本發(fā)明屬于生物化學(xué)與分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及miR24-1在抑制肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

癌癥是危害人類健康的頭號殺手，世界衛(wèi)生組織2014年發(fā)布的癌癥白皮書中指出，肝癌在我國無論男性還是女性的發(fā)病率均為前五位。轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)及致死的重要原因，也是決定腫瘤臨床治療和評估預(yù)后的重要指標(biāo)。有關(guān)其分子機制的研究表明,它是一個多階段復(fù)雜的過程,其中包括腫瘤細(xì)胞的脫落、遷移、粘附、生長等,每一階段都受著不同因素的影響及相關(guān)基因的調(diào)控。因此，探討與腫瘤轉(zhuǎn)移的分子機制,尋找預(yù)防和治療的有效途徑,是目前腫瘤生物學(xué)研究的一項重要課題。

據(jù)報道，細(xì)胞內(nèi)的O連接的N-乙酰葡萄糖胺(O-GlcNAc)修飾在幾乎所有重要生理過程中都發(fā)揮重要作用。這種糖基化修飾在細(xì)胞內(nèi)普遍存在于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，并對細(xì)胞內(nèi)多種信號通路產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用。目前研究表明,多種與重大疾病密切相關(guān)的蛋白質(zhì)均可以發(fā)生O-GlcNAc修飾，并且這種糖基化修飾對于疾病的產(chǎn)生、發(fā)展均具有密切的關(guān)系。O-GlcNAc轉(zhuǎn)移酶(OGT)在哺乳動物中普遍存在的，其作用是就是將單個存在的N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)通過β-構(gòu)型以O(shè)-連接的糖苷鍵形式連接到目的蛋白的絲氨酸(Ser)或蘇氨酸(Thr)的羥基上。OGT的表達和活性直接決定了胞內(nèi)O-GlcNAc修飾水平，進而影響了包括惡性腫瘤在內(nèi)的多種重大疾病的發(fā)生發(fā)展。

miRNA是一類普遍存在于細(xì)胞當(dāng)中的，長度大約為22個核苷酸的非編碼小分子RNA，通過與靶mRNA的3’-非翻譯區(qū)(3’-UTR)結(jié)合在轉(zhuǎn)錄后水平上對基因的表達進行調(diào)節(jié)。越來越多的研究表明miRNA與細(xì)胞癌變、轉(zhuǎn)移、侵襲等病理過程密切相關(guān)。越來越多的研究指出，miRNA通過靶向細(xì)胞內(nèi)的糖基轉(zhuǎn)移酶，調(diào)控胞內(nèi)糖基化水平和糖鏈結(jié)構(gòu)。然而，目前關(guān)于miRNA調(diào)控OGT表達分子機制的研究還未見報道。miR24-1是廣泛存在于哺乳動物細(xì)胞中的一種具有生長抑制功能的miRNA。研究表明，miR24-1在細(xì)胞生長、凋亡、分化以及腫瘤發(fā)生等過程中起著重要的調(diào)控作用。但miR24-1在調(diào)控腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用機制還知之甚少。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了miR24-1在抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

本發(fā)明的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)建立在小鼠肝癌細(xì)胞中microRNA差異表達芯片之上，根據(jù)芯片結(jié)果，篩選出在低轉(zhuǎn)移能力的小鼠肝癌細(xì)胞(Hca-P)和高轉(zhuǎn)移能力的小鼠肝癌細(xì)胞(Hca-F)中存在顯著表達差異的miRNAs作為候選miRNA，利用RT-qPCR驗證芯片結(jié)果，找到在兩種細(xì)胞中存在顯著差異的miR24-1作為研究的基礎(chǔ)。接下來，利用western blotting實驗方法發(fā)現(xiàn)OGT在兩種細(xì)胞中的表達量同樣存在顯著差異，并與miR24-1在兩種細(xì)胞中的表達差異吻合。為了驗證OGT是miR24-1的靶基因之一，設(shè)計實驗構(gòu)建了雙熒光素酶報告基因，并將miR24-1的模擬物：miR24-1mimic與報告基因共轉(zhuǎn)染至293-T中，通過檢測，證實了OGT為miR24-1的靶基因。最后，將miR24-1的模擬物和抑制物：miR24-1 mimic、miR24-1 inhibitor分別轉(zhuǎn)染到上述兩種細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)miR24-1的mimic可以抑制OGT在兩種細(xì)胞中的表達量。同時，miR24-1在細(xì)胞中的過表達可以抑制其增殖、遷移、侵襲和黏附能力。因此,miR24-1具有抑制小鼠腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力，可以應(yīng)用于抑制腫瘤轉(zhuǎn)移藥物的開發(fā)領(lǐng)域。

