本發(fā)明屬于生物工程藥用蛋白技術(shù)領(lǐng)域，涉及一類TRAIL蛋白相關(guān)的多靶點(diǎn)抗腫瘤融合蛋白制備及其用途。

背景技術(shù)：
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腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)，又稱為凋亡素2配體(Apo2 ligand，Apo2L)，是機(jī)體自身合成的一種細(xì)胞因子，表達(dá)于少數(shù)淋巴細(xì)胞表面，也以可溶的游離形式存在，其生理功能主要是調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫反應(yīng)，參與免疫監(jiān)視以及抑制腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移。研究表明，人可溶性TRAIL(sTRAIL)，即TRAIL蛋白的114至281位氨基酸序列，具有完整TRAIL蛋白的活性(Pitti RM,J.Biol.Chem,1996)，可以誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，而靶向特異性使其對(duì)正常細(xì)胞幾乎沒(méi)有毒性作用，然而臨床試驗(yàn)效果不佳，耐藥性的產(chǎn)生局限了其在臨床上的應(yīng)用。基于TRAIL相關(guān)的融合蛋白，可以提高腫瘤細(xì)胞對(duì)TRAIL的敏感性，一定程度上逆轉(zhuǎn)其耐藥性。重組人可溶性TRAIL(rhTRAIL)及靶向TRAIL受體的激動(dòng)劑型抗體具有很好的抗腫瘤活性，并在臨床試驗(yàn)中取得很大的進(jìn)展。但是，耐藥性的產(chǎn)生以及個(gè)體差異等，是TRAIL及靶向TRAIL受體的激動(dòng)劑型抗體在臨床應(yīng)用的最大難題。研究發(fā)現(xiàn)。與sTRAIL重組后的多靶點(diǎn)藥物抗腫瘤活性可得到明顯的提升，例如EGFR單鏈抗體與sTRAIL偶聯(lián)后的重組蛋白，對(duì)EGFR表達(dá)水平高的腫瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)的凋亡誘導(dǎo)作用。

RGD肽是一類含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp)序列的短肽，是整合素與配體蛋白相互作用識(shí)別的位點(diǎn)。整合素α_νβ3和α_νβ5在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用，通常高表達(dá)于腫瘤新生血管和一部分腫瘤細(xì)胞如乳腺癌、肺癌、前列腺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等，因此可以作為腫瘤治療的理想靶點(diǎn)。RGD肽已廣泛應(yīng)用于腫瘤的診斷與腫瘤治療研究。利用RGD肽與整合素α_νβ3和α_νβ5的特異結(jié)合，可以將抗腫瘤藥物靶向運(yùn)輸至腫瘤部位，有效降低對(duì)正常組織或器官的損傷。研究報(bào)道，RGD與sTRAIL重組后的融合蛋白，其活性明顯優(yōu)于sTRAIL。本發(fā)明中采用的環(huán)形RGD肽的氨基酸序列為ACDCRGDCFC(Koivunen E,Bio-Technology,1995)也稱為RGD4C。

NGR肽是一種抗菌肽、靶向肽(Asn-Gly-Arg)，通過(guò)氨肽酶N(aminopeptidase N,CD13)與新生血管發(fā)生特異性結(jié)合，通過(guò)NGR修飾可以將細(xì)胞毒性藥物、細(xì)胞因子、抗血管生成藥物以及造影劑等靶向新生血管，提高藥效降低對(duì)正常組織的損傷，目前已大量被用于治療性藥物靶向運(yùn)輸?shù)难芯?，其中NGR-hTNF已經(jīng)進(jìn)入臨床ΙΙ、ΙΙΙ期研究。研究報(bào)道sTRAIL對(duì)血管生成具有一定的抑制作用，若將NGR與sTRAIL重組，得到的融合蛋白不僅可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，并可將融合蛋白靶向運(yùn)輸至腫瘤新生血管部位，抑制腫瘤新生血管的生成。但是， 迄今為止，尚未見(jiàn)有NGR肽與sTRAIL偶聯(lián)及其抗腫瘤作用的相關(guān)報(bào)道。本發(fā)明應(yīng)用的NGR肽的氨基酸序列是CNGRCVSGCAGRC(Arap W,Science,1998)。

