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一種自旋標(biāo)記駱駝寧堿A化合物、制備方法及其用途與流程

文檔序號(hào):11124170閱讀:991來(lái)源:國(guó)知局

本發(fā)明涉及一種自旋標(biāo)記駱駝寧堿A化合物,以及這種化合物的制備方法和其在制備抗腫瘤藥物中的用途。屬于醫(yī)藥領(lǐng)域。



背景技術(shù):

駱駝寧堿A是1997年從中國(guó)藥用植物駱駝?shì)?Peganum nigellastrum Bunge.)中分離出的一種天然喹唑啉類生物堿??蒲泄ぷ髡邔?duì)駱駝寧堿A的關(guān)注,主要是因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)駱駝寧堿A與具有抗癌活性的喜樹(shù)堿有類似的化學(xué)結(jié)構(gòu),而且在體外對(duì)小鼠腫瘤細(xì)胞P388細(xì)胞系有抑制作用(IC501.8μg/mL),并證明了它有類似喜樹(shù)堿的抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶I活性((1)Molecules,2011,16,4861-4883)?;诖耍陙?lái)科研工作者以駱駝寧堿A為先導(dǎo)模型,系統(tǒng)開(kāi)展了駱駝寧堿A及其衍生物的全合成、結(jié)構(gòu)優(yōu)化以及抗腫瘤活性評(píng)價(jià)研究((1)Org.Biomol.Chem.,2007,5,2486–2490;(2)Bioorganic&Medicinal Chemistry,2007,15,4237–4246;(3)Tetrahedron Letters,2011,52,1592–1596;(4)Tetrahedron Letters 2004,45,6721–6723;(5)TetrahedronLetters,1998,39,9097-9098)。盡管近年來(lái)科研工作者在駱駝寧堿的衍生合成和抗腫瘤構(gòu)效關(guān)系做了大量的研究工作,然而駱駝寧堿A作為一個(gè)抗腫瘤先導(dǎo)分子,仍存在抗腫瘤活性低和活性譜窄的問(wèn)題,甚至經(jīng)衍生與結(jié)構(gòu)修飾后,衍生物抗腫瘤活性得不到有效改善或完全喪失。而截至目前仍未有一個(gè)有效的修飾和優(yōu)化策略來(lái)改善該類分子的抗腫瘤效果。



技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:

本發(fā)明的目的在于提供一種新的自旋標(biāo)記駱駝寧堿化合物,同時(shí),本發(fā)明的另一目的是提供這種化合物的制備方法及其在抗腫瘤藥物中的用途。

本發(fā)明所述的一種新的自旋標(biāo)記駱駝寧堿化合物具有式1所示的化學(xué)結(jié)構(gòu),記為自旋標(biāo)記駱駝寧堿A化合物:

近年來(lái),大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)了穩(wěn)定氮氧自由基具有明確的抗腫瘤活性,在體內(nèi)外對(duì)多種腫瘤具有選擇性抑制作用,能增加化療和放療效果并降低其副作用,最令人鼓舞的是應(yīng)用穩(wěn)定氮氧自由基能夠長(zhǎng)期預(yù)防和延緩腫瘤的發(fā)生而無(wú)明顯副作用,被認(rèn)為是最具臨床應(yīng)用潛力的領(lǐng)域((1)J.Heterocyclic Chem.2005,42,437~449;(2)FreeRadic.Biol.&Med.2007,42,1632~1650.)。特別是將穩(wěn)定氮氧自由基標(biāo)記于抗腫瘤藥物分子中以改善其藥效學(xué)特性成為其優(yōu)化設(shè)計(jì)抗腫瘤藥物的一種重要策略(Pure&Appl.Chem.1990,62,289~294.)。穩(wěn)定氮氧自由基標(biāo)記(或稱為自旋標(biāo)記)的噻替哌、亞硝基脲、氮芥、順鉑類烷化劑(Acta Pharm.Sin.1988,23,792~798);鬼臼毒素類似物((1)Anticancer Drug Des.1993,8,193~202;(2)Europ.J.Med.Chem.2014,75,282~288)、5-氟脲嘧啶(高等學(xué)?;瘜W(xué)學(xué)報(bào),1992,13,1561~1563.)、阿霉素(高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報(bào),2000,21,884~887)、魚(yú)藤酮(Bioorg.Med.Chem.Lett.2012,22,920~923)以及CA-4(Bioorg.Med.Chem.2013,21,1248~1256)等抗腫瘤分子被大量衍生合成,其藥理活性評(píng)價(jià)表明:一些穩(wěn)定氮氧自由基能迅速穿越細(xì)胞膜和血腦屏障,將其作為載體與一些抗癌藥物相連,能促使運(yùn)載藥物優(yōu)先穿過(guò)細(xì)胞膜,易于積累于腫瘤組織中,從而使其藥物的抗癌活性保持甚至增加,使母體藥物能更好發(fā)揮抗腫瘤活性。