具體地，本發(fā)明提供一種miR24-1在抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用，所述miR24-1的序列如SEQ ID NO.1所示。

本發(fā)明還提供miR24-1的模擬物在抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用，所述miR24-1模擬物的的正義鏈序列如SEQ ID NO.2所示，反義鏈序列如SEQ ID NO.3所示。

本發(fā)明還提供miR24-1的靶基因，該靶基因為OGT。

所述的miR24-1的靶基因為OGT，miR24-1或miR24-1模擬物通過抑制OGT的表達，實現(xiàn)抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。

在優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述miR24-1或miR24-1模擬物用于制備抑制肝癌轉(zhuǎn)移藥物。

在本發(fā)明所述miR24-1可以用于制備抑制肝癌等轉(zhuǎn)移性腫瘤轉(zhuǎn)移的藥物。具體應(yīng)用時，可以將miR24-1的模擬物用于藥物設(shè)計，也可以構(gòu)建miR24-1的真核表達載體，用于基因治療。

附圖說明

圖1表示miR24-1在Hca-P，Hca-F兩種小鼠肝癌細(xì)胞中的相對表達量的real-time PCR結(jié)果。

圖2表示OGT蛋白在Hca-P，Hca-F兩種小鼠肝癌細(xì)胞中的表達量的real-time PCR結(jié)果和Western Blotting實驗結(jié)果。

圖3表示雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)分析miR24-1的mimic OGT-3’UTR/pGL-3熒光強度的影響。

圖4表示轉(zhuǎn)染miR24-1的mimic、inhibitor后OGT蛋白在Hca-P，Hca-F兩種小鼠肝癌細(xì)胞中的表達量。

圖5表示Hca-P、Hca-F兩種細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR24-1的mimic、inhibitor后細(xì)胞增殖能力的變化。

圖6表示Hca-F小鼠肝癌分別轉(zhuǎn)染miR24-1的mimic、inhibitor后的顯微鏡圖。

圖7表示Hca-F小鼠肝癌分別轉(zhuǎn)染miR24-1的mimic、inhibitor后細(xì)胞粘附能力的變化。

圖8表示Hca-P，Hca-F兩種小鼠肝癌分別轉(zhuǎn)染miR24-1的inhibitor、mimic后的顯微鏡圖。

圖9表示Hca-P，Hca-F兩種小鼠肝癌分別轉(zhuǎn)染miR24-1的inhibitor、mimic后細(xì)胞侵襲能力的變化。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的應(yīng)用范圍。下面實施例中未注明具體實驗條件的方法，通常按照常規(guī)條件或分子克隆中所述條件，或按照產(chǎn)品說明書上所提供的條件。下面實施例中所用的材料、試劑等如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

本發(fā)明的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)建立在小鼠肝癌細(xì)胞中microRNA差異表達芯片之上，根據(jù)芯片結(jié)果，篩選出在低轉(zhuǎn)移能力的小鼠肝癌細(xì)胞(Hca-P)和高轉(zhuǎn)移能力的小鼠肝癌細(xì)胞(Hca-F)中存在顯著表達差異的miRNAs作為候選miRNA，根據(jù)芯片結(jié)果的分析，確定候選的miRNA為miR24-1，其序列為UGGCUCAGUUCAGCAGGAACAG。