基于以上現(xiàn)狀，本發(fā)明利用TRAIL對(duì)腫瘤細(xì)胞的選擇性凋亡誘導(dǎo)作用，RGD肽和NGR肽的靶向作用，分別于sTRAIL的兩端引入上述RGD肽和NGR肽，研發(fā)了TRAIL相關(guān)的抗腫瘤細(xì)胞及抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的多靶點(diǎn)融合蛋白，其具有更強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用并能有效抑制腫瘤細(xì)胞體內(nèi)外轉(zhuǎn)移。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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本發(fā)明提供了一類多靶點(diǎn)抗腫瘤融合蛋白R(shí)GD-TRAIL-NGR和TRAIL-NGR。

本發(fā)明提供了TRAIL相關(guān)融合蛋白R(shí)GD-TRAIL-NGR和TRAIL-NGR的編碼基因及氨基酸序列。

本發(fā)明提供了TRAIL相關(guān)融合蛋白的制備方法。

本發(fā)明提供了TRAIL相關(guān)的融合蛋白在抗腫瘤中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了以所述融合蛋白為有效成分與藥學(xué)上可接受的載體組成的組合物及其在抗腫瘤中的應(yīng)用。

有關(guān)TRAIL相關(guān)融合蛋白制備的已有報(bào)道幾乎均采用原核表達(dá)系統(tǒng)。本發(fā)明利用基因工程技術(shù)，于sTRAIL的兩端分別引入了RGD肽和NGR肽，構(gòu)建了TRAIL相關(guān)融合蛋白R(shí)GD-TRAIL-NGR的重組載體，通過(guò)畢赤酵母分泌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)目的蛋白，經(jīng)純化獲得一種多功能藥用蛋白。

本發(fā)明所提供的一種抗腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移多靶點(diǎn)融合蛋白，其結(jié)構(gòu)為：RGD-連接肽(G₄S)-sTRAIL-連接肽(G₄S)-NGR，所述蛋白具有SEQ ID NO:1氨基酸序列，共208個(gè)氨基酸。

本發(fā)明提供所述融合蛋白的編碼基因，其具有SEQ ID NO:2所示核苷酸序列，共624bp。

本發(fā)明提供的另一種抗腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移多靶點(diǎn)融合蛋白TRAIL-NGR的氨基酸序列為SEQ ID NO:3，共192個(gè)氨基酸，具有SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列，共576bp。

本發(fā)明采用基因工程技術(shù)，提供了TRAIL相關(guān)新型多靶點(diǎn)融合蛋白的制備方法(實(shí)施例2)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于，利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)分泌表達(dá)了RGD-TRAIL-NGR、RGD-TRAIL和TRAIL-NGR三種融合蛋白，并比較了它們的抗腫瘤作用。所獲得的三種融合蛋白，可高效結(jié)合相關(guān)細(xì)胞表面因子表達(dá)的腫瘤細(xì)胞，對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖抑制效果顯著，融合蛋白還能明顯抑制腫瘤細(xì)胞的體內(nèi)外轉(zhuǎn)移作用。RGD肽和NGR肽的加入，能夠增強(qiáng)TRAIL的抗腫瘤效果，并部分逆轉(zhuǎn)TRAIL的耐藥性，表現(xiàn)出更好的應(yīng)用前景。其中RGD-TRAIL已有相關(guān)報(bào)道，通過(guò)比較表明，本發(fā)明構(gòu)建的RGD-TRAIL-NGR融合蛋白具有更佳的抗腫瘤活性。

附圖說(shuō)明：

圖1—TRAIL相關(guān)融合蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定(M1：DNA marker DL 2000，1：PCR產(chǎn)物，

2：重組質(zhì)粒，3：SnaB I和Not I雙酶切，4：Sal I酶切，M2：DNA marker DL 15000)

其中：圖A為RGD-TRAIL表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定結(jié)果；

圖B為TRAIL-NGR表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定結(jié)果；

圖C為RGD-TRAIL-NGR表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定結(jié)果。

圖2—TRAIL相關(guān)融合蛋白的分離純化及鑒定(M：蛋白Marker，1：Washing buffer I洗脫液，

2：Washing buffer II洗脫液，3：Elution buffer洗脫液，4：抗His-tag免疫印跡結(jié)果，5：

抗TRAIL免疫印跡結(jié)果)

其中：圖A為RGD-TRAIL分離純化及鑒定結(jié)果；

圖B為TRAIL-NGR分離純化及鑒定結(jié)果；

圖C為NGR-TRAIL-NGR分離純化及鑒定結(jié)果。

圖3—TRAIL相關(guān)融合蛋白與腫瘤細(xì)胞的親和活性

其中：圖A為多種腫瘤細(xì)胞表面受體α_ν、CD13、DR4和DR5的表達(dá)情況；

圖B為ELISA法檢測(cè)TRAIL相關(guān)融合蛋白與腫瘤細(xì)胞H460、A549、HT1080、PANC-1的結(jié)合情況。

圖4—MTT法檢測(cè)TRAIL相關(guān)融合蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞H460、A549、HT1080、PANC-1的增殖抑制作用

