本發(fā)明屬于分子生物學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及一種檢測豬肺炎支原體的引物對、試劑盒及Syto9熒光定量PCR-HRM檢測方法。

背景技術(shù)：

豬支原體病(Mycoplasmal Diseases)是指由豬肺炎支原體（M.Hyopneumoniae，Mhp）、豬鼻支原體（M.hyorhinis，Mhr）、豬滑液支原體（M.hyosynoviae，Mhs）和豬嗜血支原體(豬附紅細胞體)和絮狀支原體等寄生于宿主豬，引起豬肺炎、漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和黃疸性貧血等癥狀性疾病。其中，Mhp是引起豬支原體肺炎又稱“喘氣病”的病原微生物，其主要危害是引起豬的生長受阻和飼料轉(zhuǎn)化率大幅下降，其高致病率嚴(yán)重影響?zhàn)B豬業(yè)的經(jīng)濟效益。

檢測Mhp的常用方法有分離培養(yǎng)、核酸探針、PCR、微粒凝集試驗、免疫熒光試驗和酶聯(lián)免疫吸附試驗等。雖然Mhp可以在人工培養(yǎng)基上生長，但對營養(yǎng)要求極為苛刻，且培養(yǎng)時間長，容易被其他病原微生物污染。血清學(xué)檢測方法與其他支原體之間存在嚴(yán)重交叉反應(yīng)，給Mhp的鑒別診斷帶來了困難。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，熒光PCR技術(shù)不僅克服了血清學(xué)交叉反應(yīng)的缺點，而且敏感、快速、方便。

熒光PCR 技術(shù)大致分為熒光探針法（標(biāo)記熒光PCR）和通用型的熒光染料法（非標(biāo)記熒光PCR）。前者利用熒光標(biāo)記的特異性探針或者引物來識別模版，優(yōu)點是特異性更高，適用于擴增序列專一檢測，不過檢測成本要高很多。而后者主要是利用熒光染料與雙鏈DNA 分子結(jié)合發(fā)光的特性來指示擴增產(chǎn)物的增加，其優(yōu)點是：無需另外設(shè)計熒光探針，簡便易行，成本較低。其中，熒光染料又分為非飽和染料（如SYBR Green）和飽和染料（如LC Green 等）。

相對SYBR Green 等非飽和染料來說，Eva Green、LC Green、Syto9等飽和染料具有以下優(yōu)點：①飽和的染料對PCR 反應(yīng)沒有任何抑制作用，因此可以在PCR 反應(yīng)之前加入，而其它非飽和熒光染料若較多加入到反應(yīng)液中會抑制PCR 反應(yīng)，因此只能限量加入，從而對熒光PCR 反應(yīng)的指示受到限制。②DNA 高溫變性時，非飽和熒光染料加入則會造成DNA 雙鏈高溫變性時，單鏈部分的熒光染料分子發(fā)生遷移，熒光染料分子重新結(jié)合到雙鏈DNA 的空置位點，造成熒光信號沒有變化，因此出現(xiàn)假陰性，特異性下降，而飽和染料則不會出現(xiàn)此類情況。③高溫穩(wěn)定，對于高GC 含量的PCR 產(chǎn)物，Tm 值較高，在DNA 雙鏈高溫熔解時，飽和熒光染料結(jié)合核酸更穩(wěn)定。

高分辨率熔解曲線(high-resolution melt，HRM) 分析技術(shù)是近幾年來在國外興起的一種用于基因突變掃描和基因分型的最新遺傳學(xué)分析方法。HRM 利用了特定的染料可以插入DNA 雙鏈中的特性，通過實時監(jiān)測升溫過程中雙鏈DNA 熒光染料與PCR 擴增產(chǎn)物的結(jié)合情況記錄熔解曲線，從而對樣品進行檢測。因其操作簡便快速，使用成本低，結(jié)果準(zhǔn)確，實現(xiàn)了真正的閉管操作，HRM 技術(shù)受到普遍關(guān)注。

