本發(fā)明涉及一種生物提取方法，尤其涉及一種印楝素的發(fā)酵提取方法。

背景技術(shù)：

植物內(nèi)生菌更容易產(chǎn)生抗菌物質(zhì)或新型生物活性物質(zhì)。植物內(nèi)生菌是指在某一時(shí)期生活在植物體內(nèi)，但對(duì)寄主植物組織并不引起明顯病害癥狀的細(xì)菌。包括那些在其生活史中的某一階段營表面生活的腐生菌，以及對(duì)宿主暫時(shí)沒有傷害的潛伏性病原菌和菌根菌。內(nèi)生菌能夠產(chǎn)生活性很強(qiáng)的次生代謝產(chǎn)物，包括抗生素、殺昆蟲物質(zhì)、植物生長調(diào)節(jié)劑、抗腫瘤活性物質(zhì)等，而這些化合物包括生物堿、甾醇、萜類、大環(huán)內(nèi)酯等多種類型并具有新穎的化學(xué)結(jié)構(gòu),近年來已成為國內(nèi)外研究的焦點(diǎn)。

印楝屬楝科植物，為熱帶樹種,具有很高的生物農(nóng)藥和醫(yī)藥價(jià)值。印楝殺蟲劑是當(dāng)今世界公認(rèn)的最優(yōu)秀的生物農(nóng)藥之一，對(duì)200多種昆蟲有作用，具有很強(qiáng)的殺蟲、拒食、抑制生長發(fā)育、胃毒、忌避、抑制呼吸、抑制昆蟲激素分泌、抑制昆蟲生育能力等作用。它的殺蟲效果具有廣譜、高效、低毒、無殘留、對(duì)人畜無毒副作用、對(duì)害蟲天敵安全及持效期長、不易產(chǎn)生抗藥性等特點(diǎn)。印楝素是目前世界上公認(rèn)的活性最強(qiáng)的拒食劑，因而被認(rèn)為是最適合于商品化開發(fā)的植物源殺蟲劑。但目前由于氣候原因，國內(nèi)只有海南、云南、廣東可以引種栽培，印楝素制劑因價(jià)格居高不下無法廣泛應(yīng)用。

目前，全球有近20個(gè)國家對(duì)印楝素進(jìn)行研究、開發(fā)和利用，國際上定期召開全球印楝科學(xué)與應(yīng)用會(huì)議。1985年Grace在美國注冊(cè)的印楝制劑“Margosano”是世界上第一個(gè)真正商品化的植物殺蟲劑，而印楝素田間使用具有明顯的局限性，最為突出的是其持效期短。目前，對(duì)印楝素的研究大部分停留在：(1)制劑穩(wěn)定性能的研究：Sundram在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)一種紫外光吸收劑能增強(qiáng)印楝素的穩(wěn)定性；Szeto發(fā)現(xiàn)在PH1-7的緩沖液中其分解率不大，而在PH10的緩沖液中其分解則很快；Andrew發(fā)現(xiàn)印楝素在弱酸環(huán)境(PH4-6)很穩(wěn)定。(2)印楝素分子結(jié)構(gòu)與作用強(qiáng)度關(guān)系的研究：Enris等研究克羅登烷雙萜結(jié)構(gòu)的拒食活性，Deota等研究各種印楝素成分對(duì)拒食活性和昆蟲毒性的大小等。(3)印楝細(xì)胞的培養(yǎng)條件的優(yōu)化；(4)國內(nèi)的研究集中在印楝素與其他農(nóng)藥混配制劑的開發(fā)的研究。華南農(nóng)大是我國最早開始研究印楝素應(yīng)用開發(fā)的單位。

關(guān)于印楝植物內(nèi)生菌的研究，國外曾報(bào)道過生長在印度的印楝植物內(nèi)生真菌的分離和鑒定；國內(nèi)曾報(bào)道對(duì)云南元江印楝植物內(nèi)生真菌進(jìn)行分離并進(jìn)行種類鑒定，邵士成等對(duì)印楝內(nèi)生真菌的多樣性及抗菌活性進(jìn)行研究。但目前未見從印楝植物提取到含印楝素的內(nèi)生菌，并從該內(nèi)生菌發(fā)酵液提取印楝素的技術(shù)研究報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的就在于為了解決上述問題而提供一種印楝素的發(fā)酵提取方法。