本發(fā)明使用的細(xì)胞、試劑盒以及試劑：

所述肝癌細(xì)胞Hca-P為低轉(zhuǎn)移能力的小鼠肝癌細(xì)胞、所述肝癌細(xì)胞Hca-F為高轉(zhuǎn)移能力的小鼠肝癌細(xì)胞，根據(jù)文獻(Y.Guo et al.The International Journal of Biochemistry&Cell Biology,2014,53,1-8)獲得。pGL3載體購自Promega(USA)，pMD-19T載體購自TaKaRa(Japan)。

miR24-1的模擬物、抑制物名稱和序列如表1。

表1.miR24-1、miR24-1的模擬物、抑制物序列

實施例1

miR24-1在不同小鼠肝癌細(xì)胞中的表達：將對數(shù)期的小鼠肝癌細(xì)胞Hca-P、Hca-F分別懸浮培養(yǎng)在含有90％RPMI1640和10％血清的全培培養(yǎng)基中，在37℃、5％CO₂的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)24h，得到狀態(tài)良好的小鼠肝癌細(xì)胞。收集細(xì)胞，通過Trisol法提取細(xì)胞中的總RNA。將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，RNA模板的含量為2μg總RNA。將反轉(zhuǎn)得到的cDNA根據(jù)進行real-time PCR檢測miR24-1在三種細(xì)胞中的表達量，根據(jù)試劑盒(Bulge-Loop^TMmiRNA qRT-PCR，RIBOBIO)的說明進行，通過PCR反應(yīng)擴增miR24-1。圖1為miR24-1在兩種細(xì)胞中的相對表達量，可見miR24-1在Hca-P中的表達量顯著高于Hca-F，說明miR24-1的表達量與小鼠肝癌細(xì)胞的惡性程度負(fù)相關(guān)。

實驗結(jié)果與芯片結(jié)果一致，即miR24-1在低轉(zhuǎn)移能力的小鼠肝癌細(xì)胞中的表達量顯著高于高轉(zhuǎn)移能力的小鼠肝癌細(xì)胞。

實施例2

為了尋找miR24-1的靶基因，通過TargetScan、MiRDB等生物信息預(yù)測軟件找到了感興趣的靶基因之一：OGT，將此作為研究對象。OGT是真核細(xì)胞生物中高度保守的一個糖基轉(zhuǎn)移酶，其表達量與腫瘤的惡性程度呈正相關(guān)。

具體為：將對數(shù)期的小鼠肝癌細(xì)胞Hca-P、Hca-F分別懸浮培養(yǎng)在含有90％RPMI1640和10％血清的全培培養(yǎng)基中，在37℃、5％CO₂的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)24h，收集細(xì)胞，分別提取RNA和總蛋白質(zhì)，通過RT-qPCR和Western blotting實驗(OGT的qPCR引物為F:5’-TTCGGGAATCACCCTACTTCA-3’,R:5’-TACCATCATCCGGGCTCAA-3’)，證實了兩種細(xì)胞中OGT的表達，結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明OGT在Hca-F的表達量顯著高于Hca-P，OGT在兩種細(xì)胞中的相對表達量與miR24-1在兩種細(xì)胞中的相對表達量存在正確的邏輯關(guān)系，說明OGT的表達與miR24-1具有相關(guān)性。

為了直接證明OGT是miR24-1的靶基因，構(gòu)建了雙熒光素酶報告基因，設(shè)計引物將OGT 3’UTR區(qū)域中與miR24-1結(jié)合位點的片段擴增出來，其結(jié)合位點如下所示：

并將此段序列連接到pGL-3載體中，然后將其與miR24-1的mimic共轉(zhuǎn)染到293-T中。

擴增片段引物設(shè)計：

設(shè)計引物擴增OGT基因(NM_181672)的3’UTR非翻譯區(qū)片段，并根據(jù)pGL-3載體上的酶切位點選擇適合的酶切位點，在引物的5’端和3’端分別加入XbaI酶切位點，引物分別命名為OGT/3’UTR-F(上游引物)OGT/3’UTR-R(下游引物)，引物序列如下：

OGT/3’UTR-F：5’-AATTCTAGAATGCAGCTGGCAACAAAC-3’

OGT/3’UTR-R：5’-ACTCTAGACCCTATCATGCAGGAAGTAAGT-3’

