本發(fā)明涉及細(xì)菌非編碼小RNA(small non-coding RNA,sRNA),特別是涉及一個乳酸乳球菌乳亞種YF11的非編碼小RNA s144、含有乳酸乳球菌乳亞種YF11的非編碼小RNAs144的載體、含該載體的乳酸乳球菌及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

細(xì)菌非編碼小RNA(small non-coding RNA,sRNA)是近年來在細(xì)菌等原核生物中發(fā)現(xiàn)的一類RNA調(diào)控子，它們不編碼蛋白質(zhì)，通常位于基因間區(qū)，長度在50-500nt之間，廣泛參與體內(nèi)多種生命活動的調(diào)控。細(xì)菌sRNA是細(xì)菌代謝、毒力和適應(yīng)環(huán)境壓力的重要調(diào)節(jié)因子，在應(yīng)對環(huán)境變化的基因表達調(diào)控中發(fā)揮重要作用，sRNA的功能涉及從結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)到催化作用，影響生物體內(nèi)各種加工過程，一個單獨的sRNA就能調(diào)控大量的基因并對細(xì)胞生理產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。sRNA主要通過堿基配對與靶標(biāo)mRNA結(jié)合導(dǎo)致mRNA翻譯和穩(wěn)定性的變化來發(fā)揮生物調(diào)控作用。迄今為止，大部分細(xì)菌sRNA的研究集中在大腸桿菌等模式生物中，在各種細(xì)菌中共發(fā)現(xiàn)超過150種sRNA，在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)了約80種sRNA。但隨著研究的不斷深入，已有越來越多的研究轉(zhuǎn)向其他細(xì)菌。

Nisin(乳鏈菌肽)是由乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)產(chǎn)生的一種具有抑菌作用的天然小分子多肽，對于大多數(shù)革蘭氏陽性菌具有抑菌效果，并且通過與其他的抑菌劑聯(lián)合還能夠抑制某些革蘭氏陰性菌的生長。Nisin是用于食品的生物防腐劑，已廣泛應(yīng)用于乳制品、肉制品和酒精飲料等防腐保鮮中，并且極有潛力用于藥物，獸藥及保健品中。但目前nisin生產(chǎn)成本較高,阻礙了其在生產(chǎn)應(yīng)用領(lǐng)域的發(fā)展。

乳酸乳球菌在發(fā)酵過程中能夠產(chǎn)生乳酸，乳酸的積累導(dǎo)致發(fā)酵液的pH下降，進而導(dǎo)致乳酸乳球菌生長停止，甚至死亡。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種乳酸乳球菌乳亞種YF11的非編碼小RNA s144。

本發(fā)明的第二個目的是提供一種含有乳酸乳球菌乳亞種YF11的非編碼小RNAs144的載體。

本發(fā)明的第三個目的是提供一種含有上述載體的重組乳酸乳球菌。

本發(fā)明的第四個目的是提供一種含有上述載體的重組乳酸乳球菌在發(fā)酵生產(chǎn)乳鏈菌肽的應(yīng)用。

本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：

乳酸乳球菌乳亞種YF11的非編碼小RNAs144，該核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示；或與序列表SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有90％以上同源性并與耐酸相關(guān)的核苷酸序列。

含有乳酸乳球菌乳亞種YF11的非編碼小RNA s144的載體,其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。

含有上述載體的重組乳酸乳球菌。

上述重組乳酸乳球菌在發(fā)酵生產(chǎn)乳鏈菌肽的應(yīng)用。

本發(fā)明優(yōu)點：

實驗結(jié)果表明：乳酸乳球菌乳亞種YF11的非編碼小RNA s144過表達后，含有s144過表達的乳酸乳球菌在酸性環(huán)境下的生存能力明顯增強，提高在酸性發(fā)酵液的存活率，增加nisin的穩(wěn)定性，從而提高nisin產(chǎn)量。

附圖說明

圖1為乳酸乳球菌乳亞種YF11的非編碼小RNA s144過表達載體pLEB124-s144的物理圖譜。

圖2為菌株的在不同pH胰蛋白胨水溶液應(yīng)激3h后存活率。

圖3為菌株生物量隨時間變化圖。

圖4為菌株的nisin效價隨時間變化圖。

圖2-圖4中：

含有空質(zhì)粒pLEB124的乳酸乳球菌乳亞種YF11對照菌株圖示中記為YF11+菌；

含有載有乳酸乳球菌乳亞種YF11的非編碼小RNA s144的pLEB124載體的重組乳酸乳球菌(本發(fā)明的菌株)菌株命名為乳酸乳球菌乳亞種YF11－s144，圖示中記為s144菌；

