimadzusqd(esi)質(zhì)譜儀(生產(chǎn)商：shimadzu，型號：2020)。hplc的測定使用安捷倫1200dad高壓液相色譜儀(sunfircc18，150×4.6mm，5μm，色譜柱)和waters2695-2996高壓液相色譜儀(giminic18150×4.6mm，5μm色譜柱)。薄層層析硅膠板使用青島海洋gf254硅膠板，薄層色譜法(tlc)使用的硅膠板采用的規(guī)格是0.15mm～0.2mm，薄層層析分離純化產(chǎn)品采用的規(guī)格是0.4mm～0.5mm硅膠板。柱層析一般使用青島海洋200～300目硅膠為載體。本發(fā)明的已知的起始原料可以采用或按照本領(lǐng)域已知的方法來合成，或可購買自abcrgmbh&co.kg，acrosorganics，aldrichchemicalcompany，韶遠(yuǎn)化學(xué)科技(accelachembioinc)、北京耦合化學(xué)品等公司。實(shí)施例中如無特殊說明，反應(yīng)均在氬氣氛或氮?dú)夥障逻M(jìn)行。氬氣氛或氮?dú)夥帐侵阜磻?yīng)瓶連接一個(gè)約1l容積的氬氣或氮?dú)鈿馇颉錃夥帐侵阜磻?yīng)瓶連接一個(gè)約1l容積的氫氣氣球。加壓氫化反應(yīng)使用北京佳維科創(chuàng)科技有限公司gcd-500g高純氫氣發(fā)生器和blt-2000中壓氫化儀。氫化反應(yīng)通常抽真空，充入氫氣，反復(fù)操作3次。微波反應(yīng)使用cemdiscover-sp型微波反應(yīng)器。實(shí)施例中如無特殊說明，反應(yīng)的溫度為室溫，溫度范圍是20℃-30℃。實(shí)施例中的反應(yīng)進(jìn)程的監(jiān)測采用薄層色譜法(tlc)，反應(yīng)所使用的展開劑的體系有a：二氯甲烷和甲醇體系；b：石油醚和乙酸乙酯體系，溶劑的體積比根據(jù)化合物的極性不同而進(jìn)行調(diào)節(jié)。純化化合物采用的柱層析的洗脫劑的體系和薄層色譜法的展開劑的體系包括a：二氯甲烷和甲醇體系；b：石油醚和乙酸乙酯體系，溶劑的體積比根據(jù)化合物的極性不同而進(jìn)行調(diào)節(jié)，也可以加入少量的三乙胺和酸性或堿性試劑等進(jìn)行調(diào)節(jié)。合成方法：化合物可根據(jù)下面經(jīng)典的酰胺耦合反應(yīng)得到，胺前體可根據(jù)專利wo2015048662的合成方法得到。實(shí)施例16-(1-(丁-2-炔酰)哌啶-4-基)-2-(4-苯氧基苯基)尼克酰胺第一步2，6-二氯尼克酰胺將化合物2，6-二氯尼古丁腈1a(1.73g，10mmol)、濃硫酸(10ml)和水(2ml)混合，加熱到90℃，攪拌1小時(shí)。冷卻至室溫，將反應(yīng)混合物傾倒至冰水浴中，用氨水調(diào)節(jié)ph值至8。過濾，濾餅用水洗滌，干燥后得到目標(biāo)產(chǎn)物2，6-二氯尼克酰胺1b(1.4g，固體)，產(chǎn)率：73％。msm/z(esi)：191[m+1]第二步6-氯-2-(4-苯氧基苯基)尼克酰胺將化合物2，6-二氯尼克酰胺1b(0.678g，3.5mmol)、(4-苯氧基苯基)硼酸(0.835g，3.9mmol)、碳酸銫(0.977g，7.1mmol)、三(二亞芐基丙酮)二鈀(0.324g，0.35mmol)、水(4ml)和1，4-二氧六環(huán)(15ml)混合，除氧，氬氣保護(hù)下加熱回流16小時(shí)。冷卻至室溫，減壓脫溶，殘余物用硅膠柱層析純化(石油醚/乙酸乙酯＝1/1)得到目標(biāo)產(chǎn)物6-氯-2-(4-苯氧基苯基)尼克酰胺1c(0.611g，固體)，產(chǎn)率：53％。