本發(fā)明屬于生物樣品檢測領域，涉及體液循環(huán)DNA定量檢測方法及試劑盒。

背景技術(shù)：

循環(huán)DNA(circulating DNA)又稱為無細胞狀態(tài)DNA(cell-free DNA)，存在于體液，如血液(血漿或血清)、尿液、腦脊液以及滑膜液的細胞外DNA。體液循環(huán)DNA的定量檢測結(jié)果受到多種因素影響，會產(chǎn)生較大偏差，其中在核酸提取和長期保存過程中DNA的丟失和降解是其中兩個最主要的影響因素。

由于體液樣本中循環(huán)DNA含量較低，因此需要采用基因擴增手段進行定量分析?；驍U增檢測需要對核酸進行提取，由于提取過程中核酸的丟失，其定量結(jié)果無法反映體液循環(huán)DNA的真實水平；另一方面，各種核酸提取方法的提取效率存在很大差異，且核酸提取的重復性差，會在很大程度上影響定量檢測結(jié)果的一致性。同時，無論是原始或純化后的DNA樣本，在長期保存過程中存在不同程度的降解，DNA年降解率甚至高達30％，這種變化對于定量檢測結(jié)果的準確性和最終結(jié)論會產(chǎn)生巨大的影響。正因為如此，體液循環(huán)DNA定量檢測分析一直都沒有準確穩(wěn)定的標準化方法。

傳統(tǒng)的體液循環(huán)DNA定量方法包括熒光定量PCR外標法和PicoGreen熒光法。熒光定量PCR外標法是針對人看家基因的單重熒光定量PCR，通過已知濃度的外部標準品建立標準曲線，對待測樣本進行定量分析，由于標準品和待測樣本分別在不同的試管中進行操作，其管間差異較大，影響定量結(jié)果的精密度和穩(wěn)定性。PicoGreen熒光法采用PicoGreen熒光染料與雙鏈DNA非特異性結(jié)合，結(jié)合后熒光強度顯著增加，通過已知濃度的外部標準品建立標準曲線，從而對待測樣本進行定量分析，由于是直接檢測而未對DNA進行擴增，該方法檢測靈敏度較熒光定量PCR法低，且存在較大的管間差異，影響定量結(jié)果的精密度和穩(wěn)定性。為了解決上述問題，發(fā)明人前期設計了血漿循環(huán)DNA內(nèi)標法定量檢測，詳見CN1811387，雖然較PCR外標法和PicoGreen熒光法有一定程度的改進，然而由于內(nèi)標序列與引物序列設計的問題，造成內(nèi)標與目的基因擴增目的片段長度不同，導致兩者在雙重熒光PCR反應過程中的擴增效率不一致，對其定量檢測結(jié)果仍然存在顯著影響。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種體液循環(huán)DNA定量檢測方法。

本發(fā)明的另一目的是提供一種體液循環(huán)DNA定量檢測試劑盒。

一種非疾病診斷與治療用途的體液循環(huán)DNA定量檢測方法，包括：

人工合成帶有“A”粘性末端、長度為45bp的線性雙鏈DNA片段，線性雙鏈DNA片段中有25bp序列與β-actin基因相同，該線性雙鏈DNA片段與T-Vector pMD20質(zhì)粒載體重組后，得到長度為2781bp的環(huán)狀重組質(zhì)粒DNA，經(jīng)限制性內(nèi)切酶Sma I酶切為線性雙鏈DNA和紫外分光光度法定量后以一定量加入到待測樣本中作為內(nèi)標(圖1)；提取待測樣本的總DNA，同時包含待測循環(huán)DNA和內(nèi)標，采用雙重實時熒光定量PCR法同時擴增循環(huán)DNA中的人看家基因β-actin和內(nèi)標，按照內(nèi)標的濃度計算被測體液中β-actin基因濃度，以此得出循環(huán)DNA含量；其中，雙重實時熒光定量PCR反應體系中包含：共用下游引物、分別針對內(nèi)標和β-actin基因的上游引物、以及分別標記JOE和FAM熒光基團的兩個Taqman水解探針，JOE標記的探針針對β-actin基因，F(xiàn)AM標記的探針針對內(nèi)標，同步進行基因擴增定量檢測；所述的線性雙鏈DNA片段序列如SEQ ID NO.1所示；

