本發(fā)明涉及抗原表位肽，尤其涉及具有免疫保護性的金黃色葡萄球菌FnBPA-A蛋白的模擬表位肽、模擬表位肽組合物及其在制備金黃色葡萄球菌多表位疫苗中的應用。
背景技術：
金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)是一種重要的人獸共患病原菌，不僅可引起人類多種疾病，而且常引起臨床型和隱性奶牛乳腺炎。長期以來，由于獸醫(yī)臨床上不合理使用抗生素，誘導動物源性耐甲氧西林金黃色葡萄球菌菌株不斷出現(xiàn)，不僅導致藥物防治奶牛乳腺炎十分困難，給奶牛業(yè)帶來嚴重危害，而且影響乳及乳制品的品質與安全以及人類健康。因此，選擇合適的靶抗原研制新型金黃色葡萄球菌疫苗是免疫預防奶牛乳腺炎的研究重點。
然而，如何獲得合適的疫苗靶抗原及其表位研制新型金黃色葡萄球菌多表位疫苗則一直是本領域技術人員所努力解決的技術難題。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的之一是提供一種具有免疫保護性的金黃色葡萄球菌FnBPA-A蛋白的模擬表位肽。
為達到上述目的，本發(fā)明采用的技術方案之一如下：
一種具有免疫保護性的金黃色葡萄球菌FnBPA-A蛋白模擬表位肽，所述模擬表位肽是由12個氨基酸殘基構成的短肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示：
SEQ ID NO:1：His-Thr-Glu-Gln-Gly-Thr-Leu-Phe-Leu-Lys-Met-Pro；
SEQ ID NO:2：Ser-Tyr-Phe-Asp-Ala-Leu-Glu-Arg-Met-Lys-Pro-Gly。
進一步的，編碼氨基酸序列如SEQ ID NO:1的所述模擬表位肽的核苷酸序列SEQ ID NO:3所示，編碼氨基酸序列如SEQ ID NO:2的所述模擬表位肽的核苷酸序列SEQ ID NO:4所示：
SEQ ID NO:3：cat acg gag cag ggg act ttg ttt ttg aag atg ccg；
SEQ ID NO:4：agt tat ttt gat gcg ctt gag agg atg ttg ccg ggg。
需要說明的是，所述的模擬表位肽可采用常規(guī)方法人工合成，也可以利用基因工程技術構建重組表達質粒，誘導表達獲得。因此，含有所述的核苷酸序列的重組表達質粒以及含有所述重組表達質粒的宿主細胞也屬于本發(fā)明的創(chuàng)新部分。
本發(fā)明的目的之二是提供一種含有前述具有免疫保護性的金黃色葡萄球菌FnBPA-A蛋白模擬表位肽的組合物，該組合物由SEQ ID NO:1所示多肽和SEQ ID NO:2所示多肽按2:1的質量比組合獲得。
與本發(fā)明的目的之二相對應的，本發(fā)明還提供了一種含有前述具有免疫保護性的金黃色葡萄球菌FnBPA-A蛋白模擬表位肽的模擬表位串聯(lián)肽，該模擬表位串聯(lián)肽為采用基因工程技術將SEQ ID NO:1所示多肽和SEQ ID NO:2所示多肽進行串聯(lián)表達獲得，串聯(lián)方式為：SEQ ID NO:1所示多肽-丙氨酸丙氨酸酪氨酸接頭-SEQ ID NO:1所示多肽-丙氨酸丙氨酸酪氨酸接頭-SEQ ID NO:2所示多肽。
進一步的，編碼前述免疫保護性模擬表位串聯(lián)肽的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示：
SEQ ID NO:5：cat acg gag cag ggg act ttg ttt ttg aag atg ccg gcc gcc tac cat acg gag cag ggg act ttg ttt ttg aag atg ccg gcc gcc tac agt tat ttt gat gcg ctt gag agg atg ttg ccg ggg。
