本發(fā)明涉及一種含特異性免疫激活功能結(jié)構(gòu)域并能高效誘導(dǎo)魚(yú)類(lèi)產(chǎn)生Hepcidin的人工合成CpG-ODN制劑及其在魚(yú)類(lèi)先天免疫抗菌中的應(yīng)用。

(二)

背景技術(shù)：

隨著我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展，魚(yú)類(lèi)病害頻發(fā)并日趨嚴(yán)重，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。同時(shí)由于抗生素和殺蟲(chóng)劑的大量使用，引起了環(huán)境污染、病原耐藥和食品安全等問(wèn)題，嚴(yán)重影響了水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展和人們的身體健康。隨著國(guó)家出臺(tái)了一系列嚴(yán)格的食品安全標(biāo)準(zhǔn)，一大批抗生素已被禁止應(yīng)用于水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)正面臨無(wú)藥可施的困難局面。因此，亟待研制和開(kāi)發(fā)安全、無(wú)公害和環(huán)境友好型的新型、高效的魚(yú)類(lèi)抗病技術(shù)和抗病制劑。其中免疫防御技術(shù)代表了重要的發(fā)展方向。

Hepcidin是一種主要由肝臟表達(dá)的生物活性因子，具有抗菌肽和鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)素的雙重生物學(xué)功能。它能通過(guò)直接的殺菌作用與間接的降低血清鐵濃度而抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的作用，實(shí)現(xiàn)有效的免疫抗病，因此是免疫抗病制劑開(kāi)發(fā)應(yīng)用中最為受到關(guān)注的重要因子之一。當(dāng)前對(duì)于Hepcidin的開(kāi)發(fā)應(yīng)用主要見(jiàn)諸對(duì)其基因的克隆與外源性重組表達(dá)，而對(duì)于通過(guò)調(diào)控內(nèi)源性Hepcidin表達(dá)而實(shí)現(xiàn)免疫抗病的技術(shù)尚不多見(jiàn)。外源性重組表達(dá)的Hepcidin制劑雖能有效抑制病原菌的侵染，但存在生產(chǎn)成本高、儲(chǔ)存和使用過(guò)程中易于失活、不利于大規(guī)模應(yīng)用等缺點(diǎn)，特別是由于外源性重組表達(dá)的Hepcidin制劑不利于應(yīng)用在較大規(guī)模的水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域。因此，通過(guò)開(kāi)發(fā)內(nèi)源性Hepcidin高效誘導(dǎo)表達(dá)技術(shù)而實(shí)現(xiàn)免疫抗病是一條重要的替代性途徑。

含胞嘧啶鳥(niǎo)嘌呤基序的寡脫氧核糖核酸(CpG-ODN)制劑是一類(lèi)重要的免疫調(diào)節(jié)因子。CpG-ODN具有制備成本低、產(chǎn)品穩(wěn)定、屬于核酸制劑無(wú)毒副作用、在環(huán)境中易于降解而不富集、安全高效和環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)，因此是極富應(yīng)用價(jià)值的免疫抗病制劑。但CpG-ODN具有種屬特異性、組織細(xì)胞特異性和特定基因調(diào)控的特異性。不同物種中產(chǎn)生免疫學(xué)效應(yīng)的CpG-ODN的序列、組成與結(jié)構(gòu)均不盡相同，同一物種中不同細(xì)胞和基因活化所需的CpG-ODN的類(lèi)型也不盡相同。因此，對(duì)于不同的物種以及不同的細(xì)胞和基因，需要有針對(duì)性地開(kāi)展設(shè)計(jì)、改造和篩選。CpG-ODN還具有刺激型和抑制型兩種不同的類(lèi)型，前者具有激活免疫系統(tǒng)的功能，而后者具有抑制免疫系統(tǒng)的功能，這擴(kuò)大了CpG-ODN制劑的應(yīng)用范圍，但同時(shí)也增加了其開(kāi)發(fā)應(yīng)用中設(shè)計(jì)和篩選的難度。CpG-ODN的免疫刺激和抑制功能由多種因素所決定，包括寡核苷酸鏈的長(zhǎng)度、核苷酸的組成、CpG核心區(qū)兩翼序列的結(jié)構(gòu)以及關(guān)鍵核苷酸的修飾狀態(tài)等，這些參數(shù)需要結(jié)合功能評(píng)價(jià)進(jìn)行篩選和優(yōu)化。我們通過(guò)對(duì)候選CpG-ODN序列的特殊設(shè)計(jì)，使得篩選出的序列片段具有合適的寡核苷酸鏈長(zhǎng)度、CG島數(shù)量、硫代磷酸骨架位點(diǎn)和高效特異結(jié)合宿主CpG受體Toll-like receptor 9(TLR9)的高級(jí)結(jié)構(gòu)，經(jīng)篩選的CpG-ODN序列具有高效誘導(dǎo)魚(yú)類(lèi)抗菌肽Hepcidin表達(dá)的功能。