圖5—?jiǎng)澓蹖?shí)驗(yàn)檢測(cè)TRAIL相關(guān)融合蛋白對(duì)A549和HT1080遷移抑制作用

其中，圖A為A549細(xì)胞；

圖B為HT1080細(xì)胞。

圖6—Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TRAIL相關(guān)融合蛋白對(duì)A549和HT1080遷移抑制作用

其中，圖A為A549細(xì)胞；

圖B為HT1080細(xì)胞。

圖7—流式細(xì)胞術(shù)和Western blot法分析TRAIL相關(guān)融合蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞A549和HT1080的凋亡誘導(dǎo)作用

其中，圖A為A549細(xì)胞；

圖B為HT1080細(xì)胞。

圖8—TRAIL相關(guān)融合蛋白對(duì)裸鼠肺轉(zhuǎn)移模型的轉(zhuǎn)移抑制作用

其中：圖A為各組別熒光強(qiáng)度；

圖B為各組肺轉(zhuǎn)移瘤結(jié)節(jié)的數(shù)量；

圖C為各組裸鼠體重變化曲線。

具體實(shí)施方式：

以下實(shí)施例僅為幫助本領(lǐng)域技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明?！秾?shí)施例1》重組表達(dá)載體pHBM-rgd-trail-ngr、pHBM-rgd-trail和pHBM-trail-ngr的構(gòu)建

利用酶切、PCR、連接分子生物學(xué)技術(shù)，采用pHBM表達(dá)載體構(gòu)建重組質(zhì)粒pHBM‐rgd‐trail‐ngr和pHBM‐trail‐ngr。

融合蛋白R(shí)GD-連接肽(G4S)-TRAIL-連接肽(G4S)-NGR全基因序列由金斯瑞公司根 據(jù)畢赤酵母偏愛(ài)密碼子優(yōu)化合成，融合蛋白R(shí)GD-TRAIL和TRAIL-NGR的基因序列通過(guò)設(shè)計(jì)引物利用分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行構(gòu)建，引物由Invitrogen^TM公司合成，表達(dá)載體為pHBM(CHKD博碩士論文全文數(shù)據(jù)庫(kù)，2014)。

P1：5’-TCTGTACGTAGCTTGTGATTGTAGAGGAG-3’

(下劃線為SnaB I酶切位點(diǎn)，其后為RGD肽編碼基因起始序列)

P2：5’-ATAAGAATGCGGCCGCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGACCAACCAAAAAGGC-3’

(下劃線為Not I酶切位點(diǎn)，其后為His-tag編碼基因及TRAIL蛋白編碼基因結(jié)尾互補(bǔ)序列)

P3：5’-TCTGTACGTAGTTAGAGAAAGAGGACCTCAG-3’

(下劃線為SnaB I酶切位點(diǎn)，其后為TRAIL編碼基因起始序列)

P4：5’-ATAAGAATGCGGCCGCTTAGTGGTGGTG-3’

(下劃線為Not I酶切位點(diǎn)，其后為His-tag編碼基因結(jié)尾互補(bǔ)序列)

1)提取金斯瑞公司提供的pUC57-rgd-trail-ngr質(zhì)粒，用SnaB I和Not I雙酶切后，與經(jīng)過(guò)雙酶切的pHBM質(zhì)粒載體進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒pHBM-rgd-trail-ngr；

2)以質(zhì)粒pHBM-rgd-trail-ngr為模板，引物P1和P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，膠回收PCR產(chǎn)物，用SnaB I和Not I雙酶切后，與經(jīng)過(guò)雙酶切的pHBM質(zhì)粒載體進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒pHBM-rgd-trail；

3)以質(zhì)粒pHBM-rgd-trail-ngr為模板，引物P3和P4進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，膠回收PCR產(chǎn)物，用SnaB I和Not I雙酶切后，與經(jīng)過(guò)雙酶切的pHBM質(zhì)粒載體進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒pHBM-trail-ngr。