msm/z(esi)：325[m+1]第三步5-氨基甲酰-6-(4-苯氧基苯基)-5′，6′-二氫-[2，4′-聯(lián)吡啶]-1′(2′h)-羧酸叔丁酯將化合物6-氯-2-(4-苯氧基苯基)尼克酰胺1c(0.162g，0.50mmol)、(1-(叔丁氧基羰基)-1，2，3，6-四氫吡啶-4-基)硼酸(0.232g，0.75mmol)、四(三苯基膦)鈀(0.115g，0.1mmol)、碳酸鉀(0.207g，1.5mmol)、乙二醇二甲醚(10ml)和水(2ml)混合后，加熱到90℃，攪拌5小時(shí)。冷卻至室溫，減壓脫溶，殘余物用硅膠柱層析純化(二氯甲烷/甲醇＝700/1)，得到目標(biāo)產(chǎn)物5-氨基甲酰-6-(4-苯氧基苯基)-5′，6′-二氫-[2，4′-聯(lián)吡啶]-1′(2′h)-羧酸叔丁酯1d(0.21g，固體)，產(chǎn)率：89％。msm/z(esi)：472[m+1]第四步4-(5-氨基甲酰-6-(4-苯氧基苯基)吡啶-2-基)哌啶-1-羧酸叔丁酯將化合物5-氨基甲酰-6-(4-苯氧基苯基)-5′，6′-二氫-[2，4′-聯(lián)吡啶]-1′(2′h)-羧酸叔丁酯1d(0.21g，0.45mmol)、鈀炭(10mg)和乙酸乙酯(10ml)混合，除氧，氫氣氣氛下室溫?cái)嚢?6小時(shí)。減壓脫溶，殘余物用硅膠柱層析純化(二氯甲烷/甲醇＝70/1)，得到目標(biāo)產(chǎn)物4-(5-氨基甲酰-6-(4-苯氧基苯基)吡啶-2-基)哌啶-1-羧酸叔丁酯1e(0.20g，固體)，產(chǎn)率：94％。msm/z(esi)：474[m+1]第五步2-(4-苯氧基苯基)-6-(哌啶-4-基)尼克酰胺將化合物4-(5-氨基甲酰-6-(4-苯氧基苯基)吡啶-2-基)哌啶-1-羧酸叔丁酯1e(0.215g，0.45mmol)、三氟乙酸(2ml)和二氯甲烷(5ml)混合，室溫下攪拌1小、時(shí)。減壓脫溶，殘余物溶解于二氯甲烷，用飽和碳酸氫鈉溶液洗滌。有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥，過濾除去干燥劑，減壓脫溶，殘余物用硅膠柱層析純化(二氯甲烷/甲醇＝70/1到5/1)，得到目標(biāo)產(chǎn)物2-(4-苯氧基苯基)-6-(哌啶-4-基)尼克酰胺1f(0.12g，固體)，產(chǎn)率：71％。msm/z(esi)：374[m+1]第六步6-(1-(丁-2-炔酰)哌啶-4-基)-2-(4-苯氧基苯基)尼克酰胺將化合物2-(4-苯氧基苯基)-6-(哌啶-4-基)尼克酰胺1f(100mg，0.27mmol)、丁-2-炔酸(34mg，0.405mmol)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n，n，n′，n′-四甲基脲六氟磷酸酯(114mg，0.3mmol)、三乙胺(55mg，0.54mmol)和n，n-二甲基甲酰胺(10ml)混合，在常溫下攪拌3小時(shí)。減壓脫溶，殘余物用硅膠柱層析純化(二氯甲烷/甲醇＝50/1)，得到目標(biāo)產(chǎn)物6-(1-(丁-2-炔酰)哌啶-4-基)-2-(4-苯氧基苯基)尼克酰胺1(54mg，固體)，產(chǎn)率：46％。msm/z(esi)：440[m+1]1hnmr(400mhz，cd3od)δ7.87(d，j＝7.9hz，1h)，7.79-7.67(m，2h)，7.45-7.29(m，3h)，7.17(t，j＝7.4hz，1h)，7.12-7.00(m，4h)，4.59(dd，j＝18.1，15.6hz，2h)，3.38(d，j＝2.8hz，1h)，3.13(tt，j＝11.8，3.6hz，1h)，2.91(td，j＝12.9，3.0hz，1h)，2.14-1.97(m，5h)，1.82(m，2h)。