在雙重實時熒光定量PCR擴增內(nèi)標時，上游引物如SEQ ID NO.2所示，下游引物如SEQ ID NO.3所示，Taqman水解探針如SEQ ID NO.4所示，5’端標記熒光報告基團FAM；

在雙重實時熒光定量PCR擴增β-actin基因時，上游引物如SEQ ID NO.5所示，共用下游引物同內(nèi)標擴增下游引物如SEQ ID NO.3所示，Taqman水解探針序列如SEQ ID NO.6所示，5’端標記熒光報告基團JOE。

本發(fā)明所述的非疾病診斷與治療用途的體液循環(huán)DNA定量檢測方法優(yōu)選：每200ul體液樣本中加入濃度為1×10⁴拷貝/ul的內(nèi)標5ul，內(nèi)標總拷貝數(shù)為5×10⁴，充分混勻后立即檢測或可長期-20℃以下冷凍保存。

本發(fā)明所述的非疾病診斷與治療用途的體液循環(huán)DNA定量檢測方法優(yōu)選：PCR擴增總反應體系25μl，其中，10×Real Time PCR buffer 2.5μl；dNTPs 400μM；MgCl₂ 6mM；內(nèi)標和β-actin基因的上游引物各200nM；共用下游引物700nM；內(nèi)標和β-actin基因的TaqMan水解探針各100nM；TaKaRa Ex熱啟動DNA聚合酶1U；循環(huán)DNA為2.5μl。

本發(fā)明所述的非疾病診斷與治療用途的循環(huán)DNA定量檢測方法優(yōu)選：PCR擴增反應條件：(1)95℃，5min(2)94℃，30s；55℃，30s；72℃，40s，分別在JOE和FAM熒光信號通道上檢測一次熒光信號，共40個循環(huán)。

本發(fā)明所述的非疾病診斷與治療用途的體液循環(huán)DNA定量檢測方法優(yōu)選：①雙重實時熒光定量PCR結(jié)果采用7500system SDS軟件進行分析，分別在JOE和FAM兩個通道設定基線和閾值，基線起始點為6或其它不小于5的數(shù)，終點為在熒光信號開始升高處再往前2個循環(huán)數(shù)，閾值設定在低熒光信號指數(shù)擴增區(qū)，以此確定目的基因β-actin和內(nèi)標擴增Ct值，以Ct_b和Ct_i表示；②采用LinRegPCR軟件，計算各樣本的PCR擴增效率，以E表示；③以下述公式計算血漿DNA含量，單位為拷貝/ml，并以1拷貝雙鏈DNA≈3.3×10^-3ng計算血漿DNA濃度，單位為ng/ml：

C_b＝C_i×(1+E)^(Cti-Ctb)

公式中C_b和C_i分別表示血漿中β-actin基因和內(nèi)標的起始模板濃度，單位為拷貝/ml，E表示PCR擴增效率，Ct_b和Ct_i分別表示β-actin基因和內(nèi)標的臨界循環(huán)數(shù)。