本發(fā)明通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)上述目的：

本發(fā)明包括以下步驟：

(1)內(nèi)生菌分離：采用自來水將所采集的印楝植物組織表面沖洗干凈→晾干水分后分別切取不同組織部位，采用下述方法進(jìn)行表面消毒：0.1％升汞漂洗10—30S→無菌水沖洗數(shù)次75％酒精漂洗30-60S→無菌水沖洗數(shù)次；在無菌操作條件下取組織塊切成0.2cmx0.2cm長段，每個(gè)種源地的植株組織塊植于加青霉素的PDA(馬鈴薯蔗糖瓊脂糖)培養(yǎng)基中，在28±1℃條件下置于溫箱靜止培養(yǎng)；

(2)菌株純化：將上述經(jīng)表面滅菌的材料不做任何處理直接種植于加青霉素的PDA培養(yǎng)基中，在28±1℃條件下置于溫箱培養(yǎng)，檢查表面消毒是否徹底；將種植樣品的PDA平板置于28±1℃溫箱培養(yǎng)3-15d待各植物組織切面長出菌絲后挑取邊緣部分移至新的PDA培養(yǎng)基上，劃線法純化；設(shè)兩類空白對(duì)照,一類采用漂洗液檢驗(yàn)法,另一類采用組織印跡法以上兩種對(duì)照處理的分離培養(yǎng)基平板上無菌落出現(xiàn),表明植物材料表面消毒徹底,分離到的是內(nèi)生菌；

(3)菌種鑒定:采用P DA培養(yǎng)基和促孢培養(yǎng)基進(jìn)行插片培養(yǎng)，對(duì)分離所得菌進(jìn)行菌落特征和顯微形態(tài)特征觀察，并通過分子生物學(xué)方法做rDNA ITS(Internal Transcribed Spacer，內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū))序列分析進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定；

(4)菌液發(fā)酵：將內(nèi)生菌分別接種到250ml裝有相對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基的三角瓶中，進(jìn)行搖床培養(yǎng)，細(xì)菌在370C,150r/min培養(yǎng)2d，真菌在300C,150r/min培養(yǎng)3d.

(5)抗蟲活性菌株篩選：選取有報(bào)道對(duì)印楝敏感的農(nóng)業(yè)害蟲(如斜紋夜蛾、草地貪夜蛾、蚜蟲、家蠶、菜青蟲等)，采用蟲體浸漬法：將實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)的試蟲用毛筆挑入漏勺中，在已發(fā)酵好的內(nèi)生菌菌液中浸30s取出，自然晾干后，挑入直徑12cm的培養(yǎng)皿中，并放入新鮮苞菜葉；設(shè)無菌水與對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基為對(duì)照，每個(gè)處理20頭，重復(fù)3次"于溫度280C，光周期L:D＝16:8,相對(duì)濕度75％-85％的恒溫生化培養(yǎng)箱中飼養(yǎng),24,48,72,96,120h后觀察其死亡蟲數(shù)，并計(jì)算死亡率；或采用食葉浸漬法：取新鮮、幼嫩、沒有施過藥的甘藍(lán)葉片，浸入已發(fā)酵好的內(nèi)生菌菌液中10s取出，自然晾干，置于直徑12cm的培養(yǎng)皿中(在葉柄部包裹沾有保濕劑的脫脂棉，以保證葉片新鮮)，用毛筆輕輕挑入饑餓12h的試蟲，設(shè)無菌水和相應(yīng)的發(fā)酵培養(yǎng)基為對(duì)照，每個(gè)處理20頭，重復(fù)3次于溫度280C，光周期L:D＝16:8,相對(duì)濕度75％-85％的恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24,48,72,96,120h后觀察其死亡蟲數(shù)，并計(jì)算死亡率；

(6)發(fā)酵產(chǎn)物提取：收集菌絲體，分別用乙醇、氯仿、石油醚、乙酸乙酯、甲醇等進(jìn)行抽提，得到最佳提取工藝。

本發(fā)明的有益效果在于：

本發(fā)明是一種印楝素的發(fā)酵提取方法，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明通過內(nèi)生菌分離，發(fā)酵，提取發(fā)酵液中印楝活性物質(zhì)獲得抗蟲活性較高的次生代謝產(chǎn)物是目前適合國內(nèi)開發(fā)印楝農(nóng)藥的一條有效途徑，具有非常大的市場(chǎng)開發(fā)潛力。