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明，本發(fā)明的實施例是為了使本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠更好地理解本發(fā)明，但并不對本發(fā)明作任何限制。

各實施例所用的乳酸乳球菌乳亞種(Lactococcus lactis subsp.lactis)YF11菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心,保藏號為CGMCC NO.12429，保藏時間為2015年5月10日。地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101。

本發(fā)明中所用的實驗方法如未作特別說明均是采用了常規(guī)方法。

所用質(zhì)粒pLEB124購買于蘇州金唯智生物科技有限公司。

實施例1

乳酸乳球菌乳亞種YF11的非編碼小RNA s144(簡稱s144)序列的獲得

1、文庫的構(gòu)建及測序

Small RNA文庫：提取樣品總RNA后用切膠回收片段(18-150nt)，按照Illumina TruSeq^TM SmallRNA Sample Preparation protocol構(gòu)建small文庫，最后建好的文庫用Illumina HiSeq2000進行測序。

鏈特異性文庫：將提取樣品總RNA去除rRNA后打斷成短片段，以mRNA為模板先后合成兩條cDNA鏈，適當(dāng)修飾后將第二條cDNA鏈，PCR擴增后將建好的測序文庫用Illumina HiSeq2000進行測序。

2、數(shù)據(jù)預(yù)處理與生物信息學(xué)分析

測序所得的原始數(shù)據(jù)需要去除雜質(zhì)數(shù)據(jù)：含adaptor的reads、N的比例大于10％的reads、低質(zhì)量reads，最后獲得clean reads。然后對clean reads進行拼接處理，獲得Full-length Tags，將tags比對到基因組、基因、rRNA和tRNA上，得到比對統(tǒng)計信息。

基因表達量的計算使用RPKM法(Reads Per Kb per Million reads)，其計算公式為：

其中，RPKM為某基因的表達量，C為唯一比對到該基因的reads數(shù)，N為唯一比對到參考基因的總reads數(shù)，L為該基因編碼區(qū)的堿基數(shù)。

3、樣品的制備與總RNA的提取

取出-80℃保藏的乳酸乳球菌乳亞種YF11菌株，接種到種子培養(yǎng)基中，30℃活化培養(yǎng)三代，然后以10％的接種量分別轉(zhuǎn)接到pH 7.0和pH5.0的發(fā)酵培養(yǎng)基中，繼續(xù)應(yīng)激培養(yǎng)1h，4℃，8000rpm離心5min去上清收集菌體，無菌生理鹽水洗滌菌體三次，用液氮迅速冷凍。在冰上使用細(xì)胞破碎儀對菌體進行機械破壁(超聲5s，暫停5s，持續(xù)10min)后用trizol試劑重懸并混勻。使用ZR RNA MiniPrepTM提取菌體總RNA，RNA樣品-80℃保存在加有RNA酶抑制劑的RNase free水中。按照試劑盒說明書進行操作。檢測提取的總RNA的濃度和純度，使用合格的樣品進行后續(xù)cDNA的合成。

使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒，按照cDNA的合成體系將各反應(yīng)物加入PCR管中，3000r/min離心30s。cDNA合成程序：25℃溫育5min，42℃水浴60min進行合成cDNA反應(yīng)，70℃加熱5min終止反應(yīng)。測定cDNA樣品的濃度和純度，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1：cDNA的合成體系組成：

乳酸乳球菌種子培養(yǎng)基配方：酵母粉15g，蛋白胨15g，KH₂PO₄20g，蔗糖15g，NaCl 1.5g，MgSO₄·7H₂O 0.15g，加水至1L，調(diào)節(jié)pH至7.2，瓊脂粉15g(固體培養(yǎng)基)，121℃高溫蒸氣滅菌20min；

乳酸乳球菌發(fā)酵培養(yǎng)基配方酵母粉15g，蛋白胨15g，KH₂PO₄2％，蔗糖2％，玉米漿3g，半胱氨酸2.6g，NaCl 1.5g，MgSO₄·7H₂O 0.15g，加水至1L，調(diào)節(jié)pH至7.2，121℃高溫蒸氣滅菌20min。