一種體液循環(huán)DNA定量檢測試劑盒，其特征在于包含以下組分：

(1)內(nèi)標：含序列如SEQ ID NO.1所示的線性雙鏈DNA片段的T-Vector pMD20重組線性質(zhì)粒；

(2)如SEQ ID NO.2所示的內(nèi)標的上游引物；

(3)如SEQ ID NO.4所示且5’端標記熒光報告基團FAM的內(nèi)標Taqman水解探針序列；

(4)如SEQ ID NO.5所示的β-actin基因的上游引物；

(5)如SEQ ID NO.6所示且5’端標記熒光報告基團JOE的β-actin基因的Taqman水解探針序列；

(6)如SEQ ID NO.3所示的內(nèi)標和β-actin基因共用的下游引物。

其中，內(nèi)標的濃度優(yōu)選1.0×10⁴拷貝/μl。

本發(fā)明試劑盒中還包含10Real Time PCR buffer、dNTPs、MgCl₂、TaKaRa Ex熱啟動DNA聚合酶等組分。

有益效果：

針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明進行了如下改進：①重新設計了插入的雙鏈DNA片段，CN1811387中為避免內(nèi)標與β-actin基因相互干擾，設計的人工合成DNA片段長度為41bp，且與β-actin基因具有完全不同的序列，與人類基因組也完全不同源；本發(fā)明通過大量的實驗探索，發(fā)現(xiàn)將線性雙鏈DNA片段長度增長至45bp，且其中有25bp序列與β-actin基因相同不僅不會造成內(nèi)標與β-actin基因相互干擾，并且能夠提高擴增效率的一致性；②采用線性質(zhì)粒載體T-Vector pMD20；③重新設計了共用下游引物序列；④內(nèi)標和β-actin基因擴增產(chǎn)物長度均為91bp。通過上述措施的聯(lián)合使用，使得β-actin基因和內(nèi)標能夠在同一反應管中進行效率相同且互不干擾的PCR擴增反應，其擴增信號能夠被分別檢測，從而顯著提高了定量方法的性能，經(jīng)過與我們前期內(nèi)標法(即CN1811387中權(quán)利要求1請求保護的方法，下同)以及其它2種傳統(tǒng)方法(即熒光定量PCR外標法和PicoGreen熒光法，下同)的比較，該體液循環(huán)DNA定量檢測方法具有更高的精密度、線性范圍、準確性和穩(wěn)定性。

附圖說明

圖1內(nèi)標制備流程圖

圖2克隆載體T-Vector pMD20部分序列及外源片段插入位點

圖3循環(huán)DNA定量方法的線性范圍

圖4循環(huán)DNA定量方法的回收率試驗，圖中每一系列從左至右依次為本發(fā)明方法、前期內(nèi)標法、外標法、熒光法。

圖5不同提取試劑或DNA聚合酶的循環(huán)DNA定量檢測結(jié)果

圖6健康體檢者血漿循環(huán)DNA定量結(jié)果

圖7健康體檢者尿液循環(huán)DNA定量結(jié)果

具體實施方式

實施例1

(1)內(nèi)標的合成

人工合成帶有“A”粘性末端的線性雙鏈DNA片段，序列如下：

5’-ACGGGAAGCGGTTGGTGGTGCGGGAAATCGTGCGTGACATTAAGA-3’

3’-ATGCCCTT CGCCAACCACCACGCCC TTT AGCACGCACTGTAATTC-5’

將人工設計的兩條互補寡核苷酸分別用Tris-EDTA緩沖液稀釋為20μmol/L，等體積混勻，置100℃沸水浴中10min，再放于室溫自然冷卻得到線性雙鏈DNA片段；將線性雙鏈DNA片段重組至質(zhì)粒載體T-Vector pMD20中(插入位點見圖2)，轉(zhuǎn)染至E.coli JM109感受態(tài)細胞，體外培養(yǎng)增殖后接種至含有X-Gal、IPTG、Amp的L-瓊脂平板培養(yǎng)基上，直接篩選含有重組克隆的白色大菌落，再采用M13測序通用引物RV和M4進行菌落PCR產(chǎn)物電泳分析和測序驗證。提取重組質(zhì)粒DNA并純化，經(jīng)限制性內(nèi)切酶Sma I酶切為線性雙鏈DNA，紫外分光光度法測定線性重組質(zhì)粒DNA濃度，稀釋至1.0×10⁴拷貝/μl，作為定量檢測內(nèi)標。

(2)樣本處理和保存

采用兩步離心法處理待測體液樣本：于室溫1600g水平離心10min，小心吸取上清于1.5ml離心管中，再于4℃16000g離心10min，吸取上層無細胞體液樣本，每200μl樣本中加入濃度為1.0×10⁴拷貝/μl的內(nèi)標5μl，振蕩混勻后-70℃保存待用。