附圖說明

圖1是本發(fā)明的流程圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明：

如圖1所示：本發(fā)明包括以下步驟：

(1)內(nèi)生菌分離：采用自來水將所采集的印楝植物組織表面沖洗干凈→晾干水分后分別切取不同組織部位，采用下述方法進(jìn)行表面消毒：0.1％升汞漂洗10—30S→無菌水沖洗數(shù)次75％酒精漂洗30-60S→無菌水沖洗數(shù)次；在無菌操作條件下取組織塊切成0.2cmx0.2cm長段，每個(gè)種源地的植株組織塊植于加青霉素的PDA(馬鈴薯蔗糖瓊脂糖)培養(yǎng)基中，在28±1℃條件下置于溫箱靜止培養(yǎng)；

(2)菌株純化：將上述經(jīng)表面滅菌的材料不做任何處理直接種植于加青霉素的PDA培養(yǎng)基中，在28±1℃條件下置于溫箱培養(yǎng)，檢查表面消毒是否徹底；將種植樣品的PDA平板置于28±1℃溫箱培養(yǎng)3-15d待各植物組織切面長出菌絲后挑取邊緣部分移至新的PDA培養(yǎng)基上，劃線法純化；設(shè)兩類空白對(duì)照,一類采用漂洗液檢驗(yàn)法,另一類采用組織印跡法以上兩種對(duì)照處理的分離培養(yǎng)基平板上無菌落出現(xiàn),表明植物材料表面消毒徹底,分離到的是內(nèi)生菌；

(3)菌種鑒定:采用P DA培養(yǎng)基和促孢培養(yǎng)基進(jìn)行插片培養(yǎng)，對(duì)分離所得菌進(jìn)行菌落特征和顯微形態(tài)特征觀察，并通過分子生物學(xué)方法做rDNA ITS(Internal Transcribed Spacer，內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū))序列分析進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定；

(4)菌液發(fā)酵：將內(nèi)生菌分別接種到250ml裝有相對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基的三角瓶中，進(jìn)行搖床培養(yǎng)，細(xì)菌在370C,150r/min培養(yǎng)2d，真菌在300C,150r/min培養(yǎng)3d.

(5)抗蟲活性菌株篩選：選取有報(bào)道對(duì)印楝敏感的農(nóng)業(yè)害蟲(如斜紋夜蛾、草地貪夜蛾、蚜蟲、家蠶、菜青蟲等)，采用蟲體浸漬法：將實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)的試蟲用毛筆挑入漏勺中，在已發(fā)酵好的內(nèi)生菌菌液中浸30s取出，自然晾干后，挑入直徑12cm的培養(yǎng)皿中，并放入新鮮苞菜葉；設(shè)無菌水與對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基為對(duì)照，每個(gè)處理20頭，重復(fù)3次"于溫度280C，光周期L:D＝16:8,相對(duì)濕度75％-85％的恒溫生化培養(yǎng)箱中飼養(yǎng),24,48,72,96,120h后觀察其死亡蟲數(shù)，并計(jì)算死亡率；或采用食葉浸漬法：取新鮮、幼嫩、沒有施過藥的甘藍(lán)葉片，浸入已發(fā)酵好的內(nèi)生菌菌液中10s取出，自然晾干，置于直徑12cm的培養(yǎng)皿中(在葉柄部包裹沾有保濕劑的脫脂棉，以保證葉片新鮮)，用毛筆輕輕挑入饑餓12h的試蟲，設(shè)無菌水和相應(yīng)的發(fā)酵培養(yǎng)基為對(duì)照，每個(gè)處理20頭，重復(fù)3次于溫度280C，光周期L:D＝16:8,相對(duì)濕度75％-85％的恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24,48,72,96,120h后觀察其死亡蟲數(shù)，并計(jì)算死亡率；

(6)發(fā)酵產(chǎn)物提取：收集菌絲體，分別用乙醇、氯仿、石油醚、乙酸乙酯、甲醇等進(jìn)行抽提，得到最佳提取工藝。

以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理和主要特征及本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其等效物界定。