本發(fā)明的目的之三是提供一種前述具有免疫保護性的金黃色葡萄球菌FnBPA-A蛋白模擬表位肽在制備金黃色葡萄球菌多表位疫苗中的應用。
同樣的，本發(fā)明還提供了一種前述具有免疫保護性的金黃色葡萄球菌FnBPA-A蛋白模擬表位肽組合物在制備金黃色葡萄球菌多表位疫苗中的應用。
本發(fā)明還提供了一種前述具有免疫保護性的金黃色葡萄球菌FnBPA-A蛋白模擬表位肽的模擬表位串聯(lián)肽，在制備金黃色葡萄球菌多表位疫苗中的應用。
本發(fā)明的目的之四是提供一種金黃色葡萄球菌多表位疫苗，該多表位疫苗中含有具有免疫保護性的金黃色葡萄球菌FnBPA-A蛋白模擬表位肽，從而該多表位疫苗能夠有效預防金黃色葡萄球菌引起的奶牛乳腺炎。
最后，本發(fā)明還提供了一種具有免疫保護性的金黃色葡萄球菌FnBPA-A蛋白模擬表位肽的篩選方法，包括以下步驟：
S1、以rFnBPA-A純化蛋白為免疫原，制備兔抗FnBPA-A抗體；所述兔抗FnBPA-A抗體的制備過程為：將濃度為1mg/mL的rFnBPA-A純化蛋白和Tween-80混勻作為水相，再加入司本白油并在漩渦振蕩器上反復震蕩乳化，所述rFnBPA-A純化蛋白、Tween-80、司本白油的體積比為1:0.042:3.126；接著于實驗兔的頸部、背部皮下多點注射乳化好的免疫原，免疫劑量為1mg/只，一免后第14天進行二免，二免劑量和免疫途徑同一免，二免后第10天進行三免，三免無免疫佐劑，三免劑量和免疫途徑與一免相同；于三免后32天采集兔血并分離得到兔血清以獲得所述兔抗FnBPA-A抗體；
S2、所述兔抗FnBPA-A抗體的純化：采用硫酸銨分級沉淀法粗提取所述兔血清中的IgG，經透析除鹽后使用Protein G親和層析柱純化IgG以獲得純化的兔抗FnBPA-A抗體；
S3、利用所述純化的兔抗FnBPA-A抗體對噬菌體隨機十二肽庫進行親和淘選，淘選使用的所述噬菌體隨機十二肽庫試劑盒的庫容量為2.7×109、滴度為1.5×1013/μL、Escherichia coli ER2537為肽庫的宿主菌；所述淘選過程為：用0.1mol/L、pH8.6的NaHCO3溶液將純化后的兔抗FnBPA-A抗體稀釋至100μg/mL，包被酶標孔，4℃過夜；次日，用TBST洗滌液洗滌6次，再加入5％BSA封閉液，37℃封閉1h，所述TBST洗滌液中含0.5％Tween-20；之后棄封閉液，將原始肽庫、TBST洗滌液、純化后的陰性血清以10:195:195體積比混勻后按照100μL/孔加入酶標孔，溫和震蕩1h；再棄酶標孔內液體，使用TBST洗滌液洗滌6次后用0.2mol/L、pH2.2的甘氨酸-HCl洗脫緩沖液洗脫與兔抗FnBPA-A抗體特異性結合的噬菌體，并加入1mol/L、pH9.1的Tris-HCl緩沖液中和；取5μL所述洗脫緩沖液進行噬菌體滴度測定，其余噬菌體侵染宿主菌E.coli ER2738進行擴增，用于下一輪淘選，共進行四輪淘選以獲得親和力更高的特異性噬菌體陽性克?。凰妮喬赃x過程中逐輪降低純化后的兔抗FnBPA-A抗體稀釋濃度、逐輪增加所述TBST洗滌液中Tween-20的濃度，其中第四輪淘選中所述純化后的兔抗FnBPA-A抗體稀釋濃度為50μg/mL，第四輪淘選中所述TBST洗滌液中Tween-20的濃度增加到0.5％；
S4、所述特異性噬菌體陽性克隆DNA測序以及表位肽分析：使用噬菌體DNA單鏈提取試劑盒提取所述特異性噬菌體陽性克隆的單鏈DNA，并對所述單鏈DNA樣品進行DNA測序，根據所述單鏈DNA樣品中攜帶的外源基因序列，推導出展示于噬菌體表面的FnBPA-A蛋白模擬表位肽序列。
本發(fā)明的有益效果如下：
