本發(fā)明屬于多肽產(chǎn)品合成制備的技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種磷酸化多肽的固相合成方法。

背景技術(shù)：

磷酸化多肽序列：TQN(pS)I(pS)R(pT)AK(pS)TKAERSC，分子量：2288.08。

磷酸化修飾是一種重要的蛋白質(zhì)化學(xué)修飾，對(duì)蛋白質(zhì)功能的完成或改變起到重要作用。生命活動(dòng)與蛋白質(zhì)的動(dòng)態(tài)變化密切相關(guān)，很多情況下某些蛋白質(zhì)的絕對(duì)量并不會(huì)發(fā)生明顯變化，而是通過各種翻譯后完成或改變其功能。在眾多的蛋白質(zhì)翻譯后修飾中，磷酸化修飾時(shí)非常重要的一種，現(xiàn)今發(fā)現(xiàn)的所有蛋白質(zhì)中超過30％可被磷酸化修飾。然而異常的磷酸化也是引起諸多疾病的起因，尤其是突變的蛋白激酶、磷酸酶可導(dǎo)致許多紊亂，很多天然毒素和病原體也是通過改變胞內(nèi)蛋白的磷酸化狀態(tài)來發(fā)揮它們的影響。絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)和酪氨酸(Tyr)的磷酸化作用是一個(gè)可逆的蛋白修飾過程，它們參與調(diào)節(jié)無數(shù)的細(xì)胞活動(dòng)，如受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)締合與分割、激活或抑制蛋白功能，甚至細(xì)胞的存活等。許多激素均是通過提高絲氨酸(Ser)或蘇氨酸(Thr)殘基的磷酸化狀態(tài)來調(diào)節(jié)特異性酶的活性。

傳統(tǒng)合成磷酸化多肽時(shí)需對(duì)磷酸根進(jìn)行保護(hù)，在整個(gè)多肽鏈合成完畢后再進(jìn)行脫保護(hù)，反應(yīng)工藝復(fù)雜，且磷酸化多肽產(chǎn)品收率較低。本發(fā)明提供一種改進(jìn)的磷酸化多肽合成方法，合成操作方便簡(jiǎn)單，反應(yīng)條件溫和，便于磷酸化多肽的快速合成制備。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種磷酸化多肽的固相合成方法，該合成方法反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)效率高、成本低、具有生產(chǎn)磷酸化多肽產(chǎn)品的廣泛應(yīng)用前景。

本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)

一種磷酸化多肽的固相合成方法，該固相合成方法包括以下具體步驟：

(1)選用2-Cl-Resin為起始載體，采用固相合成法，在活化劑和縮合劑的作用下，以Fmoc-保護(hù)氨基酸為縮合原料，依次縮合磷酸化多肽氨基酸序列中相對(duì)應(yīng)的氨基酸，得到磷酸化多肽-2-Cl-Resin；

(2)將磷酸化多肽-2-Cl-Resin進(jìn)行切割沉降反應(yīng)，純化并凍干，得到磷酸化多肽產(chǎn)品。

所述的起始氨基樹脂為2-Cl-Resin，取代度為0.64mmol/g。

步驟(1)中所述縮合反應(yīng)過程中以DIC/HOBT為活化劑和縮合劑，以DMF溶液洗滌多肽樹脂，反應(yīng)中氨基酸投料量為3倍所投樹脂摩爾數(shù)，縮合反應(yīng)時(shí)間為30-60min；以20％Pip/DMF溶液為脫保護(hù)劑，洗脫時(shí)間為20min。

步驟(1)中所述縮合反應(yīng)過程中以HBTU/DIEA為縮合試劑，以DMF:DIEA＝10：1的溶液洗滌多肽樹脂。

步驟(1)中所述Fmoc-保護(hù)氨基酸縮合順序依次為：Fmoc-Cys(trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Asn(trt)-OH、Fmoc-Gln(trt)-OH、Fmoc-Thr(HPO3Bzl)-OH、Fmoc-Ser(HPO3Bzl)-OH，縮合反應(yīng)溫度為25℃。

步驟(2)中所述切割試劑為TFA：茴香硫醚：水：EDT：苯酚＝35：2：2：1：2體積比，切割液體積為反應(yīng)器容積的1/2，樹脂切割兩次，將切割液分別吹入到冰乙醚中，離心沉淀去上清，重復(fù)操作3次。

步驟(2)中所述純化方法指采用高效液相色譜法純化用C18色譜柱，以A相：0.1％乙酸/水，B相：0.1％乙酸/乙腈為流動(dòng)相，以B.Cone/％(2→55)，Time/min(0→30)的梯度進(jìn)行多肽的分離提純，凍干得到磷酸化多肽產(chǎn)品。

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明采用Fmoc固相合成法，以2-ClResin為固相載體，在縮合反應(yīng)過程中采用不同的活化劑和縮合劑進(jìn)行縮合反應(yīng)，以及采用不同的洗滌方法洗滌多肽樹脂，提高了縮合效率，經(jīng)切割沉降、純化得到磷酸化多肽產(chǎn)品。本發(fā)明大大縮短了反應(yīng)時(shí)間，提高了產(chǎn)品的收率，具有可觀的經(jīng)濟(jì)適用價(jià)值和廣泛的應(yīng)用前景。

具體實(shí)施方式

通過下述實(shí)施例將有助于理解本發(fā)明，但不能限制本發(fā)明的內(nèi)容。對(duì)于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡(jiǎn)單替換或推演，都視為屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例一

磷酸化多肽-2-Cl-Resin的合成

1.2-Cl-Resin的溶脹

稱量取代度為0.64mmol/g的2-Cl-Resin1g，從開口端加入至多肽合成反應(yīng)器中，取DCM試劑加入至反應(yīng)器中，使樹脂完全浸沒在DCM溶劑中，與溶劑充分接觸，溶脹0.5h。

