本發(fā)明屬于農業(yè)微生物領域，具體涉及一種具有降解無機磷和抑菌雙重功能的解淀粉芽孢桿菌，以及含有該解淀粉芽孢桿菌的微生物菌劑，還涉及它們在促進作物生長和防病方面的應用。
背景技術：
：磷是植物生長過程中必需的營養(yǎng)元素之一。我國土壤中總磷含量相當可觀，但95％以上是以穩(wěn)定的鋁硅酸鹽和磷灰石等無效磷形式存在，植物很難直接吸收利用。因此絕大多數農作物都要追施磷肥。目前施用的速效磷肥生產成本高、能耗大，施入的磷肥當年利用率僅為10％～25％，其中一部分磷肥隨雨水流入江河湖泊，造成水體的富營養(yǎng)化，引起水質污染；另一部分磷與土壤中的Ca2+、Fe2+、Fe3+、Al3+等結合，形成難溶性磷酸鹽，植物無法吸收利用，并帶來一系列如土壤板結，污染環(huán)境，生物多樣性遭到破壞等問題。因此，提高有效磷在土壤中的含量，促進作物吸收磷元素，從而增加作物產量是農業(yè)生產上亟待解決的問題。影響土壤中有效磷含量的因素很多，其中微生物對土壤磷的利用率、土壤磷的轉化和有效性影響很大，并且微生物本身具有無毒無害、不污染環(huán)境、成本低、節(jié)約能源等優(yōu)點，因此，應用微生物改變磷的固定方式是提高土壤中有效磷含量的有效途徑，該類細菌大部分以芽孢桿菌為主，不僅可以降解難溶性磷，而且具有防治作物病害的功能。為進一步提高磷肥的當季利用率，減少土壤對磷酸鹽的吸附固定，充分發(fā)揮難溶性磷酸鹽的潛力，使其能為作物吸收利用，保證農業(yè)的增產、高產、穩(wěn)產，應篩選并研制具有肥效功能和防病功能的微生物菌劑。技術實現要素：本發(fā)明目的在于提供一種具有降解無機磷和抑菌雙重作用的解淀粉芽孢桿菌菌株，該菌株降解無機磷能力強，并且具有高效抑菌活性和抑菌譜廣等優(yōu)點。本發(fā)明另一目的在于提供一種微生物菌劑。本發(fā)明第三目的在于提供上述微生物菌劑的制備方法。本發(fā)明第四目的在于提供上述解淀粉芽孢桿菌在降解無機磷上的用途。本發(fā)明第五目的在于提供上述解淀粉芽孢桿菌在促進作物生長上的用途。本發(fā)明第五目的在于提供上述解淀粉芽孢桿菌在防治棉花病害上的用途。本發(fā)明第六目的在于提供上述微生物菌劑在降解無機磷上的用途。本發(fā)明第七目的在于提供上述微生物菌劑在促進作物生長上的用途。本發(fā)明第八目的在于提供上述微生物菌劑在防治棉花病害上的用途。本發(fā)明通過以下技術方案實現：本發(fā)明提供了一種解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)菌株PHODB35，該菌株已于2016年9月26日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(保藏地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所)，保藏編號為CGMCCNo.13040。本發(fā)明還提供了利用上述解淀粉芽孢桿菌PHODB35生產的微生物菌劑，其活性成分為解淀粉芽孢桿菌PHODB35菌體。上述微生物菌劑可以為液體制劑。上述微生物菌劑的制備方法，包括如下步驟：(1)菌種活化：將低溫保存的PHODB35菌株在LB平板培養(yǎng)基上活化，挑取單菌落在LB斜面培養(yǎng)基上，在25～35℃培養(yǎng)10～16小時，得活化的菌株；(2)種子液制備：用無菌的接種環(huán)刮取一環(huán)步驟(1)活化的菌株接種到100mLLB液體培養(yǎng)基中，在25～35℃、搖床轉速為150～220rpm的條件下培養(yǎng)10～16小時，得種子液；(3)發(fā)酵培養(yǎng)：按照體積比為1～3％的比例將步驟(2)的種子液接入到玉米粉黃豆粉培養(yǎng)基(pH值為7.2)中，在溫度為25～35℃、搖床轉速為150～220rpm的條件下發(fā)酵培養(yǎng)30～40h，得發(fā)酵液；(4)檢測發(fā)酵液中菌體和芽胞數量，待發(fā)酵液中成熟芽胞占到芽胞和菌體總數的90％時停止發(fā)酵培養(yǎng)；所得即為PHODB35菌株的液體制劑。