本發(fā)明涉及一株植物內生菌根真菌；特別涉及一株從越橘屬植物藍莓根系分離獲得的一種促進藍莓營養(yǎng)吸收的菌根真菌及其制備方法與應用。

背景技術：

植物菌根是指植物根系與真菌所形成的互惠共生體即“菌根”(mycorrhizas)，是一種極為普遍的生命活動和生態(tài)現象。Frank 1885年首次擬創(chuàng)了“菌根”這個術語，之后若干年一直處于平穩(wěn)發(fā)展期，直到20世紀50年代，菌根學在現代分子生物學和生化技術的輔助下進入迅猛共發(fā)展期，尤其是近30年，隨著新方法、新技術的不斷建立，研究內容更加廣泛，菌根學研究已成為一項包括多種學科相互滲透的一門邊緣生物科學。

菌根真菌的侵染能誘導植物根系形態(tài)發(fā)生明顯變化，影響菌根周圍各成員的相互作用。Duckett和Read(1995)研究發(fā)現Hymenoscyphus ericae分離物能促使假根根尖膨大，并在其細胞內形成菌絲團。菌根真菌還可通過分泌H⁺和一些酸性化合物，直接影響到土壤化學特性。大量研究表明，菌根真菌能顯著促進植物對土壤中營養(yǎng)物質的吸收、提高植物抗病蟲害的作用。接種菌根真菌還可促進各類植物生長、提高產量和品質，并促進組培苗的生長，提高移栽成活率。

藍莓(blueberry)又名越橘，是杜鵑花科(Ericaceae)越橘屬(Vaccinium spp.)植物，為多年生落葉或常綠灌木，果實為漿果。在我國原產于高海拔的野生灌木，在吉林長白山分布于海拔1500-2400米的地區(qū)。其須根部缺少大部分植物所具有的根毛，需借助合適的菌根菌幫助其吸收水分、礦物質營養(yǎng)等。

技術實現要素：

本發(fā)明針對上述現有技術中存在的問題，提供一種從野生越橘根系中獲得菌根真菌，目的是促進藍莓根系生長發(fā)育、提高N、P、K吸收作用及提高藍莓產量。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種菌根真菌的制備方法。

本發(fā)明是通過以下技術方案來實現的。

一種菌根真菌MF001，該菌根真菌分類名稱為：白囊耙齒菌(Irpex lacteus)，其保藏編號為CGMCC No.4108，保藏日期為2010年8月18日，保藏單位名稱：中國微生物菌種保藏管理委員會普通生物中心(簡稱CGMCC)，保藏單位地址為：中國北京市海淀區(qū)中關村北一條13號。

所述的白囊耙齒菌引物擴增DNA序列如下：

本發(fā)明一種菌根真菌的制備方法包括如下步驟：

取新鮮完整的健康野生越橘的根，用自來水沖洗一小時，然后用無菌水沖洗3次，放入70℃的乙醇中滅菌30秒，再轉入0.1％的升汞溶液中表面消毒2分鐘，然后立即轉入1％的無菌硫化鈉水溶液中清洗，浸泡2分鐘，然后切成0.5厘米長的根段置于PDA培養(yǎng)基平板上，25℃下恒溫培養(yǎng)，待長出菌落后，將菌落邊緣純凈的菌絲挑入新的PDA培養(yǎng)平板上培養(yǎng)，生長兩天確認無污染后轉入PDA試管中保存，所得真菌為白囊耙齒菌(Irpex lacteus)MF001 CGMCC No.4108。

所述白囊耙齒菌(Irpex lacteus)MF001 CGMCC No.4108的基本培養(yǎng)形態(tài)特征為：在PDA板上，28℃培養(yǎng)5天后菌落直徑為8.6cm；菌絲粗壯，無分枝，無隔膜，表面白色有細長毛，無分生孢子。