實(shí)施例22-(4-苯氧基苯基)-6-(1-丙炔酰哌啶-4-基)尼克酰胺參照實(shí)施例1的操作步驟合成實(shí)施例2，但在第六步中用丙炔酸取代丁-2-炔酸。msm/z(esi)：426[m+1]1hnmr(400mhz，cdcl3)δ8.08(d，j＝7.9hz，1h)，7.70(d，j＝8.6hz，2h)，7.40(t，j＝7.9hz，2h)，7.28-7.16(m，2h)，7.10(d，j＝8.3hz，4h)，5.54(d，j＝61.1hz，2h)，4.73(d，j＝13.3hz，1h)，4.56(d，j＝13.7hz，1h)，3.31(t，j＝11.7hz，1h)，3.18(d，j＝19.3hz，2h)，2.86(td，j＝13.0，2.7hz，1h)，2.11(dd，j＝23.9，13.5hz，2h)，2.00-1.74(m，2h)。實(shí)施例36-(1-(丁-2-炔酰)吡咯烷-3-基)-2-(4-苯氧基苯基)尼克酰胺參照實(shí)施例1的操作步驟合成實(shí)施例3，但在第三步中用叔-丁基3-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二噁硼戊環(huán)-2-基)-2，5-二氫-1h-吡咯-1-羧酸酯取代(1-(叔丁氧基羰基)-1，2，3，6-四氫吡啶-4-基)硼酸。msm/z(esi)：426[m+1]1hnmr(400mhz，cdcl3)δ8.05(t，j＝7.9hz，1h)，7.71(dd，j＝8.5，5.6hz，2h)，7.44-7.34(m，2h)，7.27-7.15(m，2h)，7.13-6.99(m，5h)，5.77-5.43(m，2h)，4.16(dd，j＝10.8，7.5hz，0.5h)，4.03-3.92(m，2h)，3.76(ddd，j＝26.2，15.4，7.6hz，3h)，3.56(dt，j＝12.4，8.0hz，0.5h)，2.46-2.29(m，2h)，2.01(d，j＝13.1hz，3h)，1.49(dd，j＝16.2，9.7hz，1h)。實(shí)施例46-(4-(丁-2-炔酰)哌嗪-1-基)-2-(4-苯氧基苯基)尼克酰胺第一步4-(6-氯-5-氰基吡啶-2-基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯將化合物2，6-二氯尼古丁腈1a(0.519g，3.0mmol)、哌嗪-1-羧酸叔丁酯(0.558g，3.0mmol)、碳酸鉀(0.636g，6.0mmol)和乙醇(30ml)混合，加熱至80℃，回流攪拌3小時(shí)。冷卻至室溫，減壓脫溶，殘余物用硅膠柱層析純化(石油醚/乙酸乙酯＝20/1到1/1)得到目標(biāo)產(chǎn)物4-(6-氯-5-氰基吡啶-2-基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯4a(0.59g，固體)，產(chǎn)率：60％。msm/z(esi)：323[m+1]第二步2-氯-6-(哌嗪-1-基)尼克酰胺利用4-(6-氯-5-氰基吡啶-2-基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯4a(0.60g，1.86mmol)為原料，參照實(shí)施例1中1b的合成方法合成，得到標(biāo)題產(chǎn)物2-氯-6-(哌嗪-1-基)尼克酰胺4b(0.42g，固體)，產(chǎn)率：94％。msm/z(esi)：241[m+1]第三步2-(4-苯氧基苯基)-6-(哌嗪-1-基)尼克酰胺利用2-氯-6-(哌嗪-1-基)尼克酰胺4b(0.29g，1.2mmol)為原料，參照實(shí)施例1中1c的合成方法合成，得到標(biāo)題產(chǎn)物2-(4-苯氧基苯基)-6-(哌嗪-1-基)尼克酰胺4c(0.26g，固體)，產(chǎn)率：58％。