所述的LB平板培養(yǎng)基、LB斜面培養(yǎng)基和LB液體培養(yǎng)基均按照常規(guī)方法制備。上述制備方法步驟(1)中所述的LB平板培養(yǎng)基或LB斜面培養(yǎng)基的組成成分及其重量比為：胰蛋白胨8～12g，酵母提取物4～6g，氯化鈉4～6g，瓊脂粉12～18g，水1000mL。上述制備方法步驟(2)中所述的LB液體培養(yǎng)基的組成成分及其重量比為：胰蛋白胨8～12g，酵母提取物4～6g，氯化鈉4～6g，水1000mL。上述制備方法步驟(3)中所述的玉米粉黃豆粉培養(yǎng)基，其組成成分及其重量百分比為：玉米粉1.0～3.0％，黃豆粉1.0～3.0％，NaCl0.1～1.0％，MnSO4·H2O0.5～1.0％，其余為水。所述的玉米粉黃豆粉培養(yǎng)基的制備方法，按照重量百分比將玉米粉、黃豆粉、NaCl和MnSO4·H2O混合，再加水，調節(jié)pH攪拌均勻即可。上述微生物菌劑，其解淀粉芽孢桿菌PHODB35的活菌數大于2.5×108CFU/mL。所述的解淀粉芽孢桿菌PHODB35在降解無機磷上的應用。所述的解淀粉芽孢桿菌PHODB35在促進作物生長上的應用。所述的解淀粉芽孢桿菌PHODB35在防治棉花病害上的應用。上述應用中所述的棉花病害是指棉花黃萎菌(V.dahliae)、棉花枯萎菌(F.oxysporum)或棉花立枯菌(R.solani)等。上述微生物菌劑在降解無機磷上的應用。上述微生物菌劑在促進作物生長上的應用。上述微生物菌劑在防治棉花病害上的應用。上述應用中所述的棉花病害是指棉花黃萎菌(V.dahliae)、棉花枯萎菌(F.oxysporum)或棉花立枯菌(R.solani)等。上述微生物菌劑的使用方法：用水將上述所得微生物菌劑稀釋至活菌體數為107CFU/mL，于番茄移栽定植后進行灌根即可。PHODB35菌株的篩選分離過程2015年1月河北省農林科學院植物保護研究所從河北省容城縣容城鎮(zhèn)東牛東莊番茄大棚五點采集土樣，稱取1.0g風干土樣加入帶滅菌玻璃珠的三角瓶中，再加入100mL無菌水，靜置20min，在搖床上30℃、180r/min充分振蕩30min后，然后按10倍稀釋法進行梯度稀釋，分別取10-3，10-4，10-5的稀釋液100μL，涂布于解無機磷培養(yǎng)基上，每個濃度3個重復。涂好后在潔凈臺中靜置5-10min，待菌液吸附進培養(yǎng)基內，于35℃恒溫培養(yǎng)5-7d。并以透明圈法、鉬銻抗比色法、平板對峙法、盆栽試驗法進行評價，篩選出具有解磷功能和抑菌功能的菌株，定名為PHODB35。PHODB35菌株的分類鑒定：(1)形態(tài)特征鑒定在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)菌體為桿狀，培養(yǎng)10h后產生芽胞，芽胞中生，橢圓形，胞囊不膨大，抗酸染色陰性，無伴胞晶體，能運動，鞭毛周生。在營養(yǎng)瓊脂平板上，培養(yǎng)初期菌落淡乳白色，膿狀，圓形，邊緣整齊，菌落隆起呈饅頭狀，表面濕潤；培養(yǎng)后期菌落淡黃色，邊緣不整齊，表面干燥有褶皺；在營養(yǎng)瓊脂斜面上劃線培養(yǎng)，呈直線形；在液體培養(yǎng)基中靜止培養(yǎng)，表面形成白色菌膜。