上述OGT基因(NM_181672)的mRNA序列如SEQ ID No.4，總長度為5497bp。

按照前述方法提取Hca-P細(xì)胞中的總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，使用PCR擴增試劑盒(TaKaRa PCR Amplification Kit,Japan)擴增目的片段。PCR體系如下所示：

PCR反應(yīng)體系(30μl)：

PCR條件為：95℃，預(yù)變性4min；94℃變性40s，60℃復(fù)性40s，70℃延伸60s，40個循環(huán)；72℃延伸10min；4℃保存。

反應(yīng)結(jié)束后，PCR反應(yīng)產(chǎn)物進行2％的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，目的條帶進行切膠回收步驟，收集目的片段(即OGT的3’UTR片段)，測序，序列如SEQ ID No.5，長度229bp。將目的片段與克隆載體pMD-19T在16℃下過夜連接，目的片段和pMD-19T分別用XbaI進行酶切后，進行連接，連接體系如下：

將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至制備好的感受態(tài)細(xì)胞E.coli JM109中，具體方法如下：

(1)取200μl感受態(tài)細(xì)胞溶液，加入10μl連接產(chǎn)物，混勻，于冰上30min；

(2)42℃水浴90秒鐘熱激，放置于冰水中2min；

(3)加入37℃預(yù)熱培養(yǎng)基(無抗性)振蕩培養(yǎng)50min；

(4)取出50μl轉(zhuǎn)化物涂于含Amp的LB瓊脂平板培養(yǎng)基上，將平板放置于孵箱中，37℃培養(yǎng)過夜。

篩選陽性克?。?/p>

(1)隨機挑取平板上獨立的圓滑的菌落，37℃下?lián)u菌培養(yǎng)約12h，收集菌液后，使用試劑盒(OMEGA質(zhì)粒小量提取試劑盒，D6942-01E.Z.N.A.TM Plasmid Mini Kit I)提取質(zhì)粒。將質(zhì)粒測序，選取測序正確的質(zhì)粒與pGL3-Control Vector連接。將質(zhì)粒和pGL3-Control Vector用XbaI進行雙酶切，得目的片段和線性載體，在16℃下過夜連接，連接體系如下：

將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞中，進行重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化實驗和質(zhì)粒提取實驗，方法同上述實驗過程。將大量提取好的重組質(zhì)粒與miR24-1的mimic共轉(zhuǎn)染至293-T細(xì)胞中，接下來進行雙熒光素酶報告基因檢測(Reporter Assay System,Promega,USA)

具體為：將重組質(zhì)粒與miR24-1的模擬物共轉(zhuǎn)染至293-T細(xì)胞培養(yǎng)12小時后，收集細(xì)胞，用裂解液進行裂解，裂解液按照試劑說明配置螢火蟲熒光素酶檢測試劑工作液和Renilla熒光素酶檢測工作液，用熒光測定儀進行檢測，檢測結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果如圖3所示。圖3中，control為沒有轉(zhuǎn)染的293-T細(xì)胞，pGL3-OGT-3’-UTR+mimic為轉(zhuǎn)染了miR24-1的模擬物的293-T細(xì)胞，pGL3-OGT-3’-UTR為轉(zhuǎn)染了pGL3-OGT-3’-UTR的陽性對照293-T細(xì)胞，pGL3為只轉(zhuǎn)染pGL3空載體的陽性對照293-T細(xì)胞?？梢?，miR24-1的模擬物可以顯著抑制pGL3的熒光強度，故OGT為miR24-1的靶基因之一。

實施例3

為了進一步尋找miR24-1與小鼠肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的關(guān)系，將miR24-1的模擬物(mimic)、miR24-1的抑制物(inhibitor)和隨機miRNA(ScrambledmiRNA)分別轉(zhuǎn)染至Hca-P、Hca-F細(xì)胞中。培養(yǎng)36-48小時后，收集細(xì)胞，提取總蛋白，通過Western Blotting檢測OGT的表達水平，結(jié)果如圖4所示，圖中給出蛋白條帶光密度相對定量。試驗結(jié)果可見，轉(zhuǎn)染miR24-1的mimic可以下調(diào)OGT在細(xì)胞中的表達水平，相應(yīng)的，轉(zhuǎn)染miR24-1的inhibitor上調(diào)了OGT的表達水平。