4、實時熒光定量PCR驗證

將所得的cDNA按試劑說明書(480 SYBR Green I Master)稀釋至一定濃度用作qRT-PCR反應(yīng)的模板，按照RT-PCR反應(yīng)體系將模板加入離心管中，將樣品轉(zhuǎn)移至96孔板，設(shè)置3個平行，再加入其他反應(yīng)物，以上操作步驟均在冰上進行，驗證引物設(shè)計如表2所示。3000r/min簡短離心后，進行RT-PCR反應(yīng)。RT-PCR反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性10min；95℃變性10s，50℃復(fù)性10s，72℃延伸1min，共55個循環(huán)；72℃延伸5min；熔解曲線65℃起始1min，95℃終止。

RT-PCR反應(yīng)體系：

表2

引物序列如下：

說明：用SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4，結(jié)合表2其它組分，擴增得到16S RNA目標(biāo)片段；

用SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6，結(jié)合表2其它組分，擴增得到s144目標(biāo)片段。

5、小RNA的預(yù)測與確定

對于small RNA文庫，根據(jù)比對信息，過濾后得到那些比對到基因間區(qū)IGR(Intergenic region)和AM(Antisense to mRNA)類型的All-unitags且總表達量大于20的All-unitags列為候選的sRNA將其列為候選sRNA，該sRNA為乳酸乳球菌乳亞種YF11的非編碼小RNA s144，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

對于鏈特異性文庫，從中挑選出長度大于等于100bp且平均覆蓋深度大于等于2的gene model(TAR)，再從中找出位于基因間區(qū)(一個基因3’端下游100bp到下一個基因5’端上游100bp之間)的作為新轉(zhuǎn)錄本，這些轉(zhuǎn)錄本與蛋白庫(NR)比對不上的作為候選sRNA。對候選的小RNA，為了驗證所預(yù)測的候選sRNA在發(fā)酵培養(yǎng)基中酸應(yīng)激1h后表達量的變化情況，采用檢測目的sRNA相對于內(nèi)參基因16S rRNA的相對定量方法，即2-ΔΔCp法。具體計算方法如下：

ΔCp＝Cp(目的基因)-Cp(內(nèi)參基因)

ΔΔCp＝ΔCp(實驗組)-ΔCp(對照組)

相對倍數(shù)(實驗組/對照組)＝2^-ΔΔCp，以pH＝7.0條件下的為對照組，相對轉(zhuǎn)錄水平設(shè)為1，其他條件為實驗組。重復(fù)3次實驗，計算平均值。

為了驗證深度測序所得候選sRNA在酸脅迫下相對表達差異，通過qRT-PCR的方法檢測sRNA基因經(jīng)過酸應(yīng)激處理后表達量的變化，使用2^-ΔΔCt法分析耐酸相關(guān)sRNA在pH 5.0(實驗組)和pH 7.0(對照組)應(yīng)激下的差異表達相對倍數(shù)。從熒光定量RCR結(jié)果中篩選出了在酸性脅迫下表達量明顯上調(diào)的sRNA。

熒光定量PCR驗證sRNA上調(diào)情況見表3：

表3

實施例2、s144的功能分析

為了分析s144在乳酸乳球菌的生存和耐受性方面發(fā)揮的作用，構(gòu)建了s144過表達菌株

和缺失菌株，并進行了相關(guān)的檢測實驗。

1、s144過表達菌株的構(gòu)建及驗證

以乳酸乳球菌乳亞種YF11的基因組為模版，根據(jù)s144的核苷酸序列設(shè)計引物sRNA-F與sRNA-R進行PCR1擴增。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化后用DNA純化回收試劑盒回收后與質(zhì)粒pLEB124用BamHI和HindIII雙酶切，然后用T4DNA連接酶連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化TG1大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布具有紅霉素(150ug/ml)抗性的LB平板。對平板上的菌落用引物General-sRNA-F、General-sRNA-R進行PCR2反應(yīng)驗證，擴增出315bp的片段認(rèn)為是陽性克隆，將陽性菌落于LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒送測序。結(jié)果正確的質(zhì)粒即為過表達載體(含有乳酸乳球菌乳亞種YF11的非編碼小RNA s144的載體)，將其命名為pLEB124-s144，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。將過表達載體pLEB124-s144電轉(zhuǎn)到乳酸乳球菌乳亞種YF11感受態(tài)細(xì)胞中，涂布含有紅霉素(20ug/ml)抗性的種子培養(yǎng)基平板，30℃培養(yǎng)36小時，用引物General-sRNA-F、General-sRNA-R進行PCR3篩選陽性克隆轉(zhuǎn)化子即為乳酸乳球菌過表達株,即為本發(fā)明的含載有乳酸乳球菌乳亞種YF11的非編碼小RNA s144的pLEB124載體的重組乳酸乳球菌菌株命名為乳酸乳球菌乳亞種YF11－s144，簡稱YF11－s144，圖示中記為s144菌；