本發(fā)明針對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物魚(yú)類(lèi)物種，以刺激肝臟組織中Hepcidin基因表達(dá)為目的，系統(tǒng)開(kāi)展了刺激型CpG-ODN的設(shè)計(jì)、合成、修飾、篩選與功能評(píng)價(jià)等研究。利用模式實(shí)驗(yàn)動(dòng)物斑馬魚(yú)研究模型，從預(yù)設(shè)計(jì)合成的19條候選CpG-ODN中，篩選到兩條能高效誘導(dǎo)斑馬魚(yú)肝臟表達(dá)Hepcidin的CpG-ODN序列。功能研究顯示，這兩條CpG-ODN能在顯著誘導(dǎo)肝臟表達(dá)Hepcidin的同時(shí)，降低血清中的鐵離子濃度，從而抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。此外，CpG-ODN還抑制細(xì)菌表達(dá)OmpA膜蛋白，增強(qiáng)補(bǔ)體對(duì)細(xì)菌的殺傷力。免疫抗病試驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明所獲得的CpG-ODN能顯著保護(hù)實(shí)驗(yàn)魚(yú)免受嗜水氣單胞菌的感染，發(fā)病死亡率顯著降低。

(三)

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是人工合成魚(yú)類(lèi)種屬和組織特異性CpG-ODN，用于誘導(dǎo)肝臟組織表達(dá)Hepcidin。利用斑馬魚(yú)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，通過(guò)體內(nèi)導(dǎo)入CpG-ODN，并結(jié)合Hepcidin表達(dá)分析、抗體阻斷試驗(yàn)、鐵離子含量測(cè)定、細(xì)菌生長(zhǎng)抑制測(cè)定等功能評(píng)價(jià)試驗(yàn)，從預(yù)設(shè)計(jì)的19條含不同結(jié)構(gòu)類(lèi)型的CpG-ODN序列中，篩選出兩種符合C型結(jié)構(gòu)特征的CpG-ODN。發(fā)現(xiàn)其能特異性提高肝臟中Hepcidin的表達(dá)，降低血清中鐵離子濃度，抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，顯著提高實(shí)驗(yàn)魚(yú)對(duì)嗜水氣單胞菌等病原菌感染的免疫保護(hù)力。建立了一種利用誘導(dǎo)內(nèi)源性Hepcidin高效表達(dá)從而實(shí)現(xiàn)魚(yú)類(lèi)免疫抗病的新技術(shù)。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

本發(fā)明提供一種魚(yú)類(lèi)Hepcidin表達(dá)促進(jìn)劑，所述促進(jìn)劑為下列之一：CpG-ODN-C4：TCGTCGTCGAGCGAGGCAGTCGTT和