畢赤酵母表達(dá)的融合蛋白R(shí)GD-TRAIL-NGR基因序列如SEQ ID NO:2，全長(zhǎng)624bp，編碼208個(gè)氨基酸，RGD肽基因與TRAIL蛋白基因之間以及TRAIL蛋白基因和NGR肽基因之間為GGGGS連接肽基因(編碼5個(gè)氨基酸)，TRAIL-NGR蛋白基因序列如SEQ ID NO:4，全長(zhǎng)576bp，編碼192個(gè)氨基酸。

《實(shí)施例2》TRAIL相關(guān)融合蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)及純化

將構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒pHBM-rgd-trail、pHBM-trail-ngr、pHBM-rgd-trail-ngr轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，雙酶切及測(cè)序鑒定后，提取質(zhì)粒，用Sal I酶切線性化(圖1)，膠回收分子量大的片段，電轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞，涂布MD平板，分別挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定，挑取His⁺菌落進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，選取表達(dá)量相對(duì)較高的菌株作為表達(dá)菌進(jìn)行較大規(guī)模發(fā)酵。所述的菌株被命名為GS115-RTN，于2016年09月19日送交中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，其編號(hào)為CGMCC No.13016。首先接種融合蛋白的表達(dá)菌株于BMGY培養(yǎng)基(1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB，4×10^-5％生物素，100mM pH 6.0磷酸鉀緩沖液，1％甘油)中，30℃培養(yǎng)36h，室溫靜置或離心收集菌體，將其轉(zhuǎn)移至BMMY培養(yǎng)基(1％酵母提取物，2％蛋白胨，1.34％YNB，4×10^-5％生物素，100mM pH 6.0磷酸鉀緩沖 液，1％甲醇)，20℃繼續(xù)培養(yǎng)48-96h(每24h補(bǔ)加100％甲醇至終濃度為1％，誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá))。融合蛋白在畢赤酵母中以可溶性的形式表達(dá)于培養(yǎng)基中，上清經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾后，用GE公司的Ni²⁺親和柱進(jìn)行純化，具體操作按照說(shuō)明書進(jìn)行。通過(guò)12％SDS-PAGE檢測(cè)融合蛋白的表達(dá)及純化情況，經(jīng)Western blot鑒定，純化后的蛋白含有TRAIL蛋白結(jié)構(gòu)和His-tag結(jié)構(gòu)(圖2)。

《實(shí)施例3》融合蛋白與腫瘤細(xì)胞親和活性分析

1)Western blot檢測(cè)不同腫瘤細(xì)胞表面α_ν、CD13、DR4和DR5的表達(dá)水平

腫瘤細(xì)胞HEK293、3T3、A549、H460、PANC-1、BxPC-3、MIA、HCT-15和HT1080均由本室傳代保存。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞用預(yù)冷的PBS潤(rùn)洗3次，加入適量的細(xì)胞裂解液(50mmol/L Tris-Hcl，150mmol/L Nacl，0.2％SDS，2％NP-40，0.5％脫氧膽酸鈉，pH 8.0。臨用前加入1％PMSF)，冰上裂解30min。于4℃，12000rpm離心20min，上清液轉(zhuǎn)移至新的1.5ml EP管。用BCA試劑盒對(duì)各種細(xì)胞裂解樣品進(jìn)行蛋白定量，每種細(xì)胞裂解樣品按照相同總蛋白量制備，與適量5×上樣緩沖液混合，沸水浴中變性10min，冷卻后上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。電泳完畢后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，經(jīng)5％脫脂奶粉封閉液封閉后，根據(jù)待檢測(cè)目的蛋白分子量大小裁剪PVDF膜，用相應(yīng)的一抗4℃孵育過(guò)夜，用TBST溶液洗膜三次，再孵育二抗，TBST溶液洗膜三次后，用顯影液進(jìn)行顯影并拍照。所用的一抗為α_ν。所檢測(cè)的細(xì)胞中，H460細(xì)胞不表達(dá)CD13，但α_ν和DR4/DR5的表達(dá)水平較高；A549、PANC-1和HT1080均表達(dá)上述細(xì)胞表面受體，因此主要應(yīng)用H460、A549、PANC-1和HT1080四種腫瘤細(xì)胞來(lái)比較構(gòu)建的TRAIL相關(guān)融合蛋白的生物學(xué)活性。