所述的白囊耙齒菌(Irpex lacteus)MF001 CGMCC No.4108在藍莓組培階段、瓶外生根階段和大田栽培階段的應用。

本發(fā)明的優(yōu)點效果如下：

本發(fā)明對從健康的野生越橘根系中分離得到的對藍莓具有促進根系發(fā)育，提高N、P、K吸收率，增加藍莓產量的菌根菌，并對其進行了種屬鑒定和回接試驗研究，旨在為藍莓栽培產業(yè)開發(fā)提供優(yōu)良的菌根菌株。接種菌根菌白囊耙齒菌對藍莓的生長起到明顯的促進作用。因此該菌株具有較好的應用前景，可以作為藍莓生產儲備菌株。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的菌根真菌顯微鏡下菌絲體形態(tài)圖。

圖2為本發(fā)明的菌根真菌分子鑒定進化樹圖。

圖3接種菌根真菌MF001對藍莓組培苗的生長。

圖4接種MF001對馴化階段的藍莓組培苗的影響。

圖5接種MF001對2年生盆栽藍莓的影響。

具體實施方式

下面結合附圖對本發(fā)明做進一步的說明。

表1為盆栽藍莓葉片中全N、全P、全K的含量及差異顯著性分析。

實施例1

藍莓菌根真菌菌株白囊耙齒菌(Irpex lacteus)MF001 CGMCC No.4108菌的篩選及其鑒定

(1)本發(fā)明中的真菌分離自長白山南的野生越橘的根系中

具體方法為：取新鮮完整的健康野生越桔根，用自來水沖洗1小時，然后用無菌水沖洗3次，放入70℃的乙醇中滅菌30秒，再轉入0.1％的升汞溶液中表面消毒2分鐘，然后立即轉入1％的無菌硫化鈉水溶液中清洗，浸泡2分鐘，然后切成0.5厘米長的根段置于PDA培養(yǎng)基平板上，25℃下恒溫培養(yǎng)，待長出菌落后，將菌落邊緣純凈的菌絲挑入新的PDA培養(yǎng)平板上培養(yǎng)，生長兩天確認無污染后轉入PDA試管中保存。將獲得的真菌繼續(xù)接種到瓶外生根的藍莓苗，觀察藍莓接菌后的生長情況，把對藍莓苗明顯促進作用的菌株篩選出來。上述方法從幾株真菌中篩選到一株對藍莓苗有促進作用的菌株，將其命名為MF001。

(2)白囊耙齒菌(Irpex lacteus)的鑒定

在PDA板上，28℃培養(yǎng)5天后菌落直徑為8.6cm。菌絲粗壯，無分枝，無隔，菌絲寬50-100μm，無分生孢子。如圖1所示。

對該菌株的rDNA-ITS序列即18S，ITS1,5.8S,ITS2和28S區(qū)域部分序列進行擴增鑒定：提取菌株的基因組DNA作為模板，采用兩條通用引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGCGG-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTAGATATGC-3’)進行PCR擴增，獲得大小約0.6Kb的擴增產物。擴增片段克隆后送由上海生工進行測序，測序獲得655個堿基的ITS序列，序列如圖2所示。

將該菌株的上述rDNA-ITS序列在Genbank數據庫中進行BLAST比對，結果顯示，其序列與Irpex lacteus的rDNA-ITS區(qū)序列同源性達到99％。

通過上述表性特征和分子特征將其鑒定為Irpex lacteus屬真菌，即白囊耙齒菌(Irpex lacteus)，該菌根真菌分類名稱為：白囊耙齒菌(Irpex lacteus)，其保藏編號為CGMCC No.4108，保藏日期為2010年8月18日，保藏單位名稱：中國微生物菌種保藏管理委員會普通生物中心(簡稱CGMCC)，保藏單位地址為：中國北京市海淀區(qū)中關村北一條13號。

所述的白囊耙齒菌引物擴增DNA序列如下：

實施例2

菌根真菌MF001的使用方法及其對藍莓生長情況的研究結果

1、接種本發(fā)明的菌根真菌(MF001)對生根的藍莓組培苗的影響

將已生根的藍莓組培苗放在共生培養(yǎng)基中，每瓶一株。用7mm打孔器在菌絲邊緣打孔，得到新鮮菌塊。將菌塊倒置于瓶內組培苗根系附近，每瓶接一個菌塊。另設置不接菌對照處理，每種處理5個重復。將組培苗于恒溫培養(yǎng)箱放置6個月，溫度25℃，光強1500-2000lx，光照12h/d。