(1)引物序列

sRNA‐F：CGCGGATCCTCCTCCCCTTTCATATTTAGAA(SEQ ID NO.7)

sRNA‐R：CCCAAGCTTCAAATTACTTGAGGGCATCC(SEQ ID NO.8)

General‐sRNA‐F：ATTACTGAAGGGAACCTAGAATAGT(SEQ ID NO.9)

General‐sRNA‐R：CGACCTGAGGTAATTATAACCC(SEQ ID NO.10)

(2)PCR反應(yīng)體系

PCR1反應(yīng)體系：

PCR1反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性2min；95℃變性20s，Tm‐5℃復(fù)性20s，72℃延伸20s，共35個循環(huán)；72℃延伸5min。重疊延伸PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性2min；95℃變性20s，Tm+5℃復(fù)性20s(每個循環(huán)溫度下降0.5℃，直至Tm‐5℃)，72℃延伸20s，進行20個循環(huán)；95℃預(yù)變性2min；95℃變性20s，Tm‐5℃復(fù)性20s，72℃延伸20s，再進行15個循環(huán)；72℃延伸5min。PCR2反應(yīng)體系：

PCR2反應(yīng)條件：97℃預(yù)變性7min；94℃變性30s，55℃復(fù)性30s，72℃延伸1min，共30個循環(huán)；72℃延伸5min。

2、不同的乳酸乳球菌在不同pH的胰蛋白胨水溶液中應(yīng)激后生存能力分析。

乳酸乳球菌由于發(fā)酵后期發(fā)酵液的pH值降低會嚴(yán)重影響菌體的生長。為研究小RNA分子在酸性應(yīng)激下的生存能力，用胰蛋白胨水溶液作應(yīng)激培養(yǎng)基，應(yīng)激3小時后稀釋涂布計算存活率。

使用的菌株：YF11+菌和YF11－s144菌

具體方法包括以下步驟：

將YF11菌和YF11－s144菌分別接入種子培養(yǎng)基中，30℃靜置培養(yǎng)?；罨?，取6mL對數(shù)生長后期(約8h)，8000r/min，4℃離心10min，棄上清收集菌體。用等體積生理鹽水懸浮菌體，8000r/min，4℃離心10min，棄上清收集菌體，再重復(fù)一次該洗滌步驟。用3mL生理鹽水懸浮菌體，各取500μL菌懸液接入8mL不同pH梯度的胰蛋白胨水培養(yǎng)基(胰蛋白胨水培養(yǎng)基：胰蛋白胨2％，氯化鈉(NaCl)0.5％,分別調(diào)節(jié)至pH 7.0，5.0，4.0，3.0，2.0，121℃高溫蒸氣滅菌20min)中，于30℃靜置應(yīng)激3h。將pH 7.0、pH 5.0、pH 4.0條件下的菌體培養(yǎng)液用生理鹽水稀釋至10^-7，將pH3.0和pH2.0條件下的菌體培養(yǎng)液用生理鹽水稀釋至10^-6。每個樣品取100μL稀釋液涂布于pH 7.2的種子培養(yǎng)基平板上，30℃倒置培養(yǎng)。統(tǒng)計各個平板上菌落數(shù)，三個平行樣本取平均值；其pH 5.0、pH 4.0、pH3.0和pH2.0條件下的菌落數(shù)分別除以pH 7.0條件下的菌落數(shù)計算系列pH梯度胰蛋白胨水培養(yǎng)基脅迫3h后的存活率；之后將實驗組和對照組菌株在相同pH條件下的存活率作比值以此衡量乳酸乳球菌乳亞種YF11－s144耐酸性變化情況。檢測結(jié)果如圖2所示，可以看出，在酸應(yīng)激后，過表達菌株的生存率高于對照組，說明過表達的sRNA基因有助于菌株在低pH下生存。