1)纖連蛋白結合蛋白A(Fibronectin-binding proteins A，F(xiàn)nBPA)是幾乎所有金黃色葡萄球菌臨床分離株產生的高度保守的黏附素蛋白，該蛋白能與存在于血漿、體液和胞外基質中的纖維蛋白特異性結合，從而使細菌有效地黏附于宿主組織中，引起感染發(fā)生。研究表明FnBPA蛋白結構中包括A、B、C、D四個功能區(qū)，其中A區(qū)不僅是該蛋白的主要黏附功能域，可與纖維蛋白發(fā)生特異性結合，在感染建立的初始階段發(fā)揮重要作用，而且FnBPA-A蛋白誘導機體產生的抗體可抵抗金黃色葡萄球菌感染。因此，F(xiàn)nBPA-A是研制金黃色葡萄球菌疫苗的理想靶抗原之一。
本發(fā)明創(chuàng)造性的選擇了金黃色葡萄球菌FnBPA-A蛋白模擬表位肽作為解決前述技術問題的切入點，為最終解決技術問題提供了良好的基礎。
2)金黃色葡萄球菌致病因子眾多且致病機制復雜，以單一保護性抗原制備疫苗，其所誘導的免疫保護作用有限，這就需要將多個保護性抗原嵌合表達制備亞單位嵌合疫苗。然而，由于表達載體容量有限，使得構建亞單位嵌合疫苗的抗原數(shù)量受到限制、甚至出現(xiàn)嵌合蛋白表達量低或不表達等問題。然而，表位(epitope)是抗原發(fā)揮作用的關鍵片段，將多種抗原的保護性表位串聯(lián)構建而成的多表位疫苗既能夠排除整個蛋白分子中免疫無關成分或免疫耐受成分，誘導出較完整蛋白更有效的免疫保護性應答，又能克服表達載體對多種抗原嵌合表達的容量限制。
因此，本發(fā)明提供了含有具有免疫保護性的金黃色葡萄球菌FnBPA-A蛋白模擬表位肽的模擬表位串聯(lián)肽，從而更進一步的提高了疫苗的免疫保護作用
3)制備多表位疫苗的首要環(huán)節(jié)是鑒定出具有免疫保護性的表位或模擬表位，而噬菌體展示技術為研究表位提供了的有效手段。噬菌體展示技術篩選鑒定表位的原理是以純化的單克隆或多克隆抗體為靶分子，生物淘選噬菌體隨機肽庫，即可篩選出特異性抗體的結合肽，將該結合肽與天然抗原序列進行比較，發(fā)現(xiàn)其中有的是與天然抗原序列完全相同的線性表位；另一些則是與天然抗原序列不相同或不完全相同但功能相似的模擬表位肽。因此，本發(fā)明利用噬菌體展示技術結合動物免疫保護性試驗開展了金黃色葡萄球菌FnBPA-A蛋白的免疫保護性模擬表位肽的篩選與鑒定工作，為進一步開發(fā)預防奶牛乳腺炎的金黃色葡萄球菌多表位疫苗奠定基礎。
4)為進一步說明本發(fā)明的優(yōu)點，現(xiàn)對本發(fā)明的技術途徑和技術效果描述如下：
首先，本發(fā)明用純化的rFnBPA-A蛋白(本實驗室制備)為免疫原，制備兔抗rFnBPA-A蛋白抗體。通過飽和硫酸銨分級沉淀結合Protein G親和層析柱對抗體進行純化。經核酸蛋白測定儀測得純化抗體的濃度約為2.5mg/mL，SDS-PAGE分析其純度約為95％，間接ELISA方法檢測其效價大于1:838860800。該純化抗體滿足作為靶分子淘選噬菌體隨機十二肽庫的條件。
然后，本發(fā)明以純化的抗rFnBPA-A抗體為靶分子對噬菌體隨機十二肽庫進行親和淘選。在親和淘選過程中逐輪降低抗體包被濃度(從100μg/mL降至50μg/mL)和逐漸加大洗脫液中Tween-20濃度(從0.1％增加到0.5％),經過4輪淘選和ELISA鑒定獲得8個噬菌體陽性克隆。測序與序列分析顯示，8個噬菌體陽性克隆共展示6種不同的12肽序列(分別命名為P1、P2、P3、P4、P5、P6)，由于這6個展示表位肽序列與FnBPA-A蛋白序列均無一級結構同源性(Score<50)，確定它們?yōu)榻瘘S色葡萄球菌FnBPA-A蛋白的模擬表位，并通過肽ELISA進一步驗證了這6個模擬表位肽的確能夠模擬FnBPA-A蛋白與抗rFnBPA-A抗體發(fā)生特異性結合反應。