(3)體液循環(huán)DNA提取純化

采用傳統(tǒng)酚-氯仿法或商品化核酸提取試劑盒(如柱吸附、磁珠法等)，提取體液循環(huán)DNA。

(4)雙重熒光定量PCR

1)針對β-actin基因的熒光定量PCR引物和探針序列

上游引物(24bp)：5’-GGACCTGACTGACTACCTCATGAA-3’(SEQ ID NO.5)

下游引物(25bp)：5’-CTTAATGTCACGCACGATTTCCCGC-3’(SEQ ID NO.3)

Taqman探針(22bp)：5’-JOE-CACCGAGCGCGGCTACAGCTTC-ECLIPSE-3’(SEQ ID NO.6)

β-actin基因擴增產(chǎn)物序列(91bp)：

5’-GGACCTGACTGACTACCTCATGAAGATCCTCACCGAGCGCGGCTACAGCTTCACCACCACGGCCGAGCGGGAAATCGTGCGTGACATTAAG-3’(SEQ ID NO.8)

2)針對內(nèi)標的熒光定量PCR引物和探針序列

上游引物(24bp)：5’-TGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAG-3’(SEQ ID NO.2)

下游引物(25bp)：5’-CTTAATGTCACGCACGATTTCCCGC-3’(SEQ ID NO.3)

Taqman探針(22bp)：5’-FAM-CGCTTCCCGTAATCCATATGAC-ECLIPSE-3’(SEQ ID NO.4)

內(nèi)標擴增產(chǎn)物序列(91bp)：

5’-TGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCTACTAGTCATATGGATTACGGGAAGCGGTTGGTGGTGCGGGAAATCGTGCGTGACATTAAG-3’(SEQ ID NO.7)

PCR擴增反應體系：總體系為25μl。其中，10×Real Time PCR buffer 2.5μl；dNTPs 400μM；MgCl₂ 6mM；上游引物各200nM；共用下游引物700nM；TaqMan水解探針各100nM；TaKaRaEx熱啟動DNA聚合酶1U；循環(huán)DNA為2.5μl。

PCR擴增反應條件：(1)95℃，5min(2)94℃，30s；55℃，30s；72℃，40s，分別在JOE和FAM熒光信號通道上檢測一次熒光信號(共40個循環(huán))。

(5)結(jié)果分析和計算

①熒光定量PCR結(jié)果采用7500system SDS軟件進行分析，分別在FAM和JOE兩個通道設定基線和閾值?；€起始點為6或其它不小于5的數(shù)，終點為在熒光信號開始升高處再往前2個循環(huán)數(shù)，閾值設定在低熒光信號指數(shù)擴增區(qū)，以此確定目的基因β-actin和內(nèi)標擴增Ct值，以Ct_b和Ct_i表示。②采用LinRegPCR軟件，計算各樣本的PCR擴增效率，以E表示。③以下述公式計算體液循環(huán)DNA含量(拷貝/ml)，并以1拷貝雙鏈DNA≈3.310^-3ng計算體液循環(huán)DNA濃度(ng/ml)。

C_b＝C_i×(1+E)^(Cti-Ctb)

公式中C_b和C_i分別表示體液樣本中β-actin基因和內(nèi)標的起始模板濃度(拷貝/ml)，E表示PCR擴增效率，Ct_b和Ct_i分別表示β-actin基因和內(nèi)標的臨界循環(huán)數(shù)。

實施例2方法學考察

所有樣本來自健康體檢者(50例)，采用EDTA-K₂抗凝真空采血管采集肘靜脈血(2ml/管)，室溫靜置96小時后，于室溫1600g水平離心10min，小心吸取上清于1.5ml離心管中，再于4℃16000g離心10min，吸取上層無細胞血漿，混合后磁珠法提取血漿DNA，紫外分光光度法測定吸光度值并計算DNA濃度，將混合血漿用生理鹽水稀釋為1000、100、10、1.0和0.1ng/ml不同濃度。分別采用本發(fā)明方法、前期內(nèi)標法、傳統(tǒng)外標法和熒光法進行檢測比較，方法的具體步驟如下：