CpG-ODN-C5：GTCGTTTCGACGGGTGCAGTCGTT。

本發(fā)明還提供一種所述魚(yú)類(lèi)Hepcidin表達(dá)促進(jìn)劑在制備免疫制劑中的應(yīng)用。

進(jìn)一步，所述免疫制劑為嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)感染免疫抑制劑。

進(jìn)一步，所述免疫制劑為溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)感染免疫抑制劑。

本發(fā)明采用生物信息學(xué)結(jié)構(gòu)模擬技術(shù)，設(shè)計(jì)各種頸環(huán)結(jié)構(gòu)特征的19種CpG-ODN序列，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。將19種CpG-ODN分別逐條注射斑馬魚(yú)，用熒光定量RT-PCR技術(shù)測(cè)定刺激前后肝臟組織中Hepcidin轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(mRNA)的變化水平，進(jìn)行劑量依賴(lài)性統(tǒng)計(jì)分析。利用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS)測(cè)定刺激前后實(shí)驗(yàn)魚(yú)血清鐵離子濃度，利用平板抑菌試驗(yàn)測(cè)定細(xì)菌生長(zhǎng)能力，然后統(tǒng)計(jì)分析肝臟Hepcidin誘導(dǎo)表達(dá)、血清鐵離子濃度下降以及細(xì)菌生長(zhǎng)抑制間的相關(guān)性。利用嗜水氣單胞菌敗血癥感染模型，通過(guò)死亡率和成活率的統(tǒng)計(jì)分析，測(cè)定CpG-ODN的免疫保護(hù)功能。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明有益效果主要體現(xiàn)在：本發(fā)明所述促進(jìn)劑能高效誘導(dǎo)抗菌肽Hepcidin表達(dá)，繼而大大提高魚(yú)類(lèi)針對(duì)細(xì)菌性感染時(shí)的存活率。同時(shí)，本發(fā)明所提供的促進(jìn)劑為一類(lèi)無(wú)污染的短核苷酸序列，能在自然環(huán)境中分解。相對(duì)于傳統(tǒng)的抗生素、磺胺類(lèi)抗菌藥，本發(fā)明所提供的促進(jìn)劑制備的抗菌免疫制劑是一種典型的具有高效抗菌功能的環(huán)境友好型制劑。

(四)附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明所設(shè)計(jì)的各型CpG-ODN以及嗜水氣單胞菌基因組DNA(A.h DNA)對(duì)斑馬魚(yú)抗菌肽Hepcidin誘導(dǎo)作用的熒光定量RT-PCR檢測(cè)結(jié)果；

圖2是CpG-ODN-C4和CpG-ODN-C5對(duì)斑馬魚(yú)抗菌肽Hepcidin的刺激作用的熒光定量PCR，ELISA和Western Blot的檢測(cè)結(jié)果；A為CpG-ODN-C4誘導(dǎo)肝臟組織Hepcidin轉(zhuǎn)錄水平變化，B為CpG-ODN-C5誘導(dǎo)肝臟組織Hepcidin轉(zhuǎn)錄水平變化，C為CpG-ODN-C4誘導(dǎo)血清中Hepcidin蛋白濃度變化，D為CpG-ODN-C5誘導(dǎo)血清中Hepcidin蛋白濃度變化，E為CpG-ODN-C4和CpG-ODN-C5刺激后Western Blot檢測(cè)血清中Hepcidin表達(dá)濃度變化。

圖3是經(jīng)Hepcidin抗體處理后斑馬魚(yú)血清抑菌能力變化的檢測(cè)結(jié)果；A為CpG-ODN-C4刺激后斑馬魚(yú)血清抑菌動(dòng)力學(xué)曲線測(cè)定，B為CpG-ODN-C5刺激后斑馬魚(yú)血清抑菌動(dòng)力學(xué)曲線測(cè)定。

圖4是CpG-ODN-C4和CpG-ODN-C5注射斑馬魚(yú)后血清中亞鐵離子濃度變化的檢測(cè)結(jié)果；A為CpG-ODN-C4刺激后斑馬魚(yú)血清鐵離子濃度變化，B為CpG-ODN-C5刺激后斑馬魚(yú)血清鐵離子濃度變化。

圖5是CpG-ODN-C4和CpG-ODN-C5增強(qiáng)斑馬魚(yú)抵抗嗜水氣單胞菌的免疫保護(hù)作用；A為CpG-ODN-C4刺激后A.h細(xì)菌侵染條件下斑馬魚(yú)存活數(shù)統(tǒng)計(jì)，B為CpG-ODN-C5刺激后A.h細(xì)菌侵染條件下斑馬魚(yú)存活數(shù)統(tǒng)計(jì)，C為CpG-ODN-C4刺激后V.a細(xì)菌侵染條件下斑馬魚(yú)存活數(shù)統(tǒng)計(jì)，D為CpG-ODN-C5刺激后V.a細(xì)菌侵染條件下斑馬魚(yú)存活數(shù)統(tǒng)計(jì)。

(五)具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此：

實(shí)施例1、具有潛在激活魚(yú)類(lèi)Hepcidin表達(dá)能力的CpG-ODN序列的設(shè)計(jì)與合成：

本發(fā)明所設(shè)計(jì)的CpG-ODN均為偏酸性無(wú)甲基化修飾，部分或全序列硫代修飾的寡核苷酸片段，所設(shè)計(jì)的各型CpG-ODN的序列見(jiàn)表1(名稱(chēng)標(biāo)注為字母加數(shù)字，字母代表其CpG-ODN類(lèi)型，硫代修飾位點(diǎn)字體加粗)。CpG-ODN序列由上海捷瑞生物工程有限公司利用德國(guó)PolyGen 96柱DNA/RNA合成工作站代為合成。