實施例4

為了進一步研究上調(diào)、下調(diào)miR24-1在三種細(xì)胞中的表達量對細(xì)胞功能的影響，進行細(xì)胞增殖、侵襲、遷移和黏附的實驗。

1.對小鼠肝癌細(xì)胞增殖的影響

細(xì)胞增殖-CCK8實驗：采用CCK8試劑盒(Dojindo,Japan)進行檢測，具體方法如下：

收集成功轉(zhuǎn)染miR24-1的mimic、inhibitor以及隨機miRNA 24h的Hca-P，Hca-F細(xì)胞，用血球計數(shù)板計數(shù)大約2×10⁴個細(xì)胞，并將記數(shù)后的細(xì)胞鋪在96孔板的每孔中，總體積為100μl，每組設(shè)3個復(fù)孔。將96孔板放置于37℃，CO₂培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)12h、24h、48h、72h。每孔細(xì)胞懸液中加10μl CCK-8溶液，置于37℃，CO₂培養(yǎng)箱中孵育2h。測定450nm處各組細(xì)胞的吸光度，記錄數(shù)據(jù)，采用重復(fù)測量資料的方差分析方法來分析各組數(shù)據(jù)，結(jié)果如圖5所示。圖5可見，轉(zhuǎn)染了miR24-1模擬物(miR24-1mimic)的小鼠肝癌細(xì)胞Hca-P、Hca-F的增殖速率顯著低于轉(zhuǎn)染了miR24-1抑制物(miR24-1inhibitor)的小鼠肝癌細(xì)胞，表明miR24-1可以抑制小鼠肝癌細(xì)胞Hca-P、Hca-F的增殖速率。

2.對小鼠肝癌細(xì)胞的粘附能力的影響

使用Melting ECMatrix gel(BD，USA)包被96孔板，使用含0.1％BSA的無血清培養(yǎng)基懸浮Hca-F細(xì)胞，并種植于包被好的96-well板中，37℃孵育2h。冷PBS洗掉未結(jié)合的細(xì)胞，使用40％甲醇配制的0.3％結(jié)晶紫標(biāo)記結(jié)合細(xì)胞，染色持續(xù)30min，ddH₂O清洗后使用顯微鏡觀察并計數(shù)。每個處理需要三個復(fù)孔。結(jié)果如圖6、7所示：mimic可以增加Hca-F細(xì)胞的黏附能力。

3.對細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell小室法檢測miR24-1對Hca-P、Hca-F細(xì)胞侵襲能力的影響：將Melting ECMatrix gel(BD，USA)膠置于4℃過夜融化，待膠融化后，將膠分別與無血清的DME、RPMI1640培養(yǎng)基按1:10的比例混勻，加入混合液100μl于各個小室中。將小室置于在37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中孵育30min。吸出膠融化后小室中殘余的空培養(yǎng)基。收集成功轉(zhuǎn)染miR24-1的mimic、inhibitor以及隨機miRNA24h的Hca-P，Hca-F細(xì)胞，使用PBS洗滌細(xì)胞3次(1000rpm離心5min)，調(diào)整細(xì)胞密度至5×10⁴個/ml，吸取約100μl不含血清的培養(yǎng)基將各組細(xì)胞懸液按每孔100μl的量加入Transwell小室中，每組細(xì)胞設(shè)3個復(fù)孔。在24孔板的下室內(nèi)分別加入600μl全培養(yǎng)基，37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細(xì)胞24h。PBS沖洗各小室3次，用棉簽擦拭上室的上層細(xì)胞(未穿過小室的細(xì)胞)。另取24孔板，在每孔中加入約200μl 4％的多聚甲醛，將小室置于其中，使膜浸沒在多聚甲醛中，固定15min后，取出Transwell小室，用PBS沖洗三次，沖洗小室下部未固定的細(xì)胞。接下來，待膜風(fēng)干后將小室浸在含0.1％結(jié)晶紫溶液的24孔板中，染色15min。PBS小心洗膜3次，至小室上多余的結(jié)晶紫染色洗去。正置顯微鏡觀察Transwell小室下底面發(fā)生轉(zhuǎn)移的細(xì)胞，并對轉(zhuǎn)移的細(xì)胞進行計數(shù)，各組細(xì)胞間的差異采用單因素方差分析，SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析，結(jié)果如圖8、9所示。圖9中可見，轉(zhuǎn)染miR24-1的inhibitor后穿過小室的Hca-P細(xì)胞數(shù)量顯著高于轉(zhuǎn)染了隨機miRNA的細(xì)胞數(shù)量。在Hca-F細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染miR24-1的mimic則會減少穿過小室的細(xì)胞數(shù)，這說明miR24-1可以抑制小鼠肝癌的侵襲能力，相反的，miR24-1的inhibitor可以提高小鼠肝癌細(xì)胞的侵襲能力。