這些形態(tài)特征與《常見細菌系統鑒定手冊》(東秀珠等編著.科學出版社.2001年)中描述的芽孢桿菌屬形態(tài)特征基本一致，初步判斷菌株PHODB35屬于芽孢桿菌。(2)利用16SrDNA序列鑒定分類以PHODB35的基因組DNA為模板，以27F和1492R為引物對16SrDNA進行PCR擴增，所述的引物序列為：27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；(SEQIDNo:1)1492R：5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'；(SEQIDNo:2)16SrDNA的PCR反應體系為50μL：10×PCRBuffer(Mg2+)5μL；dNTPMixture(2.5mM)5μL；rTaqDNA聚合酶(0.5U/μL)1μL，27F(10μmol/L)1μL，1492R(10μmol/L)1μL；PHODB35的基因組DNA50ng；ddH2O補足至50μL。PCR的反應條件為95℃5min；94℃45s，60℃45s，72℃1.5min，35個循環(huán)；72℃10min。將所得PCR擴增產物進行凝膠電泳，送往上海生工生物工程有限公司測序，得到PHODB35的16SrDNA序列(見SEQIDNo:3)。將PHODB35的16SrDNA序列在Genbank中進行同源性比較，結果PHODB35與芽孢桿菌屬的16SrDNA同源性達到100％；同時利用MEGA軟件(分子進化遺傳分析軟件)構建系統發(fā)育樹(見圖1)，PHODB35與芽孢桿菌屬聚合到一起，說明PHODB35屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)。(3)利用gyrB基因序列鑒定分類以PHODB35基因組DNA為模板，以芽孢桿菌gyrB基因兼并引物gyrB-F和gyrB-R為引物進行PCR擴增，得PCR擴增產物；其中所述的gyrB-F和gyrB-R引物的序列為：gyrB-F：5'-GAAGCACGGACAATCACC-3'；(SEQIDNo:4)，gyrB-R：5'-TCCAAAGCACTCTTACGG-3'；(SEQIDNo:5)。gyrB的PCR反應體系為50μL：10×PCRBuffer(Mg2+)5μL；dNTPMixture(2.5mM)5μL；rTaqDNA聚合酶(0.5U/μL)1μL；gyrB-F(10μmol/L)2μL，gyrB-R(10μmol/L)2μL；PHODB35基因組DNA50ng；ddH2O補足至50μL。PCR的反應條件為95℃5min；94℃45s，55℃45s，72℃1min，35個循環(huán)；72℃10min。將擴增產物送交上海生工生物工程有限公司測序，得PHODB35菌株的gyrB基因序列(見SEQIDNo:6)。將獲得的PHODB35菌株的gyrB基因序列在Genbank中進行同源性比較，結果發(fā)現PHODB35與解淀粉芽孢桿菌的gyrB基因序列同源性最高，達到99.0％；同時利用MEGA軟件(分子進化遺傳分析軟件)構建系統發(fā)育樹(見圖2)，PHODB35菌株與解淀粉芽孢桿菌聚合到一起，說明PHODB35為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)，并且是一個新菌株。綜合以上形態(tài)特征、16SrDNA和gyrB基因序列同源性對比分析的結果，可知PHODB35屬于解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)，并且和現有的芽孢桿菌菌株不同，是一個新的解淀粉芽孢桿菌菌株。