2)ELISA法分析融合蛋白對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的親和活性

腫瘤細(xì)胞H460，A549，HT1080和PANC-1以24h長(zhǎng)滿96孔板為原則接種于96孔板(根據(jù)細(xì)胞體積的大小及生長(zhǎng)速度的快慢調(diào)整每種腫瘤細(xì)胞的接種量，約1×10⁴個(gè)細(xì)胞/孔)，37℃培養(yǎng)24h后用PBS洗2次(3min/次)，加入4℃預(yù)冷的0.05％戊二醛50μl/孔，放至4℃固定細(xì)胞20min；固定后的細(xì)胞用PBS洗3次(3min/次)，甩干殘留液體后，用5％脫脂牛奶溶液以200μl/孔在室溫?fù)u床上輕搖固定封閉2h；用PBST緩沖液(PBS中含有0.05％的Tween-20)洗3次(3min/次)；將融合蛋白用PBS倍比稀釋后加入到96孔板中，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行孔，50μl/孔，37℃孵育2h；用PBST洗3次(3min/次)后，加入抗His-tag單克隆抗體(Abmart公司，1:2000稀釋)，50μl/孔，37℃孵育2h；用PBST洗3次(3min/次)后，加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體(1:2500稀釋)，50μl/孔，37℃孵育2h；用PBST洗5次(5min/次)后，每孔加入辣根過(guò)氧化物酶的底物可溶型單組分TMB溶液(北京天根生化科技有限公司)100μl，室溫避光反應(yīng)10—20min，當(dāng)液體由無(wú)色變?yōu)樗{(lán)色后，每孔加入2mol/L的硫酸100μl終止反應(yīng)，立即在酶標(biāo)儀上測(cè)定450nm處的吸光值。結(jié)果如圖3所示，三種蛋白對(duì)H460、A549、PANC-1和HT1080細(xì)胞均呈現(xiàn)出較強(qiáng)的親和活性，從圖中可以看出四種融合蛋白與上述腫瘤細(xì)胞的親和活性差異不大，表明靶向肽的引入對(duì)TRAIL蛋白的結(jié)合活 性影響不大，同樣也沒(méi)有顯著提高融合蛋白與腫瘤細(xì)胞的親和力。

《實(shí)施例4》MTT法檢測(cè)融合蛋白對(duì)各種腫瘤細(xì)胞增殖抑制作用

處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞H460、A549、HT1080和PANC-1經(jīng)胰酶消化后，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，根據(jù)細(xì)胞的生長(zhǎng)速度，每孔鋪2500-5000個(gè)細(xì)胞，37℃培養(yǎng)24h使細(xì)胞貼壁；將融合蛋白用PBS進(jìn)行倍比稀釋后，每孔加入100μl，每個(gè)融合蛋白濃度設(shè)三個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)立對(duì)照組和空白組，37℃繼續(xù)培養(yǎng)48h；每孔加入20μl濃度為5mg/ml MTT，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h；小心將孔內(nèi)液體吸盡，每孔加入150μl DMSO，室溫下低速振蕩10min，酶標(biāo)儀測(cè)定570nm處的吸光值；將平行孔吸光值取平均值，按照公式計(jì)算細(xì)胞的存活率：存活率＝(AT-AB)/(AC-AB)×100％，其中AB,AC,AT分別代表空白組、對(duì)照組、加重組蛋白組平均吸光值。以細(xì)胞存活率為縱坐標(biāo)，融合蛋白濃度為橫坐標(biāo)作濃度反應(yīng)曲線，利用SPSS軟件計(jì)算IC50值。

從MTT結(jié)果(圖4)可以看出，這3種蛋白對(duì)H460和A549細(xì)胞的增殖抑制作用沒(méi)有特別顯著的差別。事實(shí)上，H460和A549細(xì)胞對(duì)TRAIL相對(duì)敏感，而HT1080和PANC-1細(xì)胞對(duì)TRAIL相對(duì)不敏感。因此在H460和A549細(xì)胞中經(jīng)過(guò)靶向肽修飾后的融合蛋白活性差異并不大，RGD-TRAIL-NGR的活性稍強(qiáng)，而單個(gè)靶向肽修飾后的融合蛋白活性稍弱；在PANC-1細(xì)胞中，RGD-TRAIL與另兩種融合蛋白活性差異較為顯著，表明NGR肽可以增強(qiáng)融合蛋白的活性；在HT1080細(xì)胞中，融合蛋白TRAIL-NGR的增殖抑制效果最強(qiáng)，其次是RGD-TRAIL-NGR，這可能與HT1080細(xì)胞表面CD13表達(dá)水平較高有關(guān)，并且其作用對(duì)于HT1080細(xì)胞尤為重要，而RGD-TRAIL-NGR融合蛋白可能由于RGD肽的存在，空間上對(duì)NGR肽作用的充分發(fā)揮具有一定的限制作用，因此其活性較TRAIL-NGR稍差(表1)。