因此，擬開發(fā)一種基于飽和熒光染料Syto9的檢測Mhp的熒光定量PCR-HRM方法，以便更好地避免假陽性和假陰性的干擾，最終為豬肺炎支原體的流行病學(xué)調(diào)查及疫情預(yù)警提供技術(shù)支持。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種檢測豬肺炎支原體的引物對、試劑盒以及Syto9熒光定量PCR-HRM檢測方法。

本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

用于檢測豬肺炎支原體的熒光定量PCR引物對，其核苷酸序列如下所示：

上游引物P1 ：5’- GWCAAAGTCAAAGTCAGCAAAC -3’（SEQ ID NO:1）；

下游引物P2 ：5’- AGCTGTTCAAATGCTTGTCC -3’ （SEQ ID NO:2）。

一種檢測豬肺炎支原體的Syto9熒光定量PCR-HRM方法，包括如下步驟：

（1）提取待測樣品DNA；

（2）以步驟（1）提取的DNA為核酸模板，以Syto9為熒光染料，用權(quán)利要求1所述的用于檢測豬肺炎支原體的熒光定量PCR引物對進行PCR擴增；

（3）將步驟（2）獲得的PCR擴增產(chǎn)物進行高分辨率熔解曲線分析；

（4）結(jié)果判定：形成特異性的熔解曲線峰型為陽性，無特異的熔解曲線峰型為陰性。

其中，步驟（2）所述的PCR擴增反應(yīng)的25 μL體系中含有2xTaq Plus Master Mix 12.5 μL，P1 和P2引物（100 pmol/μL）各1.0 μL，核酸模板2.0 μL，Syto9 1.0 μL，余量為去離子水。

其中，步驟（2）所述的PCR擴增反應(yīng)程序為首先94℃ 5 min；隨后94℃ 20 s、54.5℃ 20 s、72℃ 20 s，循環(huán)擴增45次；最后72℃延伸7 min。

其中，步驟（3）所述的高分辨率熔解曲線分析程序為98℃變性2min，40℃雜合2min，74℃～83℃以0.3℃/s的熔解速率運行。

一種豬肺炎支原體的熒光定量PCR檢測試劑盒，含有上述用于檢測豬肺炎支原體的熒光定量PCR引物對。

本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明建立了一種基于飽和熒光染料Syto9的熒光定量PCR-HRM方法檢測豬肺炎支原體。該方法操作簡單，只需在PCR反應(yīng)之前加熒光飽和染料Syto9即可；檢測速度快且高通量，全部操作過程只需2～3小時，極大縮短了檢測所需時間；費用低，不需要特異性熒光標(biāo)記探針，每個樣品的飽和染料成本為1.6 RMB；準(zhǔn)確性高，相關(guān)系數(shù)大于0.99；特異性好，可有效區(qū)分包括Mhr、Mhs等豬病原；靈敏度高，最低檢出限可低至4.56拷貝/μL，結(jié)合HRM的閉管檢測技術(shù)可避免假陽性或假陰性的出現(xiàn)，更易于應(yīng)用與推廣。