本發(fā)明進一步通過間接ELISA方法和免疫保護性試驗檢測小鼠免疫6個模擬表位肽后血清抗體產生水平和攻毒后免疫保護率，結果發(fā)現(xiàn)6個模擬表位肽均能刺激機體產生不同水平的特異性抗體，但只有模擬表位肽P1和P2具有一定程度的免疫保護性，它們對免疫小鼠的免疫保護率分別為25％和50％，并且P1與P2按2:1質量比混合的多肽組合物對黃色葡萄球菌感染小鼠的免疫保護效果高于FnBPA-A全蛋白，免疫保護率高達75％。因此，本發(fā)明中的免疫保護性模擬表位肽P1和P2及其組合物可作為有效成分，進一步用于多表位疫苗的開發(fā)，具有良好的應用前景。
附圖說明
圖1肽ELISA對模擬表位肽的驗證。
圖1顯示6個模擬表位肽與抗rFnBPA-A抗體反應的平均OD492nm值均大于其與陰性血清反應的平均OD492nm值的2.1倍，而與His標簽抗體反應孔的平均OD492nm值均小于其與兔陰性血清反應孔平均OD492nm值的2.1倍。說明這些模擬表位肽均能模擬FnBPA-A蛋白，與抗FnBPA-A抗體發(fā)生特異性結合反應。
具體實施方式
為了便于理解,以下將通過具體的實施例和附圖對本發(fā)明進行詳細地描述。需特別指出的是，這些描述僅僅是示例性的描述，并不構成對本發(fā)明范圍的限制。
下述說明中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；實驗方法中的所述試劑和生物材料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。
下述說明中的百分含量，如無特別說明，均為質量百分含量。
下述說明中的比例，如無特別說明，均為體積比例。
實施例1：兔抗FnBPA-A蛋白抗體的制備與純化
1.1抗體制備
將1mL濃度為1mg/mL的rFnBPA-A純化蛋白(本實驗室制備)和42μL Tween-80混勻作為水相，再加入3126μL司本白油并在漩渦振蕩器上反復震蕩乳化。于實驗兔的頸、背部皮下多點注射乳化好的免疫原，免疫劑量為1mg/只。一免后第14天進行二免，免疫劑量和免疫途徑同一免。二免后第10天進行三免，三免時不加免疫佐劑，免疫劑量和免疫途徑與一免相同。分別于免疫前和免疫后第32天采集兔血、分離血清，以20μg/mL rFnBP-A蛋白液為包被抗原，1:5000羊抗兔HRP-IgG為二抗，采用間接ELISA方法檢測免疫血清中抗FnBPA-A抗體的效價為1:209715200。
1.2抗體純化
采用飽和硫酸銨分級沉淀法粗提免疫兔血清中IgG，經透析除鹽后，再使用Protein G親和層析柱純化IgG。經核酸蛋白測定儀測得純化抗體的濃度約為2.5mg/mL，SDS-PAGE分析其純度約為95％，間接ELISA方法檢測其效價大于1:838860800。
結論：制備與純化的兔抗FnBPA-A抗體可作為靶分子淘選噬菌體十二肽庫。
實例2：FnBPA-A蛋白的抗原表位篩選與鑒定
2.1用兔抗FnBPA-A純化抗體對噬菌體隨機十二肽庫進行淘選
噬菌體隨機十二肽庫試劑盒購自NEB公司，其中庫容量為2.7×109個轉化子，滴度為1.5×1013pfu/μL,Escherichia coli ER2537為肽庫的宿主菌。按試劑盒說明書進行淘選，簡要過程如下:用0.1mol/L pH8.6 NaHCO3溶液將純化后的兔抗FnBPA-A抗體稀釋至100μg/mL，包被96孔板，4℃過夜。次日，用TBST溶液(TBS+0.5％Tween-20)洗滌6次，加入5％BSA，37℃封閉1h。棄封閉液，將10μL原始肽庫(1.0×1011PFU)、195μL TBST及195μL純化后的陰性血清混勻后加入酶標孔，100μL/孔，溫和震蕩1h。棄孔內液體，TBST洗滌6次，用pH2.2，0.2mol/L甘氨酸-HCl洗脫緩沖液洗脫與抗FnBPA-A抗體特異性結合的噬菌體，并加入1mol/L pH9.1Tris-HCl緩沖液中和。取5μL洗脫液進行噬菌體滴度測定，其余噬菌體侵染E.coli ER2738進行擴增，用于下一輪淘選，共進行四輪淘選。為了獲得高親和力的特異性噬菌體，在四輪淘選過程中逐輪降低抗體濃度(從100μg/mL降至50μg/mL)，增加洗滌液中Tween-20的濃度(從0.1％增加到0.5％)，結果發(fā)現(xiàn)，噬菌體的投入與產出比逐輪升高，依次為1.8×10-5、1.9×10-4、6.5×10-4和8.9×10-3，特異性噬菌體克隆得到富集，第2、3和4輪淘選的富集倍數(shù)分別達到11、36和494倍。