表1.融合蛋白R(shí)GD-TRAIL、TRAIL-NGR和RGD-TRAIL-NGR對(duì)各種細(xì)胞的IC50值

《實(shí)施例5》融合蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移抑制作用

1)劃痕法檢測(cè)融合蛋白對(duì)細(xì)胞遷移的影響

將傳代培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞接種于6孔板，37℃培養(yǎng)24h使細(xì)胞貼壁；用無(wú)菌的200μl黃槍頭沿孔的直徑緊貼板底劃線，用PBS潤(rùn)洗3次，洗掉漂浮的細(xì)胞，加入新的細(xì)胞培養(yǎng)基及相應(yīng)濃度的融合蛋白；分別于劃線后0h、24h在倒置顯微鏡下觀察拍照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，由于HT1080和A549細(xì)胞對(duì)融合蛋白敏感性不同因此，融合蛋白的濃度分別設(shè)為0.12μmol·L^-1和0.016μmol·L^-1，與對(duì)照組相比，融合蛋白能夠明顯抑制腫瘤細(xì)胞HT1080和A549的遷移作 用，其中抑制作用由弱至強(qiáng)分別為RGD-TRAIL、TRAIL-NGR和RGD-TRAIL-NGR，表明雙靶向肽的引入均能夠發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞遷移的作用，其中NGR肽在遷移抑制方面作用更為顯著。

2)Transwell法檢測(cè)融合蛋白對(duì)細(xì)胞遷移的影響

向Transwell小室內(nèi)及外室分別加入100μl和600μl的無(wú)血清培養(yǎng)基，靜置于37℃培養(yǎng)箱平衡1-2h，提高細(xì)胞的貼附效率；將傳代培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞消化后，用無(wú)血清培養(yǎng)基洗2次，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，根據(jù)不同細(xì)胞的遷移能力，調(diào)整細(xì)胞密度，A549細(xì)胞濃度為8×10⁵個(gè)/ml，HT1080細(xì)胞密度為5×10⁵個(gè)/ml；棄掉小室和外室的液體，分別加入細(xì)胞懸液和相應(yīng)濃度的融合蛋白，總體積100μl，向外室加入600μl含有血清的培養(yǎng)基，其中A549細(xì)胞用20％血清，而HT1080細(xì)胞用10％血清；于37℃培養(yǎng)24h后，取出小室，棄掉小室內(nèi)和外室的培養(yǎng)液，把嵌套膜用PBS洗一次，用預(yù)冷的甲醇固定細(xì)胞10min；用PBS潤(rùn)洗3次，放入0.1％結(jié)晶紫染色液，室溫下染色30min；用PBS潤(rùn)洗3次，用棉簽拭去嵌套膜小室內(nèi)側(cè)的液體和沒(méi)有轉(zhuǎn)移的細(xì)胞，保留嵌套膜外側(cè)的細(xì)胞，擦干后于顯微鏡下觀察并拍照；為了更客觀的評(píng)價(jià)腫瘤細(xì)胞的遷移情況，用刀片將嵌套膜沿邊緣切下，放入96孔板內(nèi)，加入150μl 33％的醋酸溶解結(jié)晶紫，低速振蕩溶解10min，小心取出膜，在酶標(biāo)儀上測(cè)定OD 570處吸光值。

Transwell實(shí)驗(yàn)中融合蛋白的濃度與劃痕實(shí)驗(yàn)一致，結(jié)果如圖6所示，經(jīng)融合蛋白作用后細(xì)胞的遷移明顯得到了抑制，且實(shí)驗(yàn)結(jié)果與劃痕實(shí)驗(yàn)相一致，進(jìn)一步表明融合蛋白能夠發(fā)揮靶向肽RGD和NGR的作用。

《實(shí)施例6》融合蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞A549和HT1080凋亡誘導(dǎo)作用

1)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)融合蛋白誘導(dǎo)A549和HT1080細(xì)胞凋亡