本發(fā)明公開了miR24-1在制備抑制腫瘤轉(zhuǎn)移藥物中的應(yīng)用，所述miR24-1的序列如SEQ ID NO.1所示。通過研究發(fā)現(xiàn)，miR24-1在高轉(zhuǎn)移能力的小鼠肝癌細(xì)胞中的表達量顯著低于不具有轉(zhuǎn)移能力的小鼠肝癌細(xì)胞，同時本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR24-1后小鼠肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和黏附能力均減弱。因此認(rèn)為，miR24-1可以抑制小鼠肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，降低小鼠肝癌細(xì)胞的惡性程度。針對具有轉(zhuǎn)移能力的小鼠肝癌細(xì)胞，將miR24-1或其類似物miR24-1的mimic制備成抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的藥物，或也可以構(gòu)建miR24-1的真核表達載體，用于基因治療。

序列表

<110> miR24-1在制備抑制腫瘤轉(zhuǎn)移藥物中的應(yīng)用

<120> 大連理工大學(xué)

<130> 2011

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工合成

<400> 1

cuccggugccuacugagcugauaucaguucucauuucacacacuggcucaguucagcaggaacaggag

<210> 2

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工合成

<400> 2

uggcucaguucagcaggaacag 23

<210> 3

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工合成

<400> 3

cuguuccugcugaacugagcca 23

<210> 4

<211> 5497

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

1 agttccggcc catgttgttt cggccgagga gccgtcgccg ccatttcaag accgtactag

61 gtagatggtc aattagagtt cccagggttt gaagcctgta actgctgccg ccgctcaagc

121 cctccagagc attgctacgg ctgctgccct tgtactacta cctccaaata cgttcttgct

181 ggtagtggcg gcagcaggac caattacctc ttttttgctc tccctcgaga agctccagat

241 ggcgtcttcc gtgggcaacg tggccgacag cacagaacca acgaaacgta tgctttcctt

301 ccaagggtta gctgagttgg cacatcgaga atatcaggca ggagattttg aggcagctga

361 gagacactgc atgcagctct ggagacaaga gccagacaat actggtgtgc ttttattact

421 ttcatctata cacttccagt gtcgaaggct ggacagatct gctcacttta gcactctggc

481 aattaaacag aacccccttc tggcagaagc ttattcgaat ttggggaatg tgtacaagga

541 aagagggcag ttgcaggagg caattgagca ttatcgacat gcattgcgtc tcaaacctga

601 tttcatcgat ggttatatta acctggcagc cgccttggta gcagcgggtg acatggaagg

661 ggcagtacaa gcttacgtct ctgctcttca gtacaatcct gatttgtact gtgttcgcag

721 tgacctgggg aacctgctca aagccctggg tcgcttggaa gaagccaagg catgttattt

781 gaaagcaatt gagacgcaac cgaactttgc agtagcttgg agtaatcttg gctgtgtttt

841 caatgcacaa ggggaaattt ggcttgcaat tcatcacttt gaaaaggctg tcacccttga

901 cccaaacttt ctggatgctt atatcaattt aggaaatgtc ttgaaagagg cacgcatttt

961 tgacagagct gtggcagctt atcttcgtgc cctaagtttg agtccaaatc acgcagtggt

1021 gcacggcaac ctggcttgtg tatactatga gcaaggcctg atagatctgg caatagacac

1081 ctacaggcgg gctatcgaac tacaaccaca tttccctgat gcttactgca acctagccaa

1141 tgctctcaaa gagaagggca gtgttgctga agcagaagat tgttataata cagctctccg

1201 tctgtgtccc acccatgcag actctctgaa taacctagcc aatatcaaac gagaacaggg

1261 aaacattgaa gaggcagttc gcttgtatcg taaagcatta gaagtcttcc cagagtttgc