據(jù)此,為了提高駱駝寧堿A的抗腫瘤活性,以現(xiàn)有駱駝寧堿A的抗腫瘤構(gòu)效關(guān)系為線索,本發(fā)明在保留駱駝寧堿A先導(dǎo)結(jié)構(gòu)所具有的生物相容性和類藥性基礎(chǔ)上,通過(guò)全合成設(shè)計(jì)了一種“嵌合”型的自旋標(biāo)記駱駝寧堿A化合物,經(jīng)進(jìn)一步評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)表明本發(fā)明的這種化合物對(duì)人肺腺癌細(xì)胞(A549)、人乳腺癌細(xì)胞株(MDA-MB-468)、人卵巢癌細(xì)胞(SKOV3)和人結(jié)腸癌細(xì)株(HCT 116)4種腫瘤細(xì)胞株具有理想的抑制活性。

本發(fā)明制備方法按如下化學(xué)反應(yīng)式進(jìn)行:

自旋標(biāo)記駱駝寧堿化合物制備方法如反應(yīng)式2所示,即將鄰苯二甲酸酐1和芐胺溶于適量的冰醋酸中,加熱回流獲得中間體2,然后將中間體2溶于適量的二甲苯中,惰性氣體保護(hù)下在60~70℃之間下在前述液體內(nèi)緩慢加入甲基碘化鎂,再將反應(yīng)液逐漸加熱至165℃~180℃回流反應(yīng)2小時(shí),反應(yīng)結(jié)束后在此溫度下減壓蒸除大部分溶劑,然后冷卻至室溫,向其中加入大量石油醚得渾濁液,將其通過(guò)硅藻土抽濾,收集所有濾液,將濾液置于空氣中24小時(shí)后再用堿性氧化鋁進(jìn)行層析,經(jīng)濃縮后得到產(chǎn)物3,再在產(chǎn)物3中加入20~30毫升的冰醋酸使其溶解,然后加入10%的鈀碳,攪拌均勻后將反應(yīng)體系在4個(gè)大氣壓的惰性氣體保護(hù)下進(jìn)行充分反應(yīng),將反應(yīng)液固液分離后濃縮得到淡黃色中間產(chǎn)品4,將中間體4溶于50毫升的甲醇/乙腈=14/1(體積比)中,然后依次加入碳酸氫鈉(15eq),二水合鎢酸鈉(0.55eq),最后加入30%(體積比)的雙氧水溶液,此渾濁反應(yīng)液在常溫下充分?jǐn)嚢璺磻?yīng),反應(yīng)結(jié)束后加入少量水淬滅反應(yīng),除去溶劑,加入適量的水和1N的硫酸溶液進(jìn)行萃取,合并有機(jī)相,以硫酸鎂干燥過(guò)濾后,減壓濃縮后得到黃色產(chǎn)品5,在冰浴條件下在中間體5中緩慢,將加入濃硫酸并攪拌,在冰浴條件下攪拌30分鐘后將其置于60℃的油浴中反應(yīng)20分鐘,然后再將其置于冰浴中,將發(fā)煙硝酸逐滴加入到上述溶液中,滴加完畢后,在冰浴條件下攪拌反應(yīng)30分鐘后再常溫下攪拌過(guò)夜,次日,將此橘紅色反應(yīng)液加熱至100℃反應(yīng)20分鐘,然后置于冰浴中,將10%(質(zhì)量比)的氫氧化鈉溶液緩慢加入其中調(diào)節(jié)pH值至8左右,用氯仿將其進(jìn)行萃取,合并有機(jī)相,以硫酸鎂干燥后過(guò)濾,減壓濃縮得黃色固體6,將中間體6用甲醇溶解,再在其中加入10%的干鈀碳,攪拌均勻,用氫氣加壓至1個(gè)大氣壓,攪拌反應(yīng)6小時(shí),反應(yīng)結(jié)束后過(guò)濾,減壓濃縮濾液得到黃色固體7,再將中間體7溶于甲醇中,然后加入醋酸銅醋酸銅(0.128eq),常溫下攪拌反應(yīng)3小時(shí),反應(yīng)結(jié)束后用氯仿淬滅反應(yīng),濃縮后得固體殘?jiān)?,以石油?