附圖說明

圖1：豬肺炎支原體擴增曲線及HRM分析圖；

圖2：熒光定量方法標(biāo)準(zhǔn)曲線及HRM分析圖；

圖3：特異性實驗擴增曲線圖及熔解曲線圖；

圖4：靈敏度試驗擴增曲線及熔解曲線圖；

圖5：臨床樣本檢測圖，L1~L8為8份臨床肺臟樣品，N1~N5為5份鼻拭子。

具體實施方式

用于檢測豬肺炎支原體的熒光定量PCR引物對，其核苷酸序列如下所示：

上游引物P1 ：5’- GWCAAAGTCAAAGTCAGCAAAC -3’（SEQ ID NO:1）；

下游引物P2 ：5’- AGCTGTTCAAATGCTTGTCC -3’ （SEQ ID NO:2）。

一種檢測豬肺炎支原體的Syto9熒光定量PCR-HRM方法，包括如下步驟：

（1）提取待測樣品DNA；

（2）以步驟（1）提取的DNA為核酸模板，以Syto9為熒光染料，用權(quán)利要求1所述的用于檢測豬肺炎支原體的熒光定量PCR引物對進行PCR擴增；

（3）將步驟（2）獲得的PCR擴增產(chǎn)物進行高分辨率熔解曲線分析；

（4）結(jié)果判定：形成特異性的熔解曲線峰型為陽性，無特異的熔解曲線峰型為陰性。

其中，步驟（2）所述的PCR擴增反應(yīng)的25 μL體系中含有2xTaq Plus Master Mix 12.5 μL，P1 和P2引物（100 pmol/μL）各1.0 μL，核酸模板2.0 μL，Syto9 1.0 μL，余量為去離子水。

其中，步驟（2）所述的PCR擴增反應(yīng)程序為首先94℃ 5 min；隨后94℃ 20 s、54.5℃ 20 s、72℃ 20 s，循環(huán)擴增45次；最后72℃延伸7 min。

其中，步驟（3）所述的高分辨率熔解曲線分析程序為98℃變性2min，40℃雜合2min，74℃～83℃以0.3℃/s的熔解速率運行。

一種豬肺炎支原體的熒光定量PCR檢測試劑盒，含有上述用于檢測豬肺炎支原體的熒光定量PCR引物對。

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步解釋，但不局限于此。實施例中未詳細說明的操作為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)操作。

實施例1豬肺炎支原體的Syto9熒光定量PCR-HRM檢測方法的建立

（1）用于檢測豬肺炎支原體的熒光定量PCR引物對的設(shè)計

對GenBank中登錄的不同國家和地區(qū)Mhp P102基因的序列進行分析，針對保守區(qū)設(shè)計一對引物，如下：

上游引物P1：5’-GWCAAAGTCAAAGTCAGCAAAC-3’（SEQ ID NO:1）；

下游引物P2：5’-AGCTGTTCAAATGCTTGTCC -3’（SEQ ID NO:2）；

預(yù)期擴增片段大小為138bp。

（2）重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備

按照DNA提取試劑盒說明書提取Mhp的DNA，以其為模板，用步驟（1）設(shè)計的P1和P2引物進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物回收純化后，克隆于pMD18-T載體中構(gòu)建重組質(zhì)粒，經(jīng)PCR鑒定和測序顯示，PCR產(chǎn)物約為138bp，獲得正確的重組質(zhì)粒。

以重組質(zhì)粒為熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)品，測定陽性重組質(zhì)粒濃度為142.53 ng/μL，根據(jù)公式計算分子拷貝數(shù)為4.56×10¹⁰拷貝/μL，依次做10倍梯度稀釋，將質(zhì)粒稀釋至濃度范圍為4.56×10⁹拷貝/μL～4.56×10⁰拷貝/μL ，用作標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及靈敏度試驗研究。

（3） PCR擴增及HRM分析

參照2xTaq Plus Master Mix（Vazyme）產(chǎn)品說明書，按以下組成配制PCR反應(yīng)液。采用25 μL 的PCR 反應(yīng)體系，在0.2 mL PCR 反應(yīng)管內(nèi)分別加入2xTaq Plus Master Mix 12.5 μL，P1 和P2引物（100 pmol/μL）各1.0 μL，核酸模板2.0 μL，Syto9 1.0 μL，去離子水7.5 μL。PCR 反應(yīng)程序為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 20 s、54.5 ℃ 20 s、72 ℃ 20 s，循環(huán)擴增45 次；最后72℃延伸7 min。

熔解曲線分析，采用Rotor gene Q2儀器，程序為：98℃變性2min，40℃雜合2min，74℃到83℃以0.3℃/s的熔解速率進行高分辨率熔解曲線分析。HRM試驗結(jié)果用Rotor gene Q軟件進行分析。