將A549和HT1080細(xì)胞接種于6孔板，37℃培養(yǎng)過(guò)夜使其貼壁；加入相應(yīng)濃度的融合蛋白，繼續(xù)培養(yǎng)24h；收集細(xì)胞，經(jīng)PBS潤(rùn)洗2次后，加入100μl 1×Annexin V Binding Solution將細(xì)胞重懸；向細(xì)胞懸液中加入5μl Annexin V,FITC結(jié)合物，再加入5μl PI，室溫下避光培養(yǎng)15min；加入400μl 1×Annexin V Binding Solution，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分別選擇濃度為0.05和1μmol·L^-1的融合蛋白作用于A549和HT1080細(xì)胞。如圖7所示，在對(duì)TRAIL相對(duì)敏感的A549細(xì)胞中，融合蛋白R(shí)GD-TRAIL-NGR對(duì)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用最強(qiáng)，其次是TRAIL-NGR，結(jié)果與MTT相符；但是在HT1080細(xì)胞中，雖然細(xì)胞凋亡率與MTT結(jié)果趨勢(shì)相同，但凋亡率較低且差異較小，表明對(duì)TRAIL相對(duì)不敏感的HT1080細(xì)胞，融合蛋白雖能誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡，但效果并不顯著，同時(shí)表明RGD肽和NGR肽能夠發(fā)揮作用。

2)Western blot檢測(cè)融合蛋白對(duì)A549和HT1080凋亡相關(guān)蛋白誘導(dǎo)作用

分別將A549、HT1080細(xì)胞接種于6孔板中，37℃培養(yǎng)24h使細(xì)胞貼壁；分別加入適當(dāng)濃度的融合蛋白，繼續(xù)培養(yǎng)24h；然后收集細(xì)胞，冰上裂解收集蛋白，經(jīng)BCA試劑盒定量后，電泳并將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5％脫脂牛奶室溫下封閉2h，用封閉液稀釋相關(guān)一抗， 孵育過(guò)夜；TBST潤(rùn)洗3次，加入用TBST稀釋的二抗，繼續(xù)孵育2h，再用TBST潤(rùn)洗5次；將Millipore公司發(fā)光檢測(cè)液A和B按1:1混合后，加在PVDF膜上進(jìn)行顯色，凝膠成像系統(tǒng)拍照。

根據(jù)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分別選擇濃度為0.025、0.05μmol·L^-1的RGD-TRAIL、TRAIL-NGR和RGD-TRAIL-NGR蛋白作用于A549細(xì)胞，選擇濃度為0.5、1μmol·L^-1的上述3種蛋白作用于HT1080細(xì)胞，24h后提取總蛋白進(jìn)行Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白PARP和caspase-3的表達(dá)情況(如圖7)，在A549細(xì)胞中，低濃度的四種蛋白均能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，說(shuō)明融合蛋白能夠發(fā)揮TRAIL蛋白部分的作用，相比之下RGD-TRAIL-NGR的效果更加明顯，這與MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符，表明RGD肽與NGR肽均能發(fā)揮相應(yīng)的作用。而在HT1080細(xì)胞中也能檢測(cè)到凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，但是caspase-3剪接體并不明顯，這與HT1080細(xì)胞對(duì)TRAIL相對(duì)不敏感有關(guān)，并且三種蛋白的效果相似，MTT結(jié)果顯示帶有NGR肽的融合蛋白更能夠抑制HT1080細(xì)胞的增殖，說(shuō)明可能是NGR肽發(fā)揮了較強(qiáng)的抑制效果。

《實(shí)施例7》融合蛋白對(duì)裸鼠肺轉(zhuǎn)移模型的轉(zhuǎn)移抑制作用

實(shí)施例5體外轉(zhuǎn)移抑制作用結(jié)果顯示，TRAIL-NGR和RGD-TRAIL-NGR對(duì)細(xì)胞遷移抑制較為明顯，而RGD-TRAIL作用較弱，因此本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)TRAIL-NGR和RGD-TRAIL-NGR兩種融合蛋白的體內(nèi)轉(zhuǎn)移抑制效果，并以TRAIL組作為對(duì)照。HT1080^LUC細(xì)胞由本室構(gòu)建，BALB/C裸鼠購(gòu)于斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司。收集HT1080^LUC細(xì)胞，將其稀釋為7.5×10⁶的細(xì)胞懸液。每只裸鼠從尾靜脈注射200μl細(xì)胞懸液。一周后腹腔注射熒光素酶底物D-luciferin(150mg·kg^-1)，將動(dòng)物置于Xenogen活體動(dòng)物成像系統(tǒng)檢測(cè)儀密閉的暗箱中成像觀察肺部腫瘤的生長(zhǎng)狀況。根據(jù)熒光強(qiáng)度，將裸鼠隨機(jī)分成4組：對(duì)照組、TRAIL組、TRAIL-NGR組和RGD-TRAIL-NGR組，每組5只，其中融合蛋白組以TRAIL-NGR組劑量10mg·kg^-1為基準(zhǔn)，TRAIL和RGD-TRAIL-NGR組分別給予相同摩爾質(zhì)量的劑量，接種后的第8天開始通過(guò)尾靜脈注射給藥，每3天注射一次，共給藥4次。29天活體成像后處死動(dòng)物，取各只裸鼠完整的肺組織，用Bouin’s液中固定48h，正常的肺組織呈棕黃色，而癌灶為白色隆起，統(tǒng)計(jì)肺表面的轉(zhuǎn)移瘤結(jié)節(jié)數(shù)。

