本發(fā)明屬于蔬菜分子育種技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及利用分子標(biāo)記對(duì)花椰菜花梗長(zhǎng)度性狀進(jìn)行輔助選擇的方法。

背景技術(shù)：

松散花球型花椰菜（簡(jiǎn)稱松花菜）是近年來(lái)迅速發(fā)展起來(lái)的一種花椰菜新類型，由于其口感脆嫩、易入味等優(yōu)點(diǎn)，廣受我國(guó)消費(fèi)者青睞。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，目前松花菜在我國(guó)的栽培面積與普通花椰菜相當(dāng)，約在300萬(wàn)畝左右。松花菜與普通花椰菜最顯著的差異在于其松大的花球，而花球花梗長(zhǎng)度則是花球松大的重要因素（附圖1）。因此，花球花梗長(zhǎng)度是松花菜商品性的決定因素之一，其遺傳改良是花椰菜遺傳育種的重要課題之一。

目前，花椰菜花梗長(zhǎng)度的遺傳改良主要通過(guò)表型選擇來(lái)完成，該方法必須在花椰菜花球成熟期才能完成，需要耗費(fèi)大量時(shí)間（從播種至選擇完成一般需要3-5個(gè)月）、土地及人力資源，難以開(kāi)展大規(guī)模的材料鑒定和篩選。而分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)則可以通過(guò)對(duì)育種材料目標(biāo)性狀相關(guān)聯(lián)的DNA序列的鑒定來(lái)完成針對(duì)目標(biāo)性狀表型的篩選。這使得育種材料的選擇在苗期甚至種子時(shí)期即可開(kāi)展，大大提高了選擇效率。此外，分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)不受外界環(huán)境的影響，結(jié)果更加穩(wěn)定可靠。目前，分子標(biāo)記在水稻、玉米、番茄等糧食和蔬菜作物中已得到廣泛的應(yīng)用，極大程度上推動(dòng)了這些農(nóng)作物遺傳育種的發(fā)展。其中，單核苷酸多態(tài)性（SNP）由于變異豐富、易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化和高通量等優(yōu)勢(shì)，是最具發(fā)展前景的分子標(biāo)記類型之一。然而，由于花椰菜分子生物學(xué)研究的相對(duì)滯后性，分子標(biāo)記尤其是基于SNP的標(biāo)記輔助選擇在花椰菜育種中極少有實(shí)質(zhì)性的應(yīng)用。因此，開(kāi)發(fā)實(shí)用性強(qiáng)、準(zhǔn)確性高、成本低的與花椰菜花球花梗長(zhǎng)度連鎖的分子標(biāo)記，可以顯著提高花球花梗長(zhǎng)度選擇的效率和準(zhǔn)確性，在花椰菜遺傳育種中極具應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個(gè)目的是：針對(duì)花椰菜傳統(tǒng)育種中的花球花梗長(zhǎng)度選擇完全依賴于表型調(diào)查，需耗費(fèi)大量時(shí)間、土地資源的現(xiàn)狀，開(kāi)發(fā)一種快捷、高效、穩(wěn)定、準(zhǔn)確的分子標(biāo)記輔助選擇花椰菜花球花梗長(zhǎng)度的方法。本發(fā)明第二個(gè)目的是提一種檢測(cè)松花菜花球花梗長(zhǎng)度的特異引物組合。

本發(fā)明的第一個(gè)目的是通過(guò)以下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的：

一種松花菜花球花梗長(zhǎng)度的分子標(biāo)記輔助選擇方法，該方法按如下步驟進(jìn)行：

1）待檢測(cè)材料準(zhǔn)備：將待檢測(cè)的花椰菜材料按照常規(guī)方法播種、育苗，并分單株編號(hào)；于2-3片真葉期取各單株葉片按照常規(guī)CTAB方法分別提取基因組DNA，-20℃保存，備用；