表1.本發(fā)明所設(shè)計(jì)的CpG-ODN序列

實(shí)施例2、熒光定量RT-PCR檢測(cè)各型CpG-ODN對(duì)斑馬魚(yú)Hepcidin的誘導(dǎo)作用：

實(shí)驗(yàn)魚(yú)為實(shí)驗(yàn)室繁育的斑馬魚(yú)(體重3-4克)，飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)28℃恒溫飼養(yǎng)設(shè)施，實(shí)驗(yàn)前訓(xùn)化并觀察2周，確認(rèn)健康后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將人工合成的各型CpG-ODN用滅菌PBS稀釋為1.0μM的濃度，分別以腹腔注射的方式注射成體斑馬魚(yú)，注射體積為10μL。24h后提取斑馬魚(yú)的肝臟組織，另設(shè)置以相同體積的PBS注射的斑馬魚(yú)肝臟組織作為陰性對(duì)照。按照Trizol試劑盒的說(shuō)明，從斑馬魚(yú)肝臟中提取總RNA，利用TaKaRa的3-Full RACE Core Set試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以該cDNA作為模板，用引物Hepcidin F1、R1對(duì)抗菌肽Hepcidin的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平進(jìn)行熒光定量PCR(以下簡(jiǎn)稱(chēng)qPCR)檢測(cè)。熒光定量PCR擴(kuò)增體系組成見(jiàn)表2；PCR引物見(jiàn)表3；qPCR程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3分鐘，95℃變性15秒，60℃退火15秒，72℃延伸20秒，共40個(gè)循環(huán)，以β-actin的表達(dá)作為內(nèi)參，qPCR結(jié)果用2^-ΔΔCt值法處理分析Hepcidin的相對(duì)表達(dá)差異。結(jié)果顯示，在同一濃度刺激的條件下，本發(fā)明所設(shè)計(jì)的CpG-ODN-C4和CpG-ODN-C5CpG-ODN對(duì)Hepcidin表達(dá)的誘導(dǎo)刺激作用最高，與其他實(shí)驗(yàn)組相比較，顯著性上調(diào)了Hepcidin表達(dá)(圖1)。注：“*”號(hào)表示數(shù)據(jù)間有顯著性差異(P<0.05)。

表2.斑馬魚(yú)Hepcidin qPCR擴(kuò)增體系

表3.斑馬魚(yú)Hepcidin qPCR引物

實(shí)施例3、CpG-ODN-C4和CpG-ODN-C5誘導(dǎo)Hepcidin表達(dá)的劑量依賴(lài)效應(yīng)

分別以0.5μg、1.0μg和1.5μg的濃度(將人工合成的CpG-ODN用滅菌PBS稀釋)，將合成的CpG-ODN-C4和CpG-ODN-C5腹腔注射成體斑馬魚(yú)，注射量為10μL；另設(shè)對(duì)照組，即以10μL的無(wú)菌生理鹽液(PBS)腹腔注射成體斑馬魚(yú)。注射后24小時(shí)，分別提取斑馬魚(yú)的肝臟組織與血液。肝臟RNA提取以及逆轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR檢測(cè)過(guò)程同實(shí)施例2內(nèi)容，相關(guān)qPCR體系參見(jiàn)表2，Hepcidin引物序列參見(jiàn)表3。血液于4℃靜置4h后離心取血清，用ELISA法測(cè)定血清中Hepcidin蛋白濃度；同時(shí)將血清進(jìn)行Western Blot檢測(cè)。

ELISA實(shí)驗(yàn)包被液為：Na₂CO₃ 1.59g，NaHCO₃ 2.94g，雙蒸水定容至1L并調(diào)pH值為9.6。封閉液為：1L PBS中加入0.05g BSA以及10μL Tween-20。底物溶液為：配制底物緩沖液Na₂HPO₄·12H₂O 9.2g加檸檬酸2.35g加水定容至500mL并調(diào)pH至5.0。取底物緩沖液9.5mL加TMB 0.5mL及40μL 0.75％的H₂O₂混合后即為底物液(底物液需現(xiàn)配，配制完成15分鐘內(nèi)使用)。ELISA實(shí)驗(yàn)采用抗原(血清中的Hepcidin)包被的間接法：將各血清組測(cè)量蛋白濃度，濃度調(diào)為一致后以1比100的稀釋倍數(shù)用包被液4℃包被12小時(shí)，然后使用本實(shí)驗(yàn)室制備的兔抗Hepcidin多克隆抗體以及購(gòu)自Promega公司的羊抗兔IgG-HRP進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)，底物液顯色終止后利用酶標(biāo)儀讀取各實(shí)驗(yàn)孔吸光值OD450和OD630的數(shù)值，將每孔OD450的數(shù)值減去OD630的數(shù)值后即為待測(cè)血清中Hepcidin的相對(duì)濃度值。Western blot實(shí)驗(yàn)封閉液為：10mL PBS中加入5mg BSA。顯色液為：選用購(gòu)自美國(guó)Millipore公司的Immobilon Western HRP底物化學(xué)發(fā)光試劑盒(A液與B液等比例混勻使用)。

結(jié)果顯示，經(jīng)CpG-ODN-C4及CpG-ODN-C5注射刺激后的斑馬魚(yú)Hepcidin表達(dá)量顯著上升，且對(duì)兩種CpG-ODN的刺激具有濃度劑量效應(yīng)(圖2)。注：“*”號(hào)表示數(shù)據(jù)間有顯著性差異(P<0.05)，“**”號(hào)表示數(shù)據(jù)間有極顯著差異(P<0.01)。

實(shí)施例4、CpG-ODN-C4和CpG-ODN-C5所誘導(dǎo)的Hepcidin的抗菌作用

采用抗Hepcidin抗體處理經(jīng)CpG-ODN-C4和CpG-ODN-C5誘導(dǎo)的血清，測(cè)定血清抑菌能力的變化，分析CpG-ODN-C4和CpG-ODN-C5所誘導(dǎo)的Hepcidin的抗菌作用。

取兩組成體斑馬魚(yú)，其中一組20尾，每尾腹腔注射10μL PBS作為對(duì)照；另一組取40尾，每尾腹腔注射1.5μg(PBS稀釋)的本發(fā)明所設(shè)計(jì)的CpG-ODN-C4和CpG-ODN-C5作為實(shí)驗(yàn)組，注射量為10μL。24小時(shí)后從各組斑馬魚(yú)采血，將血液4℃靜置4h后離心取血清。將實(shí)驗(yàn)組血清平分為兩份，一份血清不做任何處理待用；另一份血清等體積混入滴度效價(jià)為1:1000的兔抗Hepcidin多克隆抗體，在37℃條件下反應(yīng)2小時(shí)后(使兔抗Hepcidin多克隆抗體與經(jīng)CpG-ODN-C4和CpG-ODN-C5刺激后的斑馬魚(yú)血清進(jìn)行反應(yīng))待用。另將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的嗜水氣單胞菌(A.h)等體積接種于三管LB培養(yǎng)液中(每管含LB液體培養(yǎng)基2mL)，測(cè)得接種后各管實(shí)時(shí)的菌液濃度菌落形成單位值(CFU)一致。將上述三種斑馬魚(yú)血清(即對(duì)照、未做處理的實(shí)驗(yàn)組血清和兔抗Hepcidin多克隆抗體處理的實(shí)驗(yàn)組血清)分別加入三管培養(yǎng)基中(每管加入血清量為100μL)，在恒溫?fù)u床中以37℃、200rpm的條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)后1、3、6、9和12小時(shí)分別各取100μL培養(yǎng)液測(cè)量菌液濃度CFU值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

結(jié)果顯示，經(jīng)CpG-ODN-C4(圖3中A)或CpG-ODN-C5(圖3中B)刺激后斑馬魚(yú)血清的抑菌能力得到了顯著提升；但經(jīng)Hepcidin抗體中和處理后的斑馬魚(yú)血清的抑菌能力則受到了抑制。表明斑馬魚(yú)血清中的Hepcidin在抑制嗜水氣單胞菌活性的過(guò)程中發(fā)揮作用。注：“*”號(hào)表示數(shù)據(jù)間有顯著性差異(P<0.05)，“**”號(hào)表示數(shù)據(jù)間有極顯著差異(P<0.01)。

實(shí)施例5、CpG-ODN-C4和CpG-ODN-C5誘導(dǎo)斑馬魚(yú)血清鐵離子含量下降

取兩組成體斑馬魚(yú)，每組各10尾。其中一組每條魚(yú)腹腔注射10μL、1.5μg本發(fā)明所設(shè)計(jì)的CpG-ODN-C4，另一組每條魚(yú)腹腔注射10μL、1.5μg本發(fā)明所設(shè)計(jì)的CpG-ODN-C5；對(duì)照組設(shè)PBS和空白對(duì)照，24h后取血，取血后將血液離心取血清，血清經(jīng)65％硝酸60℃處理2小時(shí)后利用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS)測(cè)定鐵離子濃度，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果顯示，PBS組的鐵含量在22-24ppm左右，而CpG-ODN-C4與CpG-ODN-C5刺激組的鐵含量均在15ppm左右，PBS組和control組間無(wú)顯著差異，而CpG刺激組與對(duì)照組相比鐵離子濃度均呈現(xiàn)顯著降低(圖4)。注：“*”號(hào)表示數(shù)據(jù)間有顯著性差異(P<0.05)。

實(shí)施例6、CpG-ODN-C4與CpG-ODN-C5的免疫保護(hù)功能

取八組成體斑馬魚(yú)，每組各30尾。實(shí)驗(yàn)組分別腹腔注射CpG-ODN-C4和CpG-ODN-C5(每尾10μL、1.5μg)，對(duì)照組腹腔注射相同體積的無(wú)菌PBS。12h后將實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組的斑馬魚(yú)分別腹腔注射10μL/CFU 1.0×10⁶的嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila,A.h,菌種編號(hào)1.927，購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC))(圖5中A)和10μL/CFU 1.5×10⁶的溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus,V.a，菌種編號(hào)ATCC 17749，來(lái)源同A.h細(xì)菌)(圖5中B)，對(duì)照組均不做任何處理。從24h開(kāi)始，每隔24h統(tǒng)計(jì)斑馬魚(yú)的存活率，并計(jì)算注射過(guò)CpG-ODN-C4或CpG-ODN-C5的斑馬魚(yú)組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)(0d～6d)的相對(duì)免疫保護(hù)率(1-實(shí)驗(yàn)組死亡率/對(duì)照組死亡率×100％)，試驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果顯示，相對(duì)于未注射CpG-ODN-C4或CpG-ODN-C5的斑馬魚(yú)，注射了CpG-ODN-C4或CpG-ODN-C5的斑馬魚(yú)在被A.h細(xì)菌感染后死亡率明顯降低，其中CpG-ODN-C5實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于對(duì)照組有近24％的相對(duì)免疫保護(hù)率；CpG-ODN-C4實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于對(duì)照組也有20％的相對(duì)免疫保護(hù)率。其免疫保護(hù)率有了顯著提高(P<0.05)；而對(duì)照組則在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中沒(méi)有發(fā)病現(xiàn)象(表4)。注：“*”號(hào)表示數(shù)據(jù)間有顯著性差異(P<0.05)，“**”號(hào)表示數(shù)據(jù)間有極顯著差異(P<0.01)。

表4.兩種CpG-ODN對(duì)A.h或細(xì)菌感染斑馬魚(yú)的免疫保護(hù)率

綜上所述，本發(fā)明中，經(jīng)設(shè)計(jì)合成的CpG-ODN-C4和CpG-ODN-C5注射成體斑馬魚(yú)，可高效激活斑馬魚(yú)Hepcidin表達(dá)及Hepcidin介導(dǎo)的免疫抗菌應(yīng)答。這種安全、高效、環(huán)境友好型的核酸類(lèi)免疫抗病制劑將為開(kāi)發(fā)新型魚(yú)類(lèi)抗病藥物以及新型魚(yú)類(lèi)疫苗的研究提供了一個(gè)全新的方向。

應(yīng)當(dāng)注意的是，以上實(shí)驗(yàn)列舉的僅僅是本發(fā)明的若干具體實(shí)例，顯然，本發(fā)明還有許多變形，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開(kāi)的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江大學(xué)

<120> 一種魚(yú)類(lèi)Hepcidin表達(dá)促進(jìn)劑及其應(yīng)用

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<170> PatentIn version 3.5

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<213> unknown

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