實驗表明(圖3)，接種菌根真菌MF001對藍莓組培苗的生長促進作用較為明顯，接菌處理的生長量比對照高出30％。

2、接種MF001對馴化階段的藍莓組培苗的影響

待2個月后形成菌根，用無菌鑷子把培養(yǎng)瓶內的瓊脂輕輕搗碎，將已形成菌根的藍莓組培苗從培養(yǎng)基中拔出，然后放入25℃溫水中輕輕洗去瓊脂培養(yǎng)基。洗去瓊脂后將其移植到0.1MPa壓力下滅菌2.5小時的營養(yǎng)土上。移植時先用塑料育苗缽盛裝己滅菌的培養(yǎng)基質達2/3容器高時，挖定植坑，接入1ml菌種，再栽上組培苗，在根部覆蓋2-3cm厚的珍珠巖并澆水透濕。然后，放置在光照培養(yǎng)箱中，溫度25℃，光照12h/d，每周澆WPM營養(yǎng)液一次，并進行常規(guī)管理。3個月后記錄植株生長量。

實驗表明(圖4)接菌MF001對藍莓組培苗馴化階段植株的生長勢也表現出明顯促進作用，接菌處理的植株生長量高出對照56.1％。

3、接種MF001對盆栽藍莓的影響

將擴大繁殖的菌根真菌MF001接種在盆栽藍莓根際周圍，20盆重復，2年生每株接種5ml菌液，5年生接種10ml,接種后覆土遮蓋植株根系。接種需重復一次，間隔時間為一個月。按照常規(guī)方法進行水肥管理。2個月后記錄植株生長量及莖粗。

實驗表明(圖5)，2年生接菌2個月的藍莓苗盆栽階段對植株生長的促進作用較明顯，生長量高于對照34.54％。5年生接種6個月效果較明顯,生長量高出對照28.2％。

即，接種MF001菌后，藍莓組培苗、馴化苗和株高分別比對照高出30.0％、56.1％，2年生接菌2個月的藍莓苗盆栽階段對植株生長的促進作用較明顯，生長量高于對照34.54％。5年生接種6個月效果較明顯,生長量高出對照28.2％。藍莓N、P、K吸收率顯著提高，分別比對照增加8.76％、11.7％、31.8％。接種菌根菌白囊耙齒菌對藍莓的生長起到明顯的促進作用。因此該菌株具有較好的應用前景，可以作為藍莓生產儲備菌株。

實施例3

藍莓菌根菌對藍莓生長過程中N、P、K的吸收的影響

將二年生藍莓盆栽苗根部在菌劑中迅速浸潤，然后定植在花盆里，定植后澆透水。一個月后，在藍莓根部再次補澆菌劑，每盆5m l。試驗設置不接菌的對照處理，每種處理20個重復。采集藍莓葉片，測定其N、P、K含量。其中采用凱氏定氮法測定全N，鉬銻抗比色法測定全、P，原子吸收法測定全K含量。每處理隨機采集5份。

結果表明：

1、全N測定中，MF001處理的全N含量為0.993％，與對照相比均達到了顯著水平(α＝0.05)，比對照增加了8.76％，說明接菌處理能夠增加藍莓體內N元素的含量。

2、全P測定中，MF001處理的全P含量為0.114％，兩種處理存在顯著差異，比對照增加了11.7％，說明接菌處理能夠增加藍莓體內P元素的含量。

3、全K測定中，MF001處理的全K含量為0.605％,比對照增加了31.8％,說明接菌處理能夠增加藍莓體內K元素的含量。

表1 盆栽藍莓葉片中全N、全P、全K的含量及差異顯著性分析

Table 5-1 Contents and significance of differences of N,P and K in blueberries