2）待檢測(cè)樣品基因組DNA的PCR擴(kuò)增：利用特異引物組合對(duì)待檢測(cè)樣品的基因組DNA分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，特異引物組合中上游引物：5’- CAAATTTGTTTCGAAGTGATTCT -3’;下游引物 :5'- TGGATGGAGTTCAAATCTTTT -3’；反應(yīng)總體積20μL，具體體系如下：2.5 mmol/L上述引物，0.2 mmol/L dNTPs，1 U Taq酶，2mmol/L MgCl₂，1×擴(kuò)增緩沖液，基因組DNA 50 ng，加dd H₂O至20μL；熱循環(huán)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性2 min，1個(gè)循環(huán)；94℃變性1min，55℃復(fù)性30 s，72℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；4℃保存；

3）PCR產(chǎn)物的酶切反應(yīng)及電泳檢測(cè)：將2）中的PCR產(chǎn)物利用限制性內(nèi)切酶Mae I在37℃條件下酶切3 h，酶切體系含 PCR 產(chǎn)物 7μL， 10×buffer 1μL，1 U Mae I，加dd H₂O至10μL；酶切后將其產(chǎn)物在1.2% 瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分離，溴乙錠顯色；

4）待檢測(cè)樣品花球花梗長(zhǎng)度的鑒定與篩選：依據(jù)3）中凝膠條帶模式，顯示為169bp的樣品視為含有長(zhǎng)花梗位點(diǎn)基因型的材料予以保留，而顯示為135bp的樣品則視為不含長(zhǎng)花梗位點(diǎn)基因型的材料予以剔除；將入選幼苗定植于大田，按照常規(guī)松花菜栽培措施進(jìn)行田間管理；花球成熟時(shí)用游標(biāo)卡尺測(cè)量花球最下部4個(gè)不同分枝方向的花梗長(zhǎng)度，取平均值作為該株的花梗長(zhǎng)度值，淘汰其中花梗長(zhǎng)度達(dá)不到預(yù)期值的短花梗植株，對(duì)花梗長(zhǎng)且其它農(nóng)藝、經(jīng)濟(jì)性狀好的植株予以進(jìn)一步繁殖。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是通過(guò)以下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的：

一種檢測(cè)松花菜花球花梗長(zhǎng)度的特異引物組合，該引物組合中上游引物：5’- CAAATTTGTTTCGAAGTGATTCT -3’;下游引物 :5'- TGGATGGAGTTCA A ATCTTTT -3’。

本發(fā)明的有益效果是：

（1）本發(fā)明提供的分子標(biāo)記可應(yīng)用于花球花梗長(zhǎng)度性狀的輔助選擇，檢測(cè)方便,費(fèi)用低廉。利用本方法在苗期即可對(duì)育種材料進(jìn)行檢測(cè)，從而可在早期淘汰大量不含有長(zhǎng)花梗位點(diǎn)基因型的材料，大幅度減少后期所需的定植、田間管理、表型鑒定的工作量。另外，本發(fā)明中的標(biāo)記是基于SNP開(kāi)發(fā)而來(lái)，這為今后實(shí)現(xiàn)高通量的自動(dòng)化基因型檢測(cè)提供了可能性。

（2）傳統(tǒng)育種方法完全依賴于對(duì)花球花梗長(zhǎng)度的表型調(diào)查進(jìn)行選擇，主觀性強(qiáng)，易受環(huán)境影響，可能存在一定的誤差。利用本方法可直接針對(duì)相應(yīng)位點(diǎn)的基因型進(jìn)行鑒定，可以避免環(huán)境因素等的影響。另外，本方法在分子標(biāo)記檢測(cè)、篩選的基礎(chǔ)上，對(duì)入選材料的目標(biāo)性狀進(jìn)行表型的復(fù)選，大大提高了選擇的準(zhǔn)確性。

附圖說(shuō)明

圖1. 普通花椰菜與松花菜的花球表型差異。

圖2. 本發(fā)明在長(zhǎng)花梗材料和短花梗材料中揭示的SNP。

具體實(shí)施方式

通過(guò)以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。

實(shí)施例1：（花椰菜自交系‘4306-1’和‘4310-2’回交后代的分子標(biāo)記輔助選擇）

花椰菜自交系‘4310-2’農(nóng)藝性狀優(yōu)異，但花球花梗長(zhǎng)度較短；‘4306-1’花球花梗長(zhǎng)度較長(zhǎng)但其他農(nóng)藝性狀一般，可通過(guò)二者雜交和連續(xù)回交對(duì)‘4310-2’的花球花梗長(zhǎng)度性狀進(jìn)行定向改良。本發(fā)明中的特異分子標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物在二者間存在169bp/135bp的多態(tài)性，因此可利用本發(fā)明在回交過(guò)程中進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇。