本發(fā)明具有的優(yōu)點和有益效果：(1)本發(fā)明PHODB35菌株降解無機磷效果好，能土壤中的降解無機磷從而為作物生長提供肥效；(2)本發(fā)明PHODB35菌株抑菌效果好，抑菌譜廣，對棉花黃萎病、枯萎病和立枯病三種棉花病原菌都有很好的抑制作用；(3)本發(fā)明解淀粉芽孢桿菌PHODB35對肥效高，與對照相比，經菌株PHODB35處理后的番茄株高、地上鮮重、地下鮮重、基質和植株磷含量為指標，分別增加28.21％、22.59％、113.06％、45.08％和16.24％；(3)本發(fā)明微生物菌肥對人、畜安全，沒有環(huán)境污染問題；(4)本發(fā)明制備方法簡單、成本低、使用簡單。附圖說明圖1.為根據16SrDNA序列獲得的PHODB35菌株系統發(fā)育樹圖。圖2.為根據gyrB基因序列獲得的PHODB35菌株系統發(fā)育樹圖。具體實施方式下面以具體實施例來進一步清楚地解釋本發(fā)明，但是不以任何方式構成對本發(fā)明的限制。下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。實施例1解淀粉芽孢桿菌PHODB35微生物菌劑的制備按照如下步驟進行：(1)菌種活化：將保存于-80℃的菌株PHODB35(解淀粉芽孢桿菌菌株PHODB35己于2016年9月26日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNo.13040)在LB平板培養(yǎng)基(其組成成分及其重量比為：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉5g，瓊脂粉15g，水1000mL)上進行活化(30℃)，挑取單菌落在LB斜面培養(yǎng)基(其組成成分及其重量比為：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉5g，瓊脂粉15g，水1000mL)上在30℃下培養(yǎng)12小時，得活化的菌株；(2)種子液的制備：按常規(guī)方法制作LB液體培養(yǎng)基(其組成成分及其重量比為：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化鈉5g，水1000mL)，在250mL三角瓶中裝入LB培養(yǎng)液100mL，高壓濕熱滅菌，待溫度降到室溫后，每瓶中接入一接種環(huán)步驟(1)中活化好的菌株，在30℃、搖床轉速190rpm的條件下進行振蕩培養(yǎng)12小時，得種子液；(3)玉米粉黃豆粉培養(yǎng)基的制備：按照重量百分比將玉米粉1.5％，黃豆粉2.0％，NaCl0.5％，MnSO4·H2O0.6％加入水中，攪拌混合均勻，即得玉米粉黃豆粉培養(yǎng)基；分裝于500mL三角瓶中，每瓶200mL；在121℃對玉米粉黃豆粉培養(yǎng)基進行滅菌30分鐘，再降溫到30℃?zhèn)溆茫?4)發(fā)酵培養(yǎng)：向步驟(3)所得每瓶玉米粉黃豆粉培養(yǎng)基200mL中接種步驟(2)所得種子液2mL；在30℃、搖床轉速180rpm條件下進行發(fā)酵培養(yǎng)24小時，以后每隔30分鐘從三角瓶中取樣進行鏡檢，對視野中的芽胞和總菌體數進行計數，并計算芽胞率(芽胞率(％)＝成熟芽胞數/(成熟芽胞數+菌體數)×100)；芽胞率達到90％時停止發(fā)酵培養(yǎng)；共發(fā)酵培養(yǎng)36小時，得解淀粉芽孢桿菌PHODB35的液體制劑。