msm/z(esi)：375[m+1]第四步6-(4-(丁-2-炔酰)哌嗪-1-基)-2-(4-苯氧基苯基)尼克酰胺利用2-(4-苯氧基苯基)-6-(哌嗪-1-基)尼克酰胺4c(80mg，0.21mmol)為原料，參照實(shí)施例1中1的合成方法合成，得到標(biāo)題產(chǎn)物6-(4-(丁-2-炔酰)哌嗪-1-基)-2-(4-苯氧基苯基)尼克酰胺4(28mg，固體)，產(chǎn)率：30％。msm/z(esi)：441[m+1]1hnmr(400mhz，cd3od)δ7.78(d，j＝8.7hz，1h)，7.73-7.61(m，2h)，7.46-7.33(m，2h)，7.16(t，j＝7.4hz，1h)，7.13-6.97(m，4h)，6.83(d，j＝8.7hz，1h)，3.92(dd，j＝6.4，3.9hz，2h)，3.79(dd，j＝6.3，4.0hz，2h)，3.73(s，1h)，2.08(s，3h)。實(shí)施例56-(1-(丁-2-炔酰)吡咯烷-3-基)-2-(4-苯氧基苯基)尼克酰胺參照實(shí)施例4的操作步驟合成實(shí)施例5，但在第一步中用叔-丁基吡咯烷-3-基氨基甲酸酯取代哌嗪-1-羧酸叔丁酯。msm/z(esi)：441[m+1]1hnmr(400mhz，cd3od)δ7.70(ddd，j＝11.7，9.5，5.7hz，3h)，7.45-7.30(m，2h)，7.15(t，j＝7.4hz，1h)，7.03(ddd，j＝9.5，6.7，1.9hz，4h)，6.47(d，j＝8.7hz，1h)，4.57-4.44(m，1h)，3.82(dd，j＝11.1，6.3hz，1h)，3.65(ddd，j＝20.2，12.1，4.4hz，2h)，3.48(dd，j＝11.1，4.4hz，1h)，2.31(dd，j＝13.4，6.2hz，1h)，2.13-2.01(m，1h)，1.97(s，3h)。實(shí)施例66-((1-(丁-2-炔酰)吡咯烷-3-基)氨基)-2-(4-苯氧基苯基)尼克酰胺參照實(shí)施例4的操作步驟合成實(shí)施例6，但在第一步中用叔-丁基3-氨基吡咯烷-1-羧酸酯取代哌嗪-1-羧酸叔丁酯。msm/z(esi)：441[m+1]1hnmr(400mhz，cd3od)δ7.71-7.58(m，3h)，7.39(t，j＝7.7hz，2h)，7.16(dd，j＝7.4，6.5hz，1h)，7.10-6.96(m，4h)，6.52(dd，j＝8.6，5.3hz，1h)，4.61(dd，j＝6.8，3.3hz，1h)，4.07(dd，j＝11.3，5.9hz，1h)，3.93-3.72(m，2h)，3.70-3.37(m，2h)，2.39-2.24(m，1h)，2.11-1.94(m，4h)。實(shí)施例71-(1-(丁-2-炔酰)吡咯烷-3-基)-3-(4-苯氧基苯基)-1h-吡唑-4-甲酰胺第一步叔-丁基3-((甲磺酰)氧代)吡咯烷-1-羧酸酯將化合物叔-丁基3-羥基吡咯烷-1-羧酸酯7a(561mg，3.0mmol)、甲基磺酰氯(410mg，3.6mmol)、三乙胺(606mg，6.0mmol)和二氯甲烷(50ml)混合，室溫下攪拌4小時(shí)。此混合物用50ml二氯甲烷稀釋后，依次用飽和氯化銨溶液(20ml)和飽和食鹽水(20ml×2)洗滌。將有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥，過濾除去干燥劑，減壓脫溶得到目標(biāo)產(chǎn)物叔-丁基3-((甲磺酰)氧代)吡咯烷-1-羧酸酯7b(790mg)，產(chǎn)率：99％。產(chǎn)物不經(jīng)純化直接用于下一步反應(yīng)。