（1）‘4306-1’和‘4310-2’的雜交和回交：將‘4306-1’和‘4310-2’種子分別播種、育苗、定植于塑料大棚。以‘4306-1’為父本，‘4310-2’為母本開(kāi)花期進(jìn)行人工播蕾雜交，待種莢成熟后收集種子，即為F₁。次年將F₁種子和輪回親本‘4310-2’種子分別播種、育苗、定植于塑料大棚。以F₁為父本，‘4310-2’為母本開(kāi)花期進(jìn)行人工播蕾雜交，待種莢成熟后收集種子（200粒以上），即為BC₁F₁。

（2）BC₁F₁世代苗期分子標(biāo)記輔助選擇：將收集的BC₁F₁世代種子隨機(jī)選取200粒，穴盤(pán)播種，育苗，并分單株編號(hào)。于2-3片真葉期取各單株葉片按照常規(guī)CTAB方法分別提取基因組DNA，-20℃保存，備用。利用引物組合（上游引物：5’- CAAATTTGTTTCGAAGTGATTCT -3’;下游引物 :5'- TGGATGGAGTTCAAATCTTTT -3’）對(duì)上述DNA分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)總體積20μL，具體體系如下：2.5 mmol/L上述引物，0.2 mmol/L dNTPs，1 U Taq酶，2mmol/L MgCl2，1×擴(kuò)增緩沖液，基因組DNA 50 ng，加dd H2O至20μL。熱循環(huán)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性2 min，1個(gè)循環(huán)；94℃變性1min，55℃復(fù)性30 s，72℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；4℃保存。將PCR產(chǎn)物利用限制性內(nèi)切酶MaeI在37℃條件下酶切3 h，酶切體系含 PCR 產(chǎn)物 7μL，10×buffer 1μL，1 U MaeI 酶，加dd H2O至10μL。酶切后將其產(chǎn)物在1.2% 瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分離，溴乙錠顯色。在該BC₁F₁世代中，顯示為169bp的單株視為含有長(zhǎng)花梗位點(diǎn)基因型的材料予以保留，而顯示為135bp的單株則視為不含長(zhǎng)花梗位點(diǎn)基因型的材料予以淘汰。

（3）將入選幼苗定植于大田，按照常規(guī)花椰菜栽培措施進(jìn)行田間管理?；ㄇ虺墒鞎r(shí)用游標(biāo)卡尺測(cè)量花球最下部4個(gè)不同分枝方向的花梗長(zhǎng)度，取平均值作為該株的花梗長(zhǎng)度值，淘汰其中花梗長(zhǎng)度達(dá)不到預(yù)期值的短花梗植株（由分子標(biāo)記與表型之間可能存在的小概率誤差造成），選擇花梗長(zhǎng)且其它農(nóng)藝、經(jīng)濟(jì)性狀最接近輪回親本‘4310-2’的植株進(jìn)一步與輪回親本‘4310-2’雜交，獲得BC₂F₁世代。

（4）后續(xù)回交世代的選擇：對(duì)獲得的BC₂F₁世代按照上述第（2）、（3）步驟進(jìn)行選擇，進(jìn)而回交獲得BC₃F₁世代；并以同樣方法進(jìn)行選擇和回交直至BC₆F₁世代，再對(duì)其進(jìn)行自交，獲得遺傳穩(wěn)定的BC₆F₂世代，即為花球花梗長(zhǎng)度得到明顯改良的‘4310-2’。

實(shí)施例2：（松花菜品種‘慶農(nóng)65天’自交分離后代的分子標(biāo)記輔助選擇）

（1）‘慶農(nóng)65天’自交F₂世代的獲得：將‘慶農(nóng)65天’種子播種、育苗、定植于塑料大棚。于開(kāi)花期進(jìn)行人工播蕾自交，待種莢成熟后收集種子，即為F₂世代。