2.2與抗FnBPA-A抗體特異性結合的噬菌體陽性克隆鑒定
隨機挑選第四輪淘選后的25個噬菌體克隆進行夾心ELISA初步鑒定。即用濃度為100μg/mL的兔抗FnBPA-A抗體包被酶標板，4℃過夜。次日棄包被液，加入5％BSA，37℃封閉1h；倒掉封閉液，用TBST溶液洗滌6次。加入待檢噬菌體克隆，108PFU/孔，每個克隆做3個重復，37℃作用2h，實驗中設置空白對照(用PBS代替待檢噬菌體克隆)和陰性對照(加原肽庫中的M13噬菌體)。TBST洗滌6次，加入1:5000HRP標記鼠抗-M13抗體，37℃作用1h。此后，按洗滌、顯色、終止、測定OD492nm的常規(guī)方法操作。結果有18個待檢克隆的平均OD492nm值大于原始肽庫噬菌體陰性對照平均OD492nm值的2.1倍，初步認為它們?yōu)槭删w陽性克隆。
采用競爭抑制ELISA法對18個初篩噬菌體陽性克隆進一步鑒定。即用濃度為100μg/mL的兔抗FnBPA-A抗體包被酶標板，每個待鑒定克隆包被一排酶標孔，4℃過夜。次日棄包被液，封閉、洗滌同上。分別將不同濃度(12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL和200μg/mL)的競爭物(包括rFnBPA-A蛋白及His標簽蛋白)分別與初篩陽性噬菌體克隆(5.0×109PFU)等體積混合，取混合液分別加到抗體包被孔中，100μL/孔，37℃作用1h，TBST洗滌6次，余下步驟同上。試驗中同時做未加競爭物的初篩陽性噬菌體克隆對照(即用PBS代替競爭物與噬菌體克隆等體積混合)。根據公式計算抑制率，抑制率(％)＝(未抑制OD492nm值－抑制后OD492nm值)/未抑制OD492nm值×100％。結果如表1所示，隨著rFnBPA-A蛋白濃度的增加，其對C2、C8、C10、C11、C15、C19、C21和C23 8個初篩噬菌體克隆的競爭抑制率逐漸增加。當rFnBPA-A蛋白的濃度為200μg/mL時，對8個噬菌體克隆的競爭抑制率均大于50％，而相同濃度的游離His標簽蛋白競爭物對上述8個噬菌體克隆的抑制率均低于20％，說明這8個噬菌體克隆為與rFnBPA-A抗體特異性結合的噬菌體陽性克隆。
表1不同濃度的競爭蛋白對噬菌體克隆的抑制率
2.3噬菌體陽性克隆DNA測序及其表面展示的表位肽分析
使用噬菌體DNA單鏈提取試劑盒(購自美國Omega公司)提取陽性噬菌體克隆的單鏈DNA，并委托上海英濰捷基生物技術有限公司對單鏈DNA樣品進行測序。根據陽性噬菌體單鏈DNA中攜帶的外源基因序列，推導出展示于噬菌體表面的表位肽序列。結果如表2所示，8個噬菌體陽性克隆共展示6種不同的12肽序列，其中克隆C8、C11和C21展示相同肽序列(命名為P3)，另外5個克隆(C19、C23、C2、C10、C15)分別展示不同的肽序列(分別命名為P1、P2、P4、P5、P6)。將6個展示表位肽序列分別與GenBank收錄的FnBPA-A蛋白序列進行比對分析，由表3可見，它們與FnBPA-A蛋白均無一級結構同源性(Score<50)，表明這6個展示肽均為FnBPA-A蛋白的模擬表位。
表2噬菌體陽性克隆展示肽序列
表3展示肽序列與FnBPA-A蛋白序列的比對結果
2.4模擬表位肽的肽ELISA驗證