實施例2解淀粉芽孢桿菌PHODB35降解無機磷能力定性測定試驗按照如下方法進行：用滅菌牙簽將實施例1步驟(1)中活化好的PHODB35菌株點接接種在解無機磷平板培養(yǎng)基(其組成成分及其重量比為：葡萄糖10.0g，(NH4)2SO40.5g，MgSO4·7H2O0.5g，NaCl0.2g，Ca3(PO4)25.0g，KCl0.2g，MnSO40.03g，FeSO40.003g，瓊脂20.0g，蒸餾水1000mL，pH：7.0-8.0)上，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)5天，測量透明圈直徑及菌落的直徑。結果解淀粉芽孢桿菌PHODB35在含有Ca3(PO4)2的無機磷平板培養(yǎng)基上產生直徑13.0毫米的透明圈，說明本發(fā)明解淀粉芽孢桿菌PHODB35能夠很好降解無機磷Ca3(PO4)2，具有降解土壤中無機磷的潛力。實施例3解淀粉芽孢桿菌PHODB35降解無機磷能力定量測定試驗本試驗于2015年8月上旬在河北省農林科學院植物保護研究所植物病害生物防治實驗室內進行。按照如下方法進行：(1)發(fā)酵培養(yǎng)基制備：按照比例將葡萄糖10.0g，(NH4)2SO40.5g，MgSO4·7H2O0.5g，NaCl0.2g，Ca3(PO4)25.0g，KCl0.2g，MnSO40.03g，FeSO40.003g加入到蒸餾水1000mL中，混合均勻，即得發(fā)酵培養(yǎng)基(pH：7.0-8.0)。將發(fā)酵培養(yǎng)基50mL裝入300mL錐形瓶中，高溫高壓滅菌，待用。(2)發(fā)酵液制備：將實施例1步驟(2)所得的PHODG35菌株種子液和空白對照培養(yǎng)液(不接種PHODG35菌株的LB液體培養(yǎng)基)分別按照重量百分比為4％的比例接種到步驟(1)制備的發(fā)酵培養(yǎng)基中，每組3個重復，在30℃、180r/min培養(yǎng)6d，得發(fā)酵液。(3)發(fā)酵液處理：將培養(yǎng)好的發(fā)酵液轉移至無菌的離心杯中，采用KQ5200DE型數控超生波清洗器進行超聲波細胞破碎，破碎條件：200-240V，2A，50/60Hz，時間20min。使之釋放出細胞內的有效磷。以8000r/min的轉速離心10min后取2.5mL上清液于50mL比色管中，加2滴2，4-二硝基苯酚作指示劑，用10％NaOH和5％稀硫酸溶液調節(jié)pH值至溶液剛呈微黃色，加鉬銻抗顯色劑5mL，定容，反應30min后。用T6新世紀紫外可見分光光度計測定上清液在720nm處的OD值。根據標準曲線得出上清液中的有效磷含量。(4)結果計算：由樣品溶液比色所得吸收值在工作曲線上算出相應的比色溶液的含磷量(mg/L)，再按下式計算發(fā)酵液中有效磷含量：有效磷(mg/L)＝比色液的磷(mg/L)×稀釋倍數。結果(見表1)：搖瓶培養(yǎng)6天后測定發(fā)酵液中的有效磷含量，結果發(fā)現，接種解淀粉芽孢桿菌PHODB35的發(fā)酵培養(yǎng)液中可溶性磷含量與空白對照相比增加到75.74mg/L，表明解淀粉芽孢桿菌PHODB35菌株具有降解無機磷磷酸三鈣的能力。表1解淀粉芽孢桿菌PHODB35降解無機磷能力定量測定試驗結果菌株編號OD720(nm)可溶性磷含量(mg/L)PHODB351.49575.74實施例4解淀粉芽孢桿菌PHODB35對番茄植株的促進生長鑒定試驗(一)試驗處理：(1)處理1：磷酸三鈣+PHODB35發(fā)酵液+缺磷營養(yǎng)液；(2)處理2：磷酸三鈣+原發(fā)酵培養(yǎng)基+缺磷營養(yǎng)液。