（2）F₂世代苗期分子標(biāo)記輔助選擇：將收集的F₂世代種子隨機(jī)選取500粒，穴盤(pán)播種，育苗，并分單株編號(hào)。于2-3片真葉期取各單株葉片按照常規(guī)CTAB方法分別提取基因組DNA，-20℃保存，備用。利用引物組合（上游引物：5’- CAAATTTGTTTCGAAGTGATTCT -3’;下游引物 :5'- TGGATGGAGTTCA AATCTTTT -3’）對(duì)上述DNA分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)總體積20μL，具體體系如下：2.5 mmol/L上述引物，0.2 mmol/L dNTPs，1 U Taq酶，2mmol/L MgCl2，1×擴(kuò)增緩沖液，基因組DNA 50 ng，加dd H₂O至20μL。熱循環(huán)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性2 min，1個(gè)循環(huán)；94℃變性1min，55℃復(fù)性30 s，72℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；4℃保存。將PCR產(chǎn)物利用限制性內(nèi)切酶MaeI在37℃條件下酶切3 h，酶切體系含 PCR 產(chǎn)物 7μL，10×buffer 1μL，1 U MaeI 酶，加dd H₂O至10μL。酶切后將其產(chǎn)物在1.2% 瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分離，溴乙錠顯色。在該F₂世代中，顯示為169bp的單株視為含有長(zhǎng)花梗位點(diǎn)基因型的材料予以保留，而顯示為135bp的單株則視為不含長(zhǎng)花梗位點(diǎn)基因型的材料予以淘汰。

（3）將入選幼苗定植于大田，按照常規(guī)花椰菜栽培措施進(jìn)行田間管理。花球成熟時(shí)用游標(biāo)卡尺測(cè)量花球最下部4個(gè)不同分枝方向的花梗長(zhǎng)度，取平均值作為該株的花梗長(zhǎng)度值，淘汰其中花梗長(zhǎng)度達(dá)不到預(yù)期值的短花梗植株（由分子標(biāo)記與表型之間可能存在的小概率誤差造成），對(duì)花梗長(zhǎng)且其它農(nóng)藝、經(jīng)濟(jì)性狀好的植株予以進(jìn)一步自交，獲得F₃世代。

（4）后續(xù)自交世代的選擇：對(duì)獲得的F₃世代按照上述第（2）、（3）步驟進(jìn)行選擇，進(jìn)而自交獲得F₄世代；并以同樣方法進(jìn)行選擇和自交直至F₆世代，即獲得了遺傳穩(wěn)定、花球花梗長(zhǎng)且其他農(nóng)藝、經(jīng)濟(jì)性狀優(yōu)異的新材料。

（5）分子標(biāo)記輔助選擇的結(jié)果分析：在本實(shí)施例中，各世代通過(guò)分子標(biāo)記鑒定后入選的單株達(dá)到花球花梗長(zhǎng)度要求的比例均達(dá)到80%以上，表明本發(fā)明中的特異分子標(biāo)記對(duì)花球花梗長(zhǎng)度性狀的輔助選擇效果良好，可以在早期淘汰大量花球花梗長(zhǎng)度不達(dá)標(biāo)的單株，有效提高選擇效率。在此基礎(chǔ)上，我們通過(guò)花球花梗長(zhǎng)度表型復(fù)選來(lái)彌補(bǔ)分子標(biāo)記選擇的少量誤差，并配合其他農(nóng)藝、經(jīng)濟(jì)性狀的選擇，獲得了2份綜合表現(xiàn)優(yōu)異的純合育種材料。

<110>浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院

<120>一種花椰菜花球花梗長(zhǎng)度的分子標(biāo)記輔助選擇方法

<160>2

<210>1

<211>23

<212>DNA

<213>人工合成

<400>1

CAAATTTGTT TCGAAGTGAT TCT 23

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>人工合成

<400>2

TGGATGGAGT TCAAATCTTT T 21