msm/z(esi)：266[m+1]第二步3-羰基-3-(4-苯氧基苯基)丙酸乙酯將混合物碳酸二乙酯(8.8g，75mmol)、氫化鈉(60％，3.0g，75mmol)和甲苯(50ml)加熱到90℃，然后加入化合物1-(4-苯氧基苯基)乙酮7c(6.36g，30mmol)的甲苯(50ml)溶液，將上述反應(yīng)混合物回流攪拌50分鐘。冷卻至室溫，加入50ml水，減壓除去甲苯，殘余物用100ml水稀釋，用二氯甲烷萃取(100ml×3)。將有機(jī)相合并后用無水硫酸鈉干燥，過濾除去干燥劑，減壓脫溶，殘余物用硅膠柱層析純化(石油醚/乙酸乙酯＝50/1)，得到目標(biāo)產(chǎn)物3-羰基-3-(4-苯氧基苯基)丙酸乙酯7d(5.54g)，產(chǎn)率：65％。msm/z(esi)：285[m+1]第三步3-乙氧基-2-(4-苯氧基苯甲酰)丙烯酸乙酯將化合物3-羰基-3-(4-苯氧基苯基)丙酸乙酯7d(5.54g，19.5mmol)、原甲酸三乙酯(11ml，66mmol)和醋酸酐(28ml)混合后，加熱到120℃，攪拌4小時(shí)。減壓脫溶，殘余物用硅膠柱層析純化(石油醚/乙酸乙酯＝50/1)，得到目標(biāo)產(chǎn)物3-乙氧基-2-(4-苯氧基苯甲酰)丙烯酸乙酯7e(2.6g)，產(chǎn)率：25％。msm/z(esi)：341[m+1]第四步3-(4-苯氧基苯基)-1h-吡唑-4-羧酸乙酯將化合物3-乙氧基-2-(4-苯氧基苯甲酰)丙烯酸乙酯7e(2.6g，7.6mmol)、水合肼(0.39g，7.6mmol)和乙醇(50ml)混合后，加熱到85℃，攪拌21小時(shí)。冷卻至室溫，減壓脫溶，殘余物用硅膠柱層析純化(石油醚/乙酸乙酯＝5/1)，得到目標(biāo)產(chǎn)物3-(4-苯氧基苯基)-1h-吡唑-4-羧酸乙酯7f(2.0g)，產(chǎn)率：85％。msm/z(esi)：309[m+1]第五步乙基1-(1-(叔-丁氧基羰基)吡咯烷-3-基)-3-(4-苯氧基苯基)-1h-吡唑-4-羧酸酯將化合物3-(4-苯氧基苯基)-1h-吡唑-4-羧酸乙酯7f(308mg，1.0mmol)、3-((甲磺酰)氧代)叔-丁基3-((甲磺酰)氧代)吡咯烷-1-羧酸酯7b(477mg，1.8mmol)、碳酸銫(650mg，2.0mmol)和無水n，n-二甲基甲酰胺(20ml)混合，加熱到100℃，攪拌16小時(shí)。冷卻至室溫，減壓脫溶，殘余物加飽和碳酸氫鈉(30ml)，用二氯甲烷(50ml×3)萃取。有機(jī)相合并后用無水硫酸鈉干燥，過濾除去干燥劑，減壓脫溶，殘余物用硅膠柱層析純化(石油醚/乙酸乙酯＝10/1)，得到目標(biāo)產(chǎn)物乙基1-(1-(叔-丁氧基羰基)吡咯烷-3-基)-3-(4-苯氧基苯基)-1h-吡唑-4-羧酸酯7g(334mg)，產(chǎn)率：70％。msm/z(esi)：478[m+1]第六步1-(1-(叔-丁氧基羰基)吡咯烷-3-基)-3-(4-苯氧基苯基)-1h-吡唑-4-羧酸將混合物乙基1-(1-(叔-丁氧基羰基)吡咯烷-3-基)-3-(4-苯氧基苯基)-1h-吡唑-4-羧酸酯7g(334mg，0.7mmol)、氫氧化鋰水溶液(1n，7ml，7.0mmol)和乙醇(20ml)加熱到75℃，攪拌1小時(shí)。冷卻至室溫，減壓脫溶，殘余物用5ml水稀釋，用2n鹽酸酸化至ph為6。過濾，得到的固體用15ml水洗滌，真空下干燥得到目標(biāo)產(chǎn)物1-(1-(叔-丁氧基羰基)吡咯烷-3-基)-3-(4-苯氧基苯基)-1h-吡唑-4-羧酸7h(230mg，固體)，產(chǎn)率：73％。