1321 tgctgcccat tcaaatttag caagtgtact gcagcagcag ggaaaactgc aggaagctct

1381 gatgcattat aaggaggcta ttcgaatcag tcctaccttt gctgatgcct actctaatat

1441 gggaaacact ctaaaggaga tgcaggatgt tcagggagcc ttgcagtgtt atacgcgtgc

1501 catccaaatt aatcctgcat ttgcagatgc acatagcaat ctggcttcca ttcataagga

1561 ttcagggaat attccagaag ccatagcttc ttaccgcacg gctctgaaac ttaagcctga

1621 ttttcctgat gcttattgta acttggctca ttgcctgcag attgtctgtg attggacaga

1681 ctatgatgag cgaatgaaga agttggtcag tattgtggct gaccagttag agaagaatag

1741 gttgccttct gtgcatcctc atcatagtat gctatatcct ctttctcatg gcttcaggaa

1801 ggctattgct gagaggcacg gcaacctgtg cttagataag attaatgttc ttcataaacc

1861 accatatgaa catccaaaag acttgaagct cagtgatggt cggctgcgtg taggatatgt

1921 gagttccgac tttgggaatc atcctacttc tcaccttatg cagtctattc caggcatgca

1981 caatcctgat aaatttgagg tgttctgtta tgccctgagc ccagacgatg gcacaaactt

2041 ccgagtgaag gtgatggcag aagccaatca tttcattgat ctttctcaga ttccatgcaa

2101 tggaaaagca gctgatcgca tccatcagga tggaattcat atccttgtaa atatgaatgg

2161 ctatactaag ggcgctcgaa atgagctttt tgctctcagg ccagctccta ttcaggcaat

2221 gtggctggga taccctggga cgagtggtgc gcttttcatg gattatatta tcactgatca

2281 ggaaacttcg ccagctgaag ttgctgagca gtattccgag aaattggctt atatgcccca

2341 cacttttttt attggtgatc atgctaatat gttccctcac ctgaagaaaa aagcagtcat

2401 cgattttaag tccaatgggc acatttatga caatcggata gttctgaatg gcatcgacct

2461 caaagcattt cttgatagtc taccagatgt gaaaattgtc aagatgaagt gtcctgatgg

2521 aggagacaat gcagatagca gtaacacagc tcttaatatg cctgttattc ctatgaatac

2581 tattgcagaa gcagttattg aaatgattaa ccgaggacag attcaaataa caattaatgg

2641 attcagtatt agcaatggac tggcaactac tcagatcaac aataaggctg caactggaga

2701 ggaggttccc cgtaccatta ttgtaaccac ccgttctcag tacgggttac cagaagatgc

2761 catcgtatac tgtaacttta atcagttgta taaaattgac ccttctactt tgcagatgtg

2821 ggcaaacatt ctgaagcgtg ttcccaatag tgtactctgg ctgttgcgtt ttccagcagt

2881 aggagaacct aatattcaac agtatgcaca aaacatgggc ctgccccaga accgtatcat

2941 tttttcacct gttgctccta aagaggaaca cgtcaggaga ggccagctgg ctgatgtctg

3001 cttggacact ccactctgta atgggcacac cacagggatg gatgtcctct gggcagggac

3061 ccccatggtg actatgccag gagagactct tgcttctcga gttgcagcat cccagctcac

3121 ttgcttaggt tgtcttgagc ttattgctaa aaacagacaa gaatatgaag acatagctgt

3181 gaagctggga actgatctag aatacctgaa gaaagttcgt ggcaaagtct ggaagcaaag

3241 aatatctagc cctctgttca acaccaaaca atacacaatg gaactagagc ggctctatct

3301 acagatgtgg gagcattatg cagctggcaa caaacctgac cacatgatta agcctgttga

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3421 aaccttctgg gggaaaggga actagataac atacttctta cttgtctgta cagtaccttg