以標(biāo)準(zhǔn)樣品Mhp為核酸模板，水為陰性對照，每個樣品重復(fù)三次。結(jié)果如圖1所示，峰型化熔解曲線圖顯示，形成單峰Tm值為77.49±0.1℃，無非特異性擴增。

（4）標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

選取重組質(zhì)粒5個稀釋度（4.56×10⁹拷貝/μL到4.56×10⁵拷貝/μL），每個稀釋度重復(fù)三次，以各濃度梯度的質(zhì)粒DNA為模板，采用建立的熒光定量PCR進行擴增，得到動力學(xué)曲線，并通過儀器軟件自動生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

結(jié)果如圖2所示，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=-3.118x+39.675，相關(guān)系數(shù)R²=0.99343，結(jié)果呈良好線性關(guān)系。HRM分析表明，無非特異性擴增。

（5）特異性試驗

以豬肺炎支原體（Mhp）、豬鼻支原體（Mhr）、豬滑液支原體（Mhs）、豬圓環(huán)病毒（PCV2）、豬偽狂犬病病毒（PRV）的DNA及豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）的cDNA為模板進行熒光定量PCR反應(yīng)，以驗證該方法的特異性。

結(jié)果如圖3所示，只有Mhp有擴增曲線及特異的熔解曲線，其余均無，表明建立方法特異性良好。

（6）敏感性試驗

選取重組質(zhì)粒10個稀釋度（4.56×10⁹拷貝/μL到4.56×10⁰拷貝/μL），以各濃度梯度的重組質(zhì)粒DNA為模板，采用建立的熒光定量PCR為模板，以確定最低檢測限，判定標(biāo)準(zhǔn)以形成特異性的熔解曲線峰型為陽性，無特異的熔解曲線峰型為陰性。

結(jié)果如圖4所示，在模板濃度低至4.56×10⁰拷貝/μL時，還有明顯的擴增曲線及熔解峰形成。

實施例2 臨床樣品檢測

以Mhp為陽性對照，水為陰性對照，采用本研究建立的基于飽和熒光染料Syto9的豬肺炎支原體熒光定量檢測方法，檢測臨床肺臟樣品8份、鼻拭子5份。

具體檢測方法如下：

（1）提取待測樣品DNA：按照DNA提取試劑盒進行；

（2）以待測樣品DNA為核酸模板，用實施例1步驟（1）所設(shè)計的P1和P2引物進行PCR擴增，參照2xTaq Plus Master Mix（Vazyme）產(chǎn)品說明書，按以下組成配制PCR反應(yīng)液：采用25 μL 的PCR 反應(yīng)體系，在0.2 mL PCR 反應(yīng)管內(nèi)分別加入2xTaq Plus Master Mix 12.5 μL，P1 和P2引物（100 pmol/μL）各1.0 μL，核酸模板2.0 μL，Syto9 1.0 μL，去離子水7.5 μL；PCR 反應(yīng)程序為：首先94 ℃ 5 min；隨后94 ℃ 20 s、54.5 ℃ 20 s、72 ℃ 20 s，循環(huán)擴增45 次；最后72℃延伸7 min；

（3）將步驟（2）的PCR擴增產(chǎn)物閉管置于RotorgeneQ2儀器，進行高分辨率熔解曲線分析，程序為：98℃變性2min，40℃雜合2min，74℃到83℃以0.3℃/s的熔解速率進行高分辨率熔解曲線分析，HRM試驗結(jié)果用Rotor gene Q軟件進行分析；

（4）判定標(biāo)準(zhǔn)：以形成特異性的熔解曲線峰型為陽性，無特異的熔解曲線峰型為陰性。

樣品檢驗結(jié)果如圖5所示，5份肺臟樣品（L2、L4、L5、L6、L7）和3份鼻拭子樣品（N1、N2、N4）均出現(xiàn)特異性的熔解曲線峰型，判斷為陽性，其余為陰性。

SEQUENCE LISTING

<110> 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物衛(wèi)生研究所

<120> 一種檢測豬肺炎支原體的引物對、試劑盒及Syto9熒光定量PCR-HRM檢測方法

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

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