結(jié)果如圖8所示，TRAIL組與TRAIL-NGR組抑制作用近似，與對(duì)照組有顯著性差異(P<0.05)，而RGD-TRAIL-NGR組更加明顯地抑制了腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，與TRAIL組和TRAIL-NGR組相比差異顯著(P<0.05)。從而證明，RGD-TRAIL-NGR該多靶點(diǎn)融合蛋白具有較好的體內(nèi)治療效果。

序列表

<110> 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所

<120> 一種抗腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的多靶點(diǎn)融合蛋白的制備及用途

<160> 4

<210> 1

<211> 208

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Ala Cys Asp Cys Arg Gly Asp Cys Phe Cys Gly Gly Gly Gly Gly Ser

5 10 15

Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr

20 25 30

Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys

35 40 45

Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His

50 55 60

Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile His

65 70 75 80

Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe Gln

85 90 95

Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln Tyr

100 105 110

Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser

115 120 125

Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser

130 135 140

Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe

145 150 155 160

Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser

165 170 175

Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly Gly Gly Gly Gly Ser Cys Asn Gly

180 185 190

Arg Cys Val Ser Gly Cys Ala Gly Arg Cys His His His His His His

195 200 205

<210> 2

<211> 624

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gcttgtgatt gtagaggaga ctgtttttgt ggtggtggtg gtggtagtgt tagagaaaga 60

ggacctcaga gagttgctgc ccatatcact ggaacaagag gtagatccaa cactttgtct 120

tccccaaact caaagaatga aaaagccctt ggaagaaaga ttaattcttg ggagtcaagt 180

agatctggtc attccttttt gtcaaacttg caccttagaa atggagaact tgttattcat 240

gagaagggtt tctactacat ctactctcaa acctacttca gattccagga agagattaag 300

gaaaacacta agaatgataa gcaaatggtc cagtacatct acaaatacac aagttaccca 360

gaccctatct tgcttatgaa gtctgcaaga aacagttgtt ggtctaaaga tgctgagtat 420

ggattgtaca gtatctacca aggtggaatc tttgaactta aggagaacga cagaattttc 480

gtttccgtca ctaatgaaca tttgatcgat atggaccacg aggcttcctt tttcggtgcc 540

tttttggttg gtggaggtgg aggttcatgt aacggaagat gcgtctctgg atgtgctgga 600

agatgccacc accaccacca ccac 624

<210> 3

<211> 192

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr

5 10 15

Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys

20 25 30

Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His

35 40 45

Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile His

50 55 60

Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe Gln

65 70 75 80

Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln Tyr

85 90 95

Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu MET Lys Ser

100 105 110

Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser

115 120 125

Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe

130 135 140

Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser

145 150 155 160

Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly Gly Gly Gly Gly Ser Cys Asn Gly

165 170 175

Arg Cys Val Ser Gly Cys Ala Gly Arg Cys His His His His His His

180 185 190

<210> 4

<211> 576

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gttagagaaa gaggacctca gagagttgct gcccatatca ctggaacaag aggtagatcc 60

aacactttgt cttccccaaa ctcaaagaat gaaaaagccc ttggaagaaa gattaattct 120

tgggagtcaa gtagatctgg tcattccttt ttgtcaaact tgcaccttag aaatggagaa 180

cttgttattc atgagaaggg tttctactac atctactctc aaacctactt cagattccag 240

gaagagatta aggaaaacac taagaatgat aagcaaatgg tccagtacat ctacaaatac 300

acaagttacc cagaccctat cttgcttatg aagtctgcaa gaaacagttg ttggtctaaa 360

gatgctgagt atggattgta cagtatctac caaggtggaa tctttgaact taaggagaac 420

gacagaattt tcgtttccgt cactaatgaa catttgatcg atatggacca cgaggcttcc 480

tttttcggtg cctttttggt tggtggaggt ggaggttcat gtaacggaag atgcgtctct 540

ggatgtgctg gaagatgcca ccaccaccac caccac 576