本發(fā)明：參見“實施例1”。

前期內(nèi)標法：參見CN1811387中的說明書“具體實施方式”。

外標法：①PCR擴增反應體系：總體系為25μl。其中，10 Real Time PCR buffer 2.5μl；dNTPs400μM；MgCl₂6mM；上游和下游引物各200nM；TaqMan水解探針100nM；TaKaRa Ex熱啟動DNA聚合酶1U；血漿DNA模板投入量為2.5μl。②PCR擴增反應條件：95℃，5min預變性，再94℃，30s；55℃，30s；72℃，40s，循環(huán)反應40次，每次反應在JOE信號通道上檢測一次熒光信號。③結(jié)果計算：熒光定量PCR結(jié)果采用7500system SDS軟件進行分析，在JOE熒光信號通道設定基線和閾值。基線起始點為6或其它不小于5的數(shù)，終點為在熒光信號開始升高處再往前2個循環(huán)數(shù)，閾值設定在低熒光信號指數(shù)擴增區(qū)，以此確定目的基因β-actin擴增Ct值，以濃度分別0.1、1.0、10、100和1000ng/ml的基因組DNA作為外部標準品，建立定量檢測標準曲線，以此計算待測樣本的血漿DNA含量。

熒光法：將PicoGreen熒光染料用TE緩沖液(pH＝7.0)200倍稀釋成工作液，50μl血漿DNA樣本與50μl PicoGreen工作液混勻，室溫避光孵育5min，以480nm為激發(fā)光源波長，在熒光分光光度計中檢測520nm波長的熒光信號，并以濃度分別為0.1、1.0、10、100和1000ng/ml的λDNA為外部標準品，建立定量檢測標準曲線，以此計算待測樣本的血漿DNA含量。

(1)精密度：如表1所示，對于不同濃度的樣本，本發(fā)明方法的批內(nèi)和批間CV值均小于前期內(nèi)標法和傳統(tǒng)方法，特別是對于濃度為1.0ng/ml及其以下的樣本，本發(fā)明方法的檢測精密度較其他方法顯著提高。

表1血漿循環(huán)DNA定量方法的批內(nèi)和批間CV值

(2)線性范圍：如圖3所示，本發(fā)明方法對0.1-1000ng/ml范圍內(nèi)的循環(huán)DNA定量檢測的線性相關(guān)系數(shù)r²達到0.996(圖3A)，較前期內(nèi)標法的線性相關(guān)性顯著提高(圖3B)；傳統(tǒng)外標法和PicoGreen熒光法的線性范圍為1-1000ng/ml(r²分別為0.965和0.961)。

(3)準確度：由于經(jīng)典核酸定量方法檢測靈敏度低，對于微量的循環(huán)DNA無法檢出，缺乏對照方法，因此對于準確度我們采用回收率實驗進行評價，結(jié)果如圖4所示，回收率越接近100％，表明該方法的準確性更高。PCR外標法對1000、100、10和1ng/ml循環(huán)DNA的回收率均值分別為73.1％、77.9％、57.3％和48.6％、；PicoGreen熒光法分別為75.2％、74.6％、61.1％和50.7％、，均低于100％，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。前期內(nèi)標法對1000、100和10ng/ml循環(huán)DNA的回收率均值分別為99.4％、93.7％和94.1％，與100％的回收率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P值均大于0.05)；但是對于1ng/ml的樣本回收率均值為86.2％，低于100％，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，表明前期內(nèi)標法對于濃度為1ng/ml的樣本無法準確定量。本發(fā)明方法對1000、100、10和1ng/ml循環(huán)DNA的回收率均值分別為100.3％、98.7％、102.8％和96.5，與100％的回收率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P值均大于0.05)，顯示了較高的準確性。

(4)穩(wěn)定性：本發(fā)明和傳統(tǒng)方法對采用4種不同試劑提取的循環(huán)DNA進行定量檢測，結(jié)果見圖5A。由于4種試劑對循環(huán)DNA提取效率各不相同，采用傳統(tǒng)外標法和熒光法的定量結(jié)果各不相同，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；前期內(nèi)標法結(jié)果雖然有所改善，但仍然存在差異(P<0.05)；而本發(fā)明方法對采用不同試劑提取的循環(huán)DNA定量結(jié)果沒有差異(P＝0.956)。該結(jié)果表明，無論采用何種提取方法，雖然存在不同程度的核酸提取丟失，本發(fā)明能夠通過內(nèi)標的校準作用，得到穩(wěn)定可靠的定量檢測結(jié)果。