3481 ttgcagatgg gtgatatata atggtaatag aatagcacag ccagacttgc ttcctgcatg

3541 gtagggagag acacaaaaga tgggaaactg cttttccaca aggaatctcc gtagaatttt

3601 gcggcgacca gatggtgcat aggtctggaa ggtctgatct cccttggtct tccatgggat

3661 ggttagtgtg gaggggagat atagattgtc cggccgcttt gtgattccat ggattgattc

3721 agtcttctgg attttttttt ctttatattt tgggtactgg agcttttaaa aatgtttggt

3781 ttcaggtatt tttattcatg tgaagtgtat atgattctct tgagataagg ttttaagcta

3841 aaatgttact ccctgtttta gtttctgaac tctgacagat tgacagggac tttgctggtg

3901 tagtcttttt ataggtttta taaaccactt gagcctatat cagtcgtttt agtgtctgac

3961 ctaatatttg gagctatcag tgctttgttg atttagatga tgactcaaga ttttttctgg

4021 tccatttccc atttcctttt cttccctgac ccccataccc tcacccttaa aattctcctg

4081 taactcaact aacaaaatca agcctgattc aaaacatcct agggtgtttt aaacacacca

4141 tctggtgcca aatgaagatt tttaggagtg attactaatt atcaagggca cagttgtggt

4201 actgtcattg ataataatat agtttttttt tttttcctaa ttttgacctg tttcaccagt

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4321 ttaccttcct ttctaaagtt tttttttttt ttttttaagt gagtcctgtt cttcctattt

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4441 acagttatct ccagtgcatt aaataacctt catcaagaaa taggttatag gtaaaatctc

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4561 ggtcttgaag tctgtacaga ttcagcctca gtagtagcga actgcactgc tgtttggttt

4621 ggagtacaaa ttagacttat agtcctcctg gaacttgagt tattaaaatc ataggaataa

4681 aattatggga tctcaacaaa gggtcgaggg tttgaggctt aaacaagcca acatatgaat

4741 atatgttttg tctcgctata ctgcacttac gctatccagt tgcaggtaat tttttgtctg

4801 ctagtagtgt tctagattat gtctttccaa agcgctgagg ctgtgcacct attctgtagt

4861 tgcagctgat gcctgaatgt atcctagctg acaaattatt gattaataag aacttgaatt

4921 tctggaagat tcttactgtt aaccaaattt tgagcaagga gtctcaaagg taattctgaa

4981 ccagaattac atgttaatga acagtgtacc ttttaacagt gtaaatcacg gaatatccgt

5041 gaagggattt cttaatttat tttttaccgg ttgattgaaa tatcagttaa aggttgccag

5101 catggttgca gataaactga tgtttgaaat tcgctgaaat acttaatgtg gaataggata

5161 atatacttcc aatgccctca aggctgtgac cttacagcca ttttacatag cacatcattc

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5281 ttattgtaac aggcttttat ttccaggtaa tatgtcttgg aagacttaat tctgattaga

5341 gatatagata ttactggaaa ctaattgttt tttttctatt gtactctgct ttatcaaaga

5401 agtaaaacat ttaaatcgta ctacagaaat taagatgttg tcttgcgatc cttaataaat

5461 gaatgatttc cctttaatac ggaaaaaaaa aaaaaaa

<210> 5

<211> 229

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

ATGCAGCTGGCAACAAACCTGACCACATGATTAAGCCTGTTGAAGTCACCGAGTCAGCCTGAATAAAGACTGCGCACAGGAGAATTGCCCTATACCTGAGCCTCAACCTTCTGGGGGAAGGGAACTAGATAACATGCTTTGTGTGTATCTGTGTAGTTCTGTGTTGCAGACGGATGATATATAATGATAATAGAATAGCACATTCAGACTTACTTCCTGCATGATAGGG