委托上海淘普技術有限公司采用固相合成法合成上述6個FnBPA-A蛋白的模擬表位肽(要求其純度大于98％)，采用肽ELISA對其進行驗證。簡要過程如下:用濃度為40μg/mL的合成模擬表位肽包被酶標孔，4℃包被過夜。棄包被液，加入5％BSA封閉液，37℃封閉2h，0.5％PBST洗滌6次。加入1:200倍稀釋的兔抗FnBPA-A抗體，同時做陰性血清對照以及1:200倍稀釋的兔抗His標簽蛋白抗體對照，37℃反應1h，0.5％PBST洗滌6次，加入1:5000HRP-羊抗兔，37℃孵育1h，0.5％PBST洗6次。加鄰苯二胺底物溶液，室溫避光作用10min，加入終止液，測定OD492nm值。若抗FnBPA-A抗體反應孔的OD492nm值大于與陰性血清反應孔2.1倍，同時兔抗His標簽蛋白抗體反應孔OD492nm值小于陰性血清2.1倍，則判肽ELISA反應為陽性，即FnBPA-A抗體能夠識別模擬表位。結果如圖1所示，6個模擬表位肽與rFnBPA-A抗體反應的平均OD492nm值均大于其與陰性血清反應的平均OD492nm值的2.1倍，而與His標簽抗體反應孔的平均OD492nm值均小于其與兔陰性血清反應孔平均OD492nm值的2.1倍。說明這些模擬表位肽與rFnBPA-A抗體的結合反應是特異性的，它們模擬了金黃色葡萄球菌FnBPA-A蛋白的免疫反應性。
結論：利用噬菌體展示技術篩選和鑒定到6個FnBPA-A蛋白的模擬表位。
實例3：FnBPA-A蛋白模擬表位的免疫活性檢測
3.1實驗小鼠的免疫與模擬表位肽的免疫原性檢測
體重為18-20g的昆明系小鼠隨機分成12組，每組20只。第1組為rFnBPA-A蛋白免疫組；第2組為噬菌體M13免疫組；3-8組分別為C2、C8、C10、C15、C19和C23陽性噬菌體克隆免疫組；9-11組為模擬表位肽P1與P2不同比列混合組；第12組為生理鹽水對照組。rFnBPA-A蛋白免疫組小鼠注射弗氏佐劑乳化后的rFnBPA-A蛋白，30μg/只；陽性噬菌體克隆免疫組小鼠注射噬菌體克隆，1×1012pfu/只；模擬表位肽混合組小鼠注射弗氏佐劑乳化后的混合肽(P1與P2分別按質量比1:1、1:2和2:1配比)，30μg/只；對照組小鼠則注射生理鹽水，100μL/只。首免后14d和24d各加強免疫一次，免疫劑量同首免。免疫后第34d從小鼠眼球靜脈叢采血，5只/組，分離血清，采用間接ELISA檢測各免疫組抗體產生水平。結果如表4所示，展示的6個模擬表位肽均能刺激機體產生特異性抗體，表明它們具有免疫原性，且以P1和P2的免疫原性較好。
表4免疫后第34d各免疫組小鼠血清中的抗體效價
3.2模擬表位肽的免疫保護性檢測
免疫后第35d對各實驗組小鼠進行攻毒試驗。即以最小致死量(6.25×106CFU/mL)的金黃色葡萄球菌WWGSP-30分離株腹腔注射免疫小鼠，15只/組，0.5mL/只，同時以未免疫小鼠腹腔感染等量菌液作為對照。注射后觀察7天，記錄小鼠存活情況，計算免疫保護率：[免疫保護率＝(1-免疫組死亡率/對照組死亡率)×100％]。對死亡小鼠進行剖檢，觀察其病理變化，并無菌采取肝臟再次分離細菌。結果如表5所示，噬菌體M13免疫組、陽性噬菌體克隆C2、C8、C10和C15免疫組的小鼠全部死亡；陽性噬菌體克隆C19(展示模擬表位肽P1)和C23(展示模擬表位肽P2)免疫組小鼠的免疫保護率分別為25％和50％；模擬表位肽P1與P2以1:1、1:2和2:1質量比混合免疫組小鼠的免疫保護率分別為31.25％、18.75％和75％。死亡小鼠眼觀病變?yōu)檠鄄坑袧庵虺鲅?，鼻部和爪尖出血；剖檢病變?yōu)榉尾砍鲅①|地變脆，脾臟壞死，腹腔積液；使用金黃色葡萄球菌Baird-Paker選擇培養(yǎng)基從肝臟中再次分離到金黃色葡萄球菌。
表5模擬表位肽的免疫保護性
結論：通過動物免疫后的抗體檢測與攻毒試驗確定表2中6個FnBPA-A蛋白的模擬表位肽均具有免疫原性，但只有P1和P2為具有免疫保護性的模擬表位肽，P1和P2按質量比2:1的組合物的免疫保護效果顯著的好于單一免疫保護性模擬表位肽和FnBPA-A蛋白。