msm/z(esi)：450[m+1]第七步叔-丁基3-(4-氨基甲酰-3-(4-苯氧基苯基)-1h-吡唑-1-基)吡咯烷-1-羧酸酯用氨氣向化合物1-(1-(叔-丁氧基羰基)吡咯烷-3-基)-3-(4-苯氧基苯基)-1h-吡唑-4-羧酸7h(230mg，0.51mmol)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-n，n，n′，n′-四甲基脲六氟磷酸酯(232mg，0.61mmol)和無水n，n-二甲基甲酰胺(10ml)的混合物中鼓泡30分鐘，得到的反應(yīng)混合物在室溫下繼續(xù)攪拌30分鐘。用30ml乙酸乙酯稀釋，依次用水(20ml×2)和飽和食鹽水(20ml×2)洗滌。有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥，過濾除去干燥劑，減壓脫溶，殘余物用硅膠柱層析純化(二氯甲烷/甲醇＝50/1)，得到目標(biāo)產(chǎn)物叔-丁基3-(4-氨基甲酰-3-(4-苯氧基苯基)-1h-吡唑-1-基)吡咯烷-1-羧酸酯7i(190mg，油狀物)，產(chǎn)率：83％。msm/z(esi)：449[m+1]第八步3-(4-苯氧基苯基)-1-(吡咯烷-3-基)-1h-吡唑-4-甲酰胺將化合物叔-丁基3-(4-氨基甲酰-3-(4-苯氧基苯基)-1h-吡唑-1-基)吡咯烷-1-羧酸酯7i(190mg，0.42mmol)、鹽酸的乙醇溶液(4n，1ml，4.0mmol)和二氯甲烷(2ml)混合后，室溫下攪拌16小時(shí)。減壓脫溶，得到目標(biāo)產(chǎn)物3-(4-苯氧基苯基)-1-(吡咯烷-3-基)-1h-吡唑-4-甲酰胺7j(120mg，油狀物)。msm/z(esi)：349[m+1]第九步1-(1-(丁-2-炔酰)吡咯烷-3-基)-3-(4-苯氧基苯基)-1h-吡唑-4-甲酰胺利用3-(4-苯氧基苯基)-1-(吡咯烷-3-基)-1h-吡唑-4-甲酰胺7j(120mg，0.34mmol)為原料，參照實(shí)施例1中1的合成方法合成，得到標(biāo)題產(chǎn)物1-(1-(丁-2-炔酰)吡咯烷-3-基)-3-(4-苯氧基苯基)-1h-吡唑-4-甲酰胺7(30mg，固體)，產(chǎn)率：21％。msm/z(esi)：415[m+1]1hnmr(400mhz，cd3od)δ8.18(d，j＝7.0hz，1h)，7.71(dd，j＝8.7，1.9hz，2h)，7.39(t，j＝7.9hz，2h)，7.15(t，j＝7.4hz，1h)，7.04(dd，j＝13.9，8.3hz，4h)，5.10(d，j＝2.9hz，1h)，4.22-4.12(m，1h)，4.06-3.86(m，2h)，3.83-3.62(m，1h)，2.60-2.44(m，2h)，2.05(d，j＝12.0hz，3h)。實(shí)施例81-((1-(丁-2-炔酰)哌啶-4-基)甲基)-3-(4-苯氧基苯基)-1h-吡唑-4-甲酰胺參照實(shí)施例7的操作步驟合成實(shí)施例8，但在第一步中用叔-丁基4-(羥甲基)哌啶-1-羧酸酯取代叔-丁基3-羥基吡咯烷-1-羧酸酯。msm/z(esi)：443[m+1]1hnmr(400mhz，cd3od)δ8.10(s，1h)，7.72-7.64(m，2h)，7.45-7.34(m，2h)，7.16(t，j＝7.4hz，1h)，7.10-6.98(m，4h)，4.46(dd，j＝12.7，8.8hz，2h)，4.12(d，j＝7.2hz，2h)，3.17(d，j＝2.5hz，1h)，2.74(d，j＝2.9hz，1h)，2.35-2.19(m，1h)，2.04(s，3h)，1.71(d，j＝15.5hz，2h)，1.31(s，2h)。實(shí)施例91-(1-(丁-2-炔酰)吖丁啶-3-基)-3-(4-苯氧基苯基)-1h-吡唑-4-甲酰胺參照實(shí)施例7的操作步驟合成實(shí)施例9，但在第一步中用叔-丁基3-羥基吖丁啶-1-羧酸酯取代叔-丁基3-羥基吡咯烷-1-羧酸酯。