本發(fā)明和前期內(nèi)標法以及傳統(tǒng)PCR外標法采用4種不同廠家(ABI、MBI、Promega和Takara)的Taq DNA聚合酶進行熒光定量PCR擴增，其循環(huán)DNA定量結(jié)果見圖5B。采用不同Taq DNA聚合酶進行內(nèi)標法測定的血漿DNA定量結(jié)果之間的差異無統(tǒng)計學意義，而前期內(nèi)標法和外標法的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。該結(jié)果表明本發(fā)明方法不受DNA聚合酶活性的影響，檢測結(jié)果更加穩(wěn)定可靠。

實施例3健康體檢者血漿樣本檢測

400例健康體檢者,年齡25-60歲，平均年齡43歲，男性200例，女性200例。收集EDTA-K₂抗凝外周靜脈血，兩步離心法分離獲得無細胞血漿標本，采用磁珠法試劑盒提取血漿DNA，分別采用本發(fā)明方法、前期內(nèi)標法、傳統(tǒng)外標法和熒光法進行定量測定，結(jié)果如圖6。本發(fā)明方法檢測結(jié)果顯著高于前期內(nèi)標法、傳統(tǒng)外標法和熒光法，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。本發(fā)明通過內(nèi)標的內(nèi)參照作用，消除了核酸提取丟失造成的測量誤差，因此其定量結(jié)果高于其他方法，且趨勢相對集中，并且發(fā)現(xiàn)男性血漿DNA水平顯著高于女性，而其它方法并未發(fā)現(xiàn)此差異。

實施例4健康體檢者尿液樣本檢測

1000例健康體檢者,年齡25-60歲，平均年齡42歲，男性500例，女性500例。收集晨尿標本，兩步離心法分離獲得無細胞尿液標本，采用磁珠法試劑盒提取尿液DNA，采用本發(fā)明方法進行定量測定，結(jié)果如圖7。健康體檢者尿液DNA定量范圍為1.0～296.4ng/ml(中位值：18.1ng/ml；四分位距：30.5ng/ml)，其中84％其尿液DNA在50ng/ml以下，12％在50-100ng/ml之間，4％超過100ng/ml，尿液DNA水平在該1000例健康人群中呈正偏態(tài)分布(圖7)。不同性別或年齡組之間的尿液DNA含量差異無統(tǒng)計學意義。

<110> 南京麥科林生物醫(yī)藥科技有限公司

<120> 體液循環(huán)DNA定量檢測方法及試劑盒

<160> 8

<210> 1

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 線性雙鏈DNA片段正義鏈序列

<400> 1

acgggaagcg gttggtggtg cgggaaatcg tgcgtgacat taaga 45

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 針對內(nèi)標的熒光定量PCR上游引物

<400> 2

tgcatgcctg caggtcgact ctag 24

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 針對內(nèi)標的熒光定量PCR下游引物

<400> 3

cttaatgtca cgcacgattt cccgc 25

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 針對內(nèi)標的Taqman探針

<400> 4

cgcttcccgt aatccatatg ac 22

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 針對β-actin基因的熒光定量PCR上游引物

<400> 5

ggacctgact gactacctca tgaa 24

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 針對β-actin基因的Taqman探針

<400> 6

caccgagcgc ggctacagct tc 22

<210> 7

<211> 91

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 內(nèi)標擴增產(chǎn)物序列

<400> 7

tgcatgcctg caggtcgact ctagaggatc tactagtcat atggattacg ggaagcggtt 60

ggtggtgcgg gaaatcgtgc gtgacattaa g 91

<210> 8

<211> 91

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> β-actin基因擴增產(chǎn)物序列

<400> 8

ggacctgact gactacctca tgaagatcct caccgagcgc ggctacagct tcaccaccac 60

ggccgagcgg gaaatcgtgc gtgacattaa g 91