3、s144過表達菌株生長狀況的測定

為檢測小RNA s144對菌體生存能力的影響，進行了發(fā)酵實驗：取出-20℃保存的YF11菌、YF11+菌、YF11－s144菌和YF11－Δs144菌活化3代后按5％的接種量接入到發(fā)酵培養(yǎng)基(乳酸乳球菌發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：酵母膏15，蛋白胨15，磷酸二氫鉀20，蔗糖20，玉米漿3，半胱氨酸2.6，無碘精鹽1.5，MgSO4·7H2O 0.15，pH 7.2)中，30℃恒溫靜置培養(yǎng)，每隔2h取發(fā)酵液樣品，8000r/min離心5min分離菌體。用等體積的生理鹽水重新懸浮菌體，然后對菌懸液進行稀釋測定OD₆₀₀值，以生理鹽水為對照，保證OD₆₀₀測量值在0.3-0.7之間線性范圍內(nèi)，繪制發(fā)酵液生物量隨時間變化曲線如圖3?？梢钥闯?，過表達菌株乳酸乳球菌乳亞種YF11－s144菌體量同期對比較空質(zhì)粒對照組高，生長情況比空質(zhì)粒對照組的好。推測該小RNA分子與菌體的生存能力相關(guān)。

4.nisin效價測定試驗

取出-20℃保存的YF11+菌和YF11－s144菌活化3代后按5％的接種量接入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃恒溫靜置培養(yǎng)，每隔2h取分別取500μL這四種菌的發(fā)酵液樣品與500μL無菌HCl溶液(0.02mol/L)混勻，然后煮沸5min，8000r/min再離心5min。取上清液用無菌HCl溶液(0.02mol/L)稀釋分別制成這四種菌在不同時間點的樣品。

將4℃保存的藤黃八疊球菌(Micrococcus flavus ATCC 10240，購買于2012年6月17日，購于上海研生實業(yè)有限公司)斜面取出，用2mL無菌生理鹽水洗下菌苔，將得到的菌懸液收集到無菌離心管中，取100μL菌懸液混勻于6mL無菌生理鹽水。nisin效價培養(yǎng)基(26mL)加熱融化后冷卻至70℃左右，加入1.5％的吐溫-20(390μL)，再冷卻至50℃左右，加入上述菌懸液迅速搖勻，倒入9mm無菌培養(yǎng)皿內(nèi)。待其凝固后用滅菌直徑7mm的打孔器在平板上均勻打出8個孔(其中6個孔加入樣品，2個孔加入nisin標(biāo)準(zhǔn)液)。稱取8mg nisin標(biāo)準(zhǔn)品溶于8mL無菌HCl溶液(0.02mol/L)制成10000IU/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后以此稀釋制成2000IU/mL、1000IU/mL、200IU/mL、100IU/mL、50IU/mL和25IU/mL系列nisin標(biāo)準(zhǔn)溶液。每個樣品設(shè)置三個平行，每個孔內(nèi)加入100μL的樣品或標(biāo)準(zhǔn)溶液，加樣時盡量讓四株菌在同一時間點取得的樣品分布在同一平板上，37℃恒溫培養(yǎng)24h。用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑，并以直徑平均值為橫坐標(biāo)，nisin效價的對數(shù)值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后將樣品的抑菌圈直徑值代入標(biāo)準(zhǔn)方程計算得到樣品的nisin效價。

由圖4可看出s144相比于對照菌株nisin產(chǎn)量有所增長，說明s144與nisin產(chǎn)量有關(guān)。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津大學(xué)

<120> 乳酸乳球菌乳亞種YF11的非編碼小RNA s144

<130>

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 115

<212> RNA

<213> Lactococcus lactis subsp.lactis

<400> 1

auuucagaua uuaauuguua auucuagaac ucaucgguug aacaaucgga aaucaacaau 60

uaauaucuga uucaaauagg gaaaagagaa uucuccuucg ggaggauuuu uuaau 115

<210> 2

<211> 4697

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

gaccggaaat atttacaaaa atcaatttaa caattcctta aaacatgcag gaattgacga 60

tttaaacaat attagctttg aacaattctt atctcttttc aatagctata aattatