本發(fā)明涉及一種氯霉素的制備方法，屬于生物制藥和生物化工的技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
氯霉素是目前市場上最廣譜抗菌素藥物之一,其抗菌作用機(jī)制是與核蛋白體50S亞基結(jié)合，抑制肽酰基轉(zhuǎn)移酶，從而抑制蛋白質(zhì)合成，其結(jié)構(gòu)式如下：
氯霉素對大多數(shù)革蘭氏陰性以及陽性細(xì)菌、流感桿菌、百日咳桿菌、痢疾桿菌、大腸桿菌、肺炎桿菌、變形桿菌、綠膿桿菌、立克次體、沙眼衣原體等都能有效控制。由于其在生物醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用非常廣泛，因此探索一種溫和、高效、經(jīng)濟(jì)的方法制備氯霉素受到了廣大化學(xué)生物工作者的關(guān)注。
目前工業(yè)制備氯霉素的方法是：以苯乙酮為起始原料，通過溴化、氨化、乙酰化、羥醛縮合、異丙醇鋁還原、水解脫保護(hù)、手性拆分以及二氯乙?；?步化學(xué)反應(yīng)制備的。其合成路線如下：
此方法存在以下缺點：
(1)此路線需要手性拆分，而拆分的理論收率只有50％，這導(dǎo)致了整條路線的收率在30％以下；加之，拆分的步驟非常繁瑣，給工業(yè)生產(chǎn)帶來很大的不便；
(2)此路線中需要用到乙?；Ｗo(hù)，再脫保護(hù)，原子經(jīng)濟(jì)性較差并且反應(yīng)步驟的增加使得整體的收率降低，同時也對工業(yè)化生產(chǎn)增加了難度。
(3)此路線還原步驟中使用異丙醇鋁，此過程產(chǎn)生大量難于處理的三廢，對環(huán)境危害非常大。
因此，目前亟待提出一種制備條件溫和、操作步驟簡單、產(chǎn)品收率效、原子經(jīng)濟(jì)性優(yōu)越、對環(huán)境友好的氯霉素制備方法。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是現(xiàn)有技術(shù)中的制備氯霉素的工藝存在反應(yīng)步驟長、操作步驟繁瑣、反應(yīng)條件苛刻、原子經(jīng)濟(jì)性低、產(chǎn)品收率低、對環(huán)境不友好的問題，進(jìn)而提供一種低成本、易于制備、產(chǎn)率高、更為環(huán)保的制備氯霉素方法。
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了制備氯霉素的方法，包括如下步驟：以現(xiàn)有氯霉素生產(chǎn)工藝的中間體(對硝基-α-氨基苯乙酮鹽酸鹽)為起始原料通過二氯乙酰化、羥醛縮合反應(yīng)以及不對稱生物催化還原三步反應(yīng)，即得所述氯霉素。
需要說明的是，所述氯霉素的結(jié)構(gòu)式如下所示：
優(yōu)選地，所述氯霉素的合成路線為：
優(yōu)選地，所述二氯乙?；磻?yīng)具體為：將對硝基-α-氨基苯乙酮鹽酸鹽與溶劑、二氯乙酰氯混合均勻，再向其中加入縛酸劑，在15-20℃的溫度下反應(yīng)，反應(yīng)完畢，即得二氯乙?；a(chǎn)物。
需要說明的是，所述反應(yīng)溶劑包括但不限于二氯甲烷，只要能夠起到溶解作用即可。所述縛酸劑包括但不限于三乙胺，只要能夠起到吸收反應(yīng)中產(chǎn)生的酸的作用即可，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)實際需求可對其成分進(jìn)行調(diào)整。
進(jìn)一步優(yōu)選地，所述二氯乙?；磻?yīng)還包括，在所述二氯乙?；磻?yīng)完畢后，將反應(yīng)混合溶液過濾，再將濾餅用二氯甲烷洗滌，收集濾液，并將濾液依次用稀鹽酸、飽和碳酸氫鈉溶液、飽和食鹽水洗滌，干燥脫溶，即得二氯乙?；a(chǎn)物。
優(yōu)選地，所述羥醛縮合反應(yīng)具體為：將二氯乙?；a(chǎn)物與乙醇、甲醛混合均勻，調(diào)節(jié)混合溶液的pH值為7.2-7.5，在溫度32-35℃下反應(yīng)，反應(yīng)完畢，即得對硝基-α-二氯乙酰胺基-β-羥基苯丙酮。
優(yōu)選地，所述催化還原反應(yīng)具體為：將硝基-α-二氯乙酰胺基-β-羥基苯丙酮與酮還原酶加入到緩沖液中，在溫度20-40℃下、pH值為6.0-8.0的條件下反應(yīng)，反應(yīng)完畢即得所述氯霉素。
優(yōu)選地，所述緩沖溶液為pH值為6.0-7.5、濃度為0.05-0.1mol/L的PBS緩沖溶液。
需要說明的是，所述緩沖溶液包括但不限于PBS緩沖溶液，只要能夠在酶催化反應(yīng)時，起到保持鹽平衡、調(diào)整的適宜pH的緩沖作用即可。所述PBS緩沖溶液是指磷酸鹽緩沖溶液，其成分包括但不限于Na2HPO4、KH2PO4、NaCl、KCl，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)實際需求可對其成分進(jìn)行調(diào)整。
優(yōu)選地，所述緩沖液中還加入NADP+以及可選擇地加入異丙醇、葡萄糖脫氫酶、草酸脫氫酶、乳酸脫氫酶中的一種或多種。
優(yōu)選地，所述對硝基-α-氨基苯乙酮鹽酸鹽以硝基苯乙酮為原料，依次通過溴化反應(yīng)、氨化反應(yīng)制得。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點：
(1)本發(fā)明所述的氯霉素的制備方法，以現(xiàn)有氯霉素生產(chǎn)工藝的中間體(對硝基-α-氨基苯乙酮鹽酸鹽)為起始原料通過二氯乙?；?、羥醛縮合反應(yīng)以及不對稱生物催化還原三步反應(yīng)，最終能以高達(dá)84％的總收率，>99％的Ee，>99/1的Dr得到氯霉素。不僅避免了拆分、而且避免保護(hù)-脫保護(hù)步驟，簡化了氯霉素的生產(chǎn)工藝，提高了總收率、降低了生產(chǎn)成本，解決了現(xiàn)有技術(shù)中制備氯霉素的制備氯霉素的工藝存在反應(yīng)步驟長、原子經(jīng)濟(jì)性低、產(chǎn)品收率低的問題；
(2)本發(fā)明所述的氯霉素的制備方法，操作簡單，條件溫和，反應(yīng)的后處理簡單，易操作，產(chǎn)生的三廢量比較少，對環(huán)境友好，解決了氯霉素其他制備方法的操作復(fù)雜、污染大等缺點，適合大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。
具體實施方式
以下結(jié)合實施例，對本發(fā)明作進(jìn)一步具體描述，但不局限于此。需要說明的是，以現(xiàn)有氯霉素生產(chǎn)工藝的中間體(對硝基-α-氨基苯乙酮鹽酸鹽)為起始原料通過二氯乙酰化、羥醛縮合以及不對稱生物催化還原三步反應(yīng)，制備得到所述氯霉素。其合成路線為：
實施例1-6分別對二氯乙?；磻?yīng)、羥醛縮合反應(yīng)以及催化還原反應(yīng)詳細(xì)描述。
實施例1二氯乙?；磻?yīng)
本實施例為制備所述氯霉素的方法中的二氯乙?；磻?yīng)，具體如下：
將21.6g對硝基-α-氨基苯乙酮鹽酸鹽與150ml二氯甲烷、14.5g二氯乙酰氯混合均勻，再向其中加入21g三乙胺溶液，在20℃的溫度下反應(yīng)，反應(yīng)完畢，即得二氯乙酰化產(chǎn)物。
作為本實施例的優(yōu)選實施方式，所述二氯乙?；磻?yīng)還包括，在所述二氯乙酰化反應(yīng)完畢后，將反應(yīng)混合溶液過濾，再將濾餅用二氯甲烷洗滌，收集濾液，并將濾液依次用稀鹽酸、飽和碳酸氫鈉溶液、飽和食鹽水洗滌，干燥脫溶，即得二氯乙?；a(chǎn)物。
作為本實施例可替換的實現(xiàn)方式，反應(yīng)溫度可以替換為0-45℃范圍內(nèi)的任意值，并不影響本發(fā)明目的的實現(xiàn)。
實施例2二氯乙?；磻?yīng)
本實施例為制備所述氯霉素的方法中的二氯乙?；磻?yīng)，具體如下：
在裝有攪拌器、溫度計和滴液漏斗的250mL四頸瓶中，放入21.6g對硝基-α-氨基苯乙酮鹽酸鹽以及二氯甲烷150mL，攪拌均勻后冷至5℃以下，再在攪拌下加入二氯乙酰氯14.5g，另取三乙胺溶液21g，用滴液漏斗在15℃的溫度下緩慢滴入反應(yīng)液中，然后升溫到15℃，攪拌1h，反應(yīng)完畢后，過濾，再將濾餅用二氯甲烷洗滌，收集濾液，并將濾液依次用稀鹽酸、飽和碳酸氫鈉溶液、飽和食鹽水洗滌，干燥脫溶，即得二氯乙酰化產(chǎn)物28.2g，收率97％。
實施例3羥醛縮合反應(yīng)
本實施例為制備所述氯霉素的方法中的羥醛縮合反應(yīng)，具體如下：
將29.1g實施例2中制備得到的所述二氯乙酰化產(chǎn)物與200ml乙醇、11.4g甲醛混合均勻，調(diào)節(jié)混合溶液的pH值為7.2，在溫度35℃下反應(yīng)，反應(yīng)完畢，即得對硝基-α-二氯乙酰胺基-β-羥基苯丙酮。
作為本實施例優(yōu)選地實施方式，上述反應(yīng)完畢后，將反應(yīng)混合溶液冷卻至0℃，過濾，用冰水洗滌，抽濾，干燥，即得對硝基-α-二氯乙酰胺基-β-羥基苯丙酮。
作為本實施例可替換的實施方式，所述羥醛縮合反應(yīng)的反應(yīng)溫度可以替換為32-35℃范圍內(nèi)的任意值，pH值可替換為7.2-7.5范圍內(nèi)的任意值，并不影響本發(fā)明目的實現(xiàn)。
實施例4羥醛縮合反應(yīng)
本實施例為制備所述氯霉素的方法中的羥醛縮合反應(yīng)，具體如下：
在裝有攪拌器、溫度計的250mL三頸瓶中，加入29.1g實施例2中制備得到的所述二氯乙酰化產(chǎn)物及乙醇200mL、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為37％的甲醛11.4g，混合均勻后用少量NaHCO3飽和溶液調(diào)節(jié)混合溶液的pH值為7.5，然后，在攪拌條件下緩慢升溫至32℃，反應(yīng)完畢后，迅速冷卻至0℃，過濾，用冰水洗滌，然后抽濾，干燥，即得對硝基-α-二氯乙酰胺基-β-羥基苯丙酮29.35g，收率92％。
實施例5催化還原反應(yīng)
本實施例為制備所述氯霉素的方法中的催化還原反應(yīng)，具體如下：
將50g實施例4中制備得到的所述硝基-α-二氯乙酰胺基-β-羥基苯丙酮與1g酮還原酶(采購自蘇州引航生物科技有限公司：商品編號YH2069，此處僅給出其中一種型號的產(chǎn)品予以闡述本發(fā)明的效果，市售各型號的產(chǎn)品之間對于實現(xiàn)本發(fā)明的目的來說并無差異，下同，后文不再冗述)加入到緩沖液中，在溫度為40℃、pH值為8.0的條件下反應(yīng)，反應(yīng)完畢即得所述氯霉素。
作為本實施例優(yōu)選的實施方式，所述緩沖液中還加入有葡萄糖、葡萄糖脫氫酶以及NADP+，作為該優(yōu)選實施方式的具體實現(xiàn)方案，所述葡萄糖、葡萄糖脫氫酶以及NADP+的用量分別為62.5g、1g以及50mg。
需要說明的是，本實施例中，所述緩沖液為PBS緩沖溶液，所述PBS緩沖溶液還可替換為其他緩沖溶液，只要能夠在酶催化反應(yīng)時，起到保持鹽平衡、調(diào)整的適宜pH的緩沖作用即可。
作為本實施例可替換的實現(xiàn)方式，所述催化還原反應(yīng)的反應(yīng)溫度可以替換為20-40℃范圍內(nèi)的任意值，反應(yīng)溶液的pH值可以替換為6.0-8.0范圍內(nèi)的任意值，并不影響本發(fā)明目的的實現(xiàn)，下同，后文不再贅述。
實施例6催化還原反應(yīng)
本實施例為制備所述氯霉素的方法中的催化還原反應(yīng)，具體如下：將實施例4中制備得到的所述硝基-α-二氯乙酰胺基-β-羥基苯丙酮50g、葡萄糖62.5g置于1000mL的三口燒瓶，再向其中加入500mL的pH值為6.5且濃度為0.05mol/L的PBS緩沖液，然后，將三口燒瓶放入反應(yīng)鍋中，設(shè)置轉(zhuǎn)速850rpm,溫度30℃，再向其中分別加入50mg的NADP+,1g的葡萄糖脫氫酶(采購自蘇州引航生物科技有限公司：商品編號YH1901，此處僅給出其中一種型號的產(chǎn)品予以闡述本發(fā)明的效果，市售各型號的產(chǎn)品之間對于實現(xiàn)本發(fā)明的目的來說并無差異)、以及1g酮還原酶粉(采購自蘇州引航生物科技有限公司：商品編號YH2069)，得到混合溶液，采用濃度為2mol/L的NaOH溶液使所述混合溶液的pH值維持在6.5，反應(yīng)3h，即得所述氯霉素，并測得反應(yīng)轉(zhuǎn)化率>99％,>99％Ee,>99:1Dr，(其中Ee＝(R,R)/[(R,R)+(S,S)]；Dr＝[(R,R)+(S,S)]/[(R,S)+(S,R)])。
作為本實施例的優(yōu)選實施方式，采用HPLC監(jiān)控反應(yīng)，延長反應(yīng)時間轉(zhuǎn)化率不再增加，即判斷反應(yīng)完畢。
作為本實施例的優(yōu)選實施方式，在所述催化還原反應(yīng)完畢后，用二氯甲烷萃取反應(yīng)后溶液，合并有機(jī)相，并將其干燥、脫溶，即得到所述氯霉素。本實施例中采用上述優(yōu)選實施方式，得到所述氯霉素47克，收率94％，純度98％，Ee>99％,Dr>99:1。
需要說明的是，所述PBS緩沖溶液的pH值可替換為6.0-7.5中的任意值，濃度可替換為0.05-0.1mol/L中的任意值，并不影響本發(fā)明的目的的實現(xiàn)。
顯然，上述實施例僅僅是為清楚地說明所作的舉例，而非對實施方式的限定。對于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉，而由此所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明創(chuàng)造的保護(hù)范圍之中。