2.磷酸化多肽-2-Cl-Resin的合成

磷酸化多肽-2-Cl-Resin為：

TQN(pS)I(pS)R(pT)AK(pS)TKAERSC-2-Cl-Resin

本實(shí)施例使用的保護(hù)氨基酸從樹脂起算第1-18個(gè)氨基酸相對(duì)應(yīng)的保護(hù)氨基酸及分子量如下表所示：

本發(fā)明中一些常用的縮寫具有以下含義：

Fmoc：芴甲氧羰基

Boc：叔丁氧羰基

DMF：N,N-二甲基甲酰胺

DCM：二氯甲烷

Pbf：2,2,4,6,7-五甲基二氫苯并呋喃-5-磺酰

Pip：六氫吡啶

TFA：三氟醋酸

Trt：三苯甲基

tBu：叔丁基

otBu：氧叔丁基

DIC：N,N-二異丙基碳化二亞胺

DIEA：N,N-二異丙基乙胺

HOBT：1-羥基苯并三唑

(1)Fmoc-Cys(trt)-2-Cl-Resin的合成

稱取210mg Fmoc-Cys(trt)-OH和230mg HOBT放于10ml離心管中，加5ml DCM將其溶解，再用滴管向溶液中加DIEA活化20s，混合均勻。最后將混合液加到抽干的反應(yīng)器中反應(yīng)1h。

(2)Fmoc-Cys(trt)-2-Cl-Resin的封頭反應(yīng)

配制甲醇：DIEA＝1:1(體積比)的混合液2ml，將其加入到抽干的反應(yīng)器中，置于20-30r/min的搖床上搖20min。

(3)樹脂的洗滌方法

用真空泵將反應(yīng)器中的脫保護(hù)溶液抽干，然后加入1/3-1/2反應(yīng)器體積的DMF溶液，置于30r/min的脫色搖床上搖1min，抽干反應(yīng)器中溶液再加入DMF洗滌，重復(fù)操作3次。

(4)脫除Fmoc保護(hù)基

加入1/3-1/2反應(yīng)器體積的20％哌啶/DMF脫保護(hù)溶液到抽干的反應(yīng)器中，置于30r/min的脫色搖床上搖晃反應(yīng)20min。

(5)保護(hù)氨基酸的活化方法

以Fmoc-Ser(tBu)-Cys(trt)-2-Cl-Resin的縮合為例，稱取684mg Fmoc-Ser(tBu)-OH和230mg HOBT放于10ml離心管中，加入5ml DMF將其溶解，再用滴管向溶液中加DIC活化20s，混合均勻得到活化的保護(hù)氨基酸溶液。

(6)磷酸化氨基酸的縮合

以HBTU/DIEA為縮合試劑加入到反應(yīng)器中，縮合反應(yīng)30-60min后，用DMF溶液洗滌樹脂，然后按照上述方法脫除磷酸化氨基酸的Fmoc保護(hù)基，以DMF:DIEA＝10：1的溶液洗滌樹脂1次，之后再以DMF溶液洗滌樹脂3次。

(7)磷酸化多肽-2-Cl-Resin的合成

將上述活化的保護(hù)氨基酸溶液加到抽干的反應(yīng)器中，再將反應(yīng)器置于25℃的恒溫震蕩器中反應(yīng)30-60min，洗滌，脫保護(hù)，再洗滌。采用上述同樣方法，依次縮合第2-18個(gè)Fmoc-保護(hù)氨基酸，即得到磷酸化多肽-2-Cl-Resin。

實(shí)施例二

磷酸化多肽-2-Cl-Resin的切割沉降

(1)配置切割試劑

100ml配方為:87.5mlTFA+5ml茴香硫醚+5ml水+2.5mlEDT+5g苯酚，置于棕色試劑瓶中。現(xiàn)配備用，配制量一般為1g樹脂加10ml切割試劑。

(2)磷酸化多肽-2-Cl-Resin的切割

向抽干的反應(yīng)器中加入切割試劑，置于脫色搖床上搖晃反應(yīng)1h，速度20r/min。切割結(jié)束后，加入約35ml冰乙醚至50ml離心管中，將反應(yīng)器中溶液經(jīng)砂芯過濾到冰乙醚中，蓋上離心管蓋子，上下震蕩離心管，混合均勻。將離心管放入離心機(jī)中，3000r/min，3min，離心棄上清，重復(fù)操作3次得到磷酸化多肽粗肽產(chǎn)品。

實(shí)施例三

磷酸化多肽的純化

切割沉降后的磷酸化多肽呈乳膠狀態(tài)，其中含有較多的TFA鹽和切割試劑，本發(fā)明采用C18色譜柱進(jìn)行除鹽，以便計(jì)算粗品得率。

將樣品溶解并過濾，采用流動(dòng)相：A 0.1％乙酸/水，B 0.1％乙酸/乙腈，在214nm下按照如下程序進(jìn)樣洗脫：

稱量?jī)龈珊蟮牧姿峄嚯漠a(chǎn)品，經(jīng)分析計(jì)算，產(chǎn)品純度為95％，其純品收率為71.8％，比現(xiàn)有技術(shù)僅30-50％的收率有大幅度提高。

以上內(nèi)容僅僅是對(duì)本發(fā)明所作的舉例和說明，所屬本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員對(duì)所描述的具體實(shí)施例做各種各樣的修改或補(bǔ)充或采用類似的方式替代，只要不偏離發(fā)明或者超越本權(quán)利要求書所定義的范圍，均應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。