乙酸乙酯為洗脫劑經(jīng)柱層析得到淡黃色的固體純品8,將化合物9先溶于干燥的二氯甲烷當(dāng)中,加入催化量的DMF,然后將草酰氯溶于30~50毫升的干燥二氯甲烷中,冰浴條件下以緩慢滴將其滴入上述反應(yīng)液中,反應(yīng)1.5小時(shí)后將反應(yīng)液減壓濃縮得固體結(jié)晶,將其再溶于干燥二氯甲烷中,并在冰浴條件下緩慢滴入含中間體8(1.5eq),、碳酸氫鈉(4.5eq)的30~50毫升干燥二氯甲烷溶液中反應(yīng),反應(yīng)結(jié)束后加入水淬滅反應(yīng),并用氯仿萃取反應(yīng)液,合并有機(jī)相,以硫酸鎂干燥過(guò)濾后減壓濃縮得固體殘?jiān)月确?甲醇為洗脫劑經(jīng)柱層析純化得到黃色固體產(chǎn)品10,將產(chǎn)物10(3.6mmol)溶于甲苯(50mL)和水(0.2mL)中,然后依次加入碳酸鉀(7.2mmol),溴化鋰(7.2mmol),TBAB(0.4mmol),溴丙炔(5.7mmol),然后將反應(yīng)升溫至80℃充分反應(yīng),反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液減壓濃縮的固體殘?jiān)?,以氯?甲醇為洗脫劑經(jīng)柱層析純化得到橘黃色固體產(chǎn)品11,將三苯基氧膦(2.75eq)溶于30~50毫升干燥二氯甲烷中,在冰浴條件下將三氟甲磺酸酐(1.38eq)溶于30~50毫升的干燥二氯甲烷中,再將溶有三氟甲磺酸酐的二氯甲烷緩慢地滴加進(jìn)入溶有三苯基氧膦的二氯甲烷溶液,在零攝氏度下攪拌反應(yīng)30分鐘,將中間體11溶于30~50毫升的干燥二氯甲烷中,在冰浴條件下將其緩慢滴加到溶有三氟甲磺酸酐的二氯甲烷溶液中,攪拌并充分反應(yīng),反應(yīng)完畢后加入10%(體積比)的碳酸氫鈉水溶液淬滅反應(yīng),減壓濃縮后得固體殘?jiān)月确?甲醇為洗脫劑經(jīng)柱層析純化得到橘黃色目標(biāo)化合物12。

經(jīng)體外抗腫瘤活性篩選結(jié)果表明,與駱駝寧堿A相比,本發(fā)明所合成的自旋標(biāo)記駱駝寧堿A化合物對(duì)人肺腺癌細(xì)胞(A549)、人乳腺癌細(xì)胞株(MDA-MB-468)、人卵巢癌細(xì)胞(SKOV3)和人結(jié)腸癌細(xì)株(HCT 116)表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制活性。因此,本發(fā)明合成的化合物可用于制備抗腫瘤的藥物。本發(fā)明所述的自旋標(biāo)記駱駝寧堿A化合物結(jié)構(gòu)新穎、產(chǎn)品純度高,對(duì)腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用,具有很好的應(yīng)用前景。