msm/z(esi)：401[m+1]1hnmr(400mhz，meod)δ8.21(s，1h)，7.75(d，j＝8.7hz，2h)，7.44-7.33(m，2h)，7.16(t，j＝7.4hz，1h)，7.11-6.93(m，4h)，5.33(s，1h)，4.69(dd，j＝20.5，6.8hz，2h)，4.47(dd，j＝27.8，6.7hz，2h)，2.05(s，3h)。btk的活性抑制測試使用體外激酶檢測實(shí)驗(yàn)評估本發(fā)明的化合物對bruton酪氨酸激酶(btk)活性的影響實(shí)驗(yàn)方法概述如下：使用promega公司的adp-glotm激酶檢測試劑盒，通過檢測激酶反應(yīng)中所產(chǎn)生的adp水平來測定btk的體外活性。在激酶檢測實(shí)驗(yàn)中，激酶消耗atp將底物磷酸化，同時(shí)產(chǎn)成adp。adp-glo試劑將終止激酶反應(yīng)并且將剩余的atp完全消耗，最后加入激酶檢測試劑，將adp轉(zhuǎn)化為新的atp。檢測試劑中的螢光素酶在atp和o2參與下能夠催化熒光素，產(chǎn)生氧化型的熒光素、amp并且產(chǎn)生光量子，從而將化學(xué)信號轉(zhuǎn)為光信號(luminecence)。光信號的強(qiáng)度與激酶反應(yīng)中adp產(chǎn)生量呈正相關(guān)，從而能夠定量檢測激酶btk的活性。所有檢測實(shí)驗(yàn)均在23℃恒溫進(jìn)行，使用corning3674白色384孔檢測板，激酶btk(全長his-tag)由公司內(nèi)部表達(dá)純化，激酶底物為多肽(4∶1glu，tyr)(購自signalchem)和atp(sigma)，使用酶標(biāo)儀envision(perkinelmer)讀取光信號。檢測緩沖液包括40mmtris-hc(ph7.5)、10mmmgcl2(sigma)、2mmmncl2(sigma)、0.05mmdtt(sigma)和0.01％bsa(sigma)；將激酶btk使用檢測緩沖液配制為1.6ng/ul濃度的激酶反應(yīng)溶液；底物反應(yīng)溶液包括0.2mg/ml多肽底物和50μmatp。化合物ic50由10個(gè)濃度點(diǎn)通過以下公式計(jì)算。先將化合物在100％dmso中溶解稀釋至1mm，然后用dmso進(jìn)行3倍的系列稀釋至最低濃度為0.05μm，每個(gè)濃度點(diǎn)再使用檢測緩沖液稀釋40倍。向384孔檢測板中先添加1ul系列濃度的化合物溶液和2ul激酶反應(yīng)溶液，混合均勻后室溫避光孵育30分鐘；隨后加入2ul底物反應(yīng)溶液，反應(yīng)總體積為5ul，將反應(yīng)混合物在室溫避光反應(yīng)60分鐘；隨后加入與反應(yīng)等體積的5uladp-glotm試劑終止反應(yīng)，混合均勻后室溫放置40分鐘；最后加入10ul激酶檢測試劑，室溫避光放置30分鐘，然后在envision上讀取數(shù)值。抑制百分率基于以下公式計(jì)算：抑制％＝[1-(rlu化合物-rlumin)/(rlumax-rlumin)]x100其中rlu化合物為給定化合物濃度下的冷光讀數(shù)，rlumin為不加入激酶的情況下的冷光讀數(shù)，rlumax為不加入化合物的情況下的冷光讀數(shù)。通過使用excel中xlfit程序來計(jì)算化合物的ic50?；衔锞幪杋c50(nm)化合物編號ic50(nm)1.a2.a3.c4.a5.a6.a7.a8.c9.aa＜100nm；b＝100至500nm；c＞500nm結(jié)論：本發(fā)明的化合物對bruton酪氨酸激酶(btk)的活性具有明顯的抑制效應(yīng)。當(dāng)前第1頁12