(二)試驗方法：本試驗于2015年12月上旬在河北省農林科學院植物保護研究所植物病害生物防治實驗室內進行?；ㄅ?高：21cm、盆口直徑：22cm、盆底直徑：15cm)裝沙量4kg/盆(沙子用清水沖洗3遍，風干備用)，選取長勢一致的番茄幼苗移栽于花盆中，每盆3株，置于溫室中培養(yǎng)，緩苗后開始試驗。試驗設置兩個處理，處理1是將實施例3制備的解淀粉芽孢桿菌PHODB35菌株發(fā)酵液稀釋液300mL/盆(濃度為1×107CFU/mL)澆灌于作物根部，處理2以澆灌等量的實施例3步驟(1)制備的發(fā)酵培養(yǎng)基水稀釋液為對照。期間加強番茄病蟲害管理，適時補充水分，每次500mL/盆。5d澆一次缺磷營養(yǎng)液(缺磷營養(yǎng)液的組成成分見專利申請201110107663X)，每次300mL/盆。40d后測定番茄的株高、地上部鮮重和地下部鮮重、基質中的有效磷以及番茄植株體內磷含量等指標。結果(見表2)接種菌株PHODB35發(fā)酵液的番茄株高、地上部鮮重、地下部鮮重均與空白對照之間存在顯著差異，株高增長率為28.21％，地上部鮮重增長率為22.59％，地下部鮮重增長率為113.06％。說明PHODB35菌株及其微生物菌劑對番茄植株促生長效果顯著。表2PHODB35菌株對盆栽番茄促生長試驗結果從表3中可以看出，經PHODB35菌株處理后土壤中有效磷增長率為45.08％；菌株PHODB35處理后的番茄植株中有效磷增長率為16.24％。說明解淀粉芽孢桿菌PHODB35菌株能夠有效降解土壤中的無機磷并促進番茄植株對降解后的有效磷的吸收。表3PHODB35菌株對基質、番茄植株有效磷的影響試驗結果實施例5解淀粉芽孢桿菌PHODB35對三種病害病原菌的抑制作用試驗(一)供試病原菌菌株：(1)棉花黃萎菌WX-1：分離自河北省邢臺市威縣棉花黃萎病病株，經河北農業(yè)大學鑒定為大麗輪枝菌(Verticilliumdahaliae)。(2)棉花枯萎菌FOV-1：分離自河北省邯鄲市曲周縣棉花枯萎病病株，經河北農業(yè)大學鑒定為尖孢鐮刀菌棉花?；?Fusariumoxyporiumf.sp.vasinfectum)。(3)棉花立枯菌RHS-1：分離自河北省保定市高陽縣棉花苗期立枯病病株，經河北農業(yè)大學鑒定為立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)。上述三個菌株致病力測定均表現為強致病力。(二)試驗方法：本試驗于2015年11月上旬在河北省農林科學院植物保護研究所植物病害生物防治實驗室內進行。首先將供試的病原真菌在PDA平板上活化培養(yǎng)3-7天，然后用打孔器在菌落邊緣區(qū)域打孔制成菌片；將供試病原真菌菌片轉接在另一個PDA平板中央，再將實施例1步驟(1)中活化的解淀粉芽孢桿菌PHODB35點接在距指示菌菌片2.0厘米處，設空白對照(不點接PHODB35菌株)。在25℃恒溫培養(yǎng)3-10天，逐日觀察PHODB35菌株和供試病原真菌的生長情況，待空白對照病原菌長至培養(yǎng)皿邊緣時，測量三種病原菌的對照生長量(菌落半徑)和經解淀粉芽孢桿菌PHODB35處理的生長量(接種PHODB35后的抑制生長半徑)，拮抗作用用抑菌率表示。抑菌率計算公式為：抑菌率(％)＝(對照生長量-處理生長量)/對照生長量×100)。結果(見表4)解淀粉芽孢桿菌PHODB35對棉花黃萎菌的抑制率為64.00％，對棉花枯萎菌的抑制率為68.16％，對棉花立枯菌的抑制率為69.21％，說明解淀粉芽孢桿菌PHODB35對這三種病原菌具有明顯的抑制作用，具有防治棉花黃萎病、棉花枯萎病、棉花立枯病的生防潛力。表4PHODB35菌株對三種病原菌的抑菌作用試驗結果當前第1頁1 2 3