以下通過(guò)具體實(shí)施方式,對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。但不應(yīng)將此理解為對(duì)本發(fā)明的限。

具體實(shí)施方式

一、本發(fā)明的自旋標(biāo)記駱駝寧堿化合物的制備方法

以下是本發(fā)明的自旋標(biāo)記駱駝寧堿化合物最佳制備方法:

1)中間體2的合成:將鄰苯二甲酸酐(1.69eq)置于適量的冰醋酸中,然后將芐胺(2.3eq)緩慢的加入其中。將此混合物加熱回流反應(yīng)5小時(shí)后,將熱的反應(yīng)液直接倒入冰水中,出現(xiàn)大量沉淀,抽濾后用冷水將濾餅沖洗幾遍,晾干后得化合物2(參考Chemistry–A European Journal,2009,15(47):12960-12962),參見(jiàn)式6。

2)中間體3的合成:首先,將整個(gè)反應(yīng)裝置抽成真空,并用氬氣置換3~5次,然后將甲基碘化鎂(6eq)用注射器打入圓底燒瓶?jī)?nèi),將其加熱至90攝氏度,減壓抽去溶劑乙醚,直至圓底燒瓶?jī)?nèi)的液體不再冒泡為止,恢復(fù)常壓并將其降至60攝氏度。然后將中間體2(1eq)溶于適量的二甲苯中,將其用注射器緩慢地打入反應(yīng)瓶?jī)?nèi),保持反應(yīng)液得溫度在60~70攝氏度之間。注射完畢后,將反應(yīng)液加熱至165攝氏度回流反應(yīng)2小時(shí)后,在此溫度下減壓蒸去一半溶劑;然后將反應(yīng)溫度升至180攝氏度在回流反應(yīng)2小時(shí),反應(yīng)結(jié)束后在此溫度下減壓蒸除大部分溶劑,然后冷卻至室溫,向其中加入大量石油醚得渾濁液,將其通過(guò)硅藻土抽濾,并用石油醚沖洗濾餅若干次,收集所有濾液,將濾液置于空氣中24小時(shí)后,溶液呈現(xiàn)紫羅蘭色。將此紫色有機(jī)溶劑用堿性氧化鋁進(jìn)行層析,再次收集所有層析后的有機(jī)溶劑,減壓濃縮后得到最終產(chǎn)品,熱的狀態(tài)下呈無(wú)色油狀,冷卻后呈白色固體結(jié)晶3(參考Chemistry–A European Journal,2009,15(47):12960-12962),參見(jiàn)式7。

3)中間體4的合成:將中間體3(621mg)置于高壓釜的內(nèi)襯中,加入適量冰醋酸使其溶解,然后加入10%的干鈀碳(56.5mg),攪拌均勻后將高壓釜密封,將反應(yīng)體系內(nèi)部用氫氣置換3~5次,最后將體系內(nèi)充氫氣直到4個(gè)大氣壓為止。反應(yīng)5小時(shí)后,將此反應(yīng)液過(guò)濾,濾餅用二氯甲烷沖洗,將濾液減壓濃縮后溶于水中,然后用10%的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值到9左右,用氯仿萃取3次,合并萃取液,用硫酸鎂干燥過(guò)濾后,減壓濃縮后得到淡黃色產(chǎn)品4(參考Australian Journal ofChemistry,1983,36(2):397-401),參見(jiàn)式8。

4)中間體5的合成:將中間體4(18.8eq)溶于適量的甲醇/乙腈=14/1中,然后依次加入碳酸氫鈉(15eq),二水合鎢酸鈉(0.55eq),最后加入30%的雙氧水溶液(62eq),此渾濁反應(yīng)液在常溫下攪拌反應(yīng)兩天,反應(yīng)結(jié)束后加入少量水淬滅反應(yīng)。減壓蒸去溶劑,加入適量的水和1N的硫酸溶液進(jìn)行萃取,合并有機(jī)相,以硫酸鎂干燥過(guò)濾后,減壓濃縮后得到黃色產(chǎn)品5(參考Australian Journal ofChemistry,1983,36(2):397-401),參見(jiàn)式9。

5)中間體6的合成:將中間體5(7.07mmol)置于圓底燒瓶中,在冰浴條件下將濃硫酸(13.5mL)緩慢滴入其中并攪拌,此時(shí)溶液呈紅褐色。在冰浴條件下攪拌半小時(shí)左右后將其置于60攝氏度的油浴中反應(yīng)20分鐘,然后再將其置于冰浴中。待其冷卻至零攝氏度,將發(fā)煙硝酸(19.1mmol)逐滴加入到上述溶液中,滴加完畢后,在冰浴條件下攪拌反應(yīng)30分鐘后再常溫下攪拌過(guò)夜。次日,將此橘紅色反應(yīng)液加熱至100攝氏度反應(yīng)20分鐘,然后置于冰浴中,將10%的氫氧化鈉溶液緩慢加入其中調(diào)節(jié)pH值至8左右。用氯仿將其進(jìn)行萃取,合并有機(jī)相,以硫酸鎂干燥后過(guò)濾,減壓濃縮得黃色固體6(參考(1)Australian Journal ofChemistry,1983,36(2):397-401;(2)Bioconjugate Chemistry,2013,24(6):1110-1117),參見(jiàn)式10。

6)中間體7的合成:將中間體6(6.38mmol)置于高壓釜內(nèi)襯中并以適量甲醇溶解,加入10%的干鈀碳(150mg),攪拌均勻,用氫氣將高壓釜內(nèi)部置換3~5次,最終用氫氣加壓至1個(gè)大氣壓,攪拌反應(yīng)6小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后過(guò)濾,減壓濃縮濾液得到黃色固體7(參考Organic&Biomolecular Chemistry,2013,11(25):4147-4153.),參見(jiàn)式11。

7)中間體8的合成:將中間體7(6.38eq)溶于適量的甲醇中,然后加入醋酸銅(0.128eq),常溫下攪拌反應(yīng)3小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后用氯仿淬滅反應(yīng),減壓濃縮后得固體殘?jiān)允兔?乙酸乙酯為洗脫劑經(jīng)柱層析得到淡黃色的固體純品8(參考(1)Organic&Biomolecular Chemistry,2013,11(25):4147-4153;(2)Journal of the American Chemical Society,1975,97(5):1273-1274),參見(jiàn)式12。

8)中間體10的合成:將化合物9(3eq)先溶于干燥的二氯甲烷當(dāng)中,加入催化量的DMF,然后將草酰氯(9eq)溶于適量的干燥二氯甲烷中,冰浴條件下以恒壓漏斗逐滴將其滴入上述反應(yīng)液中。反應(yīng)1.5小時(shí)后將反應(yīng)液減壓濃縮得固體結(jié)晶,將其再溶于干燥二氯甲烷中,并將其在冰浴條件下逐滴滴入含中間體8(1.5eq),碳酸氫鈉(4.5eq)的干燥二氯甲烷溶液中。TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程,反應(yīng)結(jié)束后加入水淬滅反應(yīng),并用氯仿萃取反應(yīng)液,合并有機(jī)相,以硫酸鎂干燥過(guò)濾后減壓濃縮得固體殘?jiān)月确?甲醇為洗脫劑經(jīng)柱層析純化得到黃色固體產(chǎn)品10,參見(jiàn)式13。

9)中間體11的合成:將中間體10(3.6mmol)溶于甲苯(50mL)和水(0.2mL)中,然后依次加入碳酸鉀(7.2mmol),溴化鋰(7.2mmol),TBAB(0.4mmol),溴丙炔(5.7mmol),然后將反應(yīng)升溫至80攝氏度,反應(yīng)2小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液減壓濃縮的固體殘?jiān)?,以氯?甲醇為洗脫劑經(jīng)柱層析純化得到橘黃色固體產(chǎn)品11,參見(jiàn)式14。

10)自旋標(biāo)記的駱駝寧堿12的合成:將三苯基氧膦(2.75eq)溶于干燥的二氯甲烷中,在冰浴條件下將三氟甲磺酸酐(1.38eq)溶于適量的干燥二氯甲烷中并緩慢地滴加進(jìn)入上述溶液,在零攝氏度下攪拌反應(yīng)30分鐘。將中間體11(0.92eq)溶于適量的干燥二氯甲烷中,在冰浴條件下將其緩慢滴加進(jìn)入上述溶液中。TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程,反應(yīng)完畢后加入10%的碳酸氫鈉水溶液淬滅反應(yīng)。減壓濃縮后得固體殘?jiān)?,以氯?甲醇為洗脫劑經(jīng)柱層析純化得到橘黃色目標(biāo)化合物12。

IR(KBr):3438,2982,1678,1628,1609,1576,1487,1468,1442,1385,1367(NO·),1239,776,694,638cm-1;MS-ESI m/z:399.2[M+2H]+;ESR:g=2.0079.

二、自旋標(biāo)記駱駝寧堿的抗腫瘤活性的試驗(yàn)方法及結(jié)果

本發(fā)明的藥理實(shí)驗(yàn)采用磺酰羅丹明B(sulforhodamine B,SRB)比色法。腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)選用10%胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培養(yǎng)基,將腫瘤細(xì)胞接種于96孔板,每個(gè)孔培養(yǎng)3-5×103個(gè)細(xì)胞,加入不同濃度的待測(cè)試目標(biāo)化合物溶液。培養(yǎng)72小時(shí)后,每孔加入預(yù)冷的三氯乙酸溶液(50%,w/v)固定細(xì)胞,冰箱中固定30分鐘。待96孔板室溫下晾干后,每孔加入0.04%(w/v)的SRB染液(1%的乙酸配制,購(gòu)自Sigma Chemical公司),染色30分鐘后倒掉染液,用乙酸沖洗4次,去除未結(jié)合的染料,室溫晾干。用100μL非緩沖Tris-base堿液溶解與細(xì)胞蛋白結(jié)合的染料,水平搖床上振蕩20分鐘,采用ELx800吸收光酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Tek公司生產(chǎn),操作軟件Gen5)測(cè)定515nm處吸收值。所有試驗(yàn)設(shè)3個(gè)平行組或重復(fù)三次。自旋標(biāo)記駱駝寧堿(12)的細(xì)胞毒活性測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表1。

表1自旋標(biāo)記駱駝寧堿A(12)和駱駝寧堿A的細(xì)胞毒活性試驗(yàn)結(jié)果

注:(1)篩選方法:磺酰羅丹明B比色法;(2)作用時(shí)間:72小時(shí)。

對(duì)4腫瘤細(xì)胞株體外細(xì)胞毒活性測(cè)試結(jié)果顯示:與駱駝寧堿A相比,本發(fā)明所合成的自旋標(biāo)記駱駝寧堿A化合物對(duì)人肺腺癌細(xì)胞(A549)的抑制活性提高了16倍以上;對(duì)人乳腺癌細(xì)胞株(MDA-MB-468)的抑制活性提高了7倍以上、對(duì)人卵巢癌細(xì)胞(SKOV3)的抑制活性提高了2倍以上;對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)株(HCT 116)的抑制活性提高近14倍,基于上述活性測(cè)試,進(jìn)一步說(shuō)明通過(guò)本發(fā)明的這種優(yōu)化策略,可顯著提高駱駝寧堿A的抗腫瘤活性,為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)高活性自旋標(biāo)記駱駝寧堿A衍生物提供了理論依據(jù)。且本發(fā)明所述化合物表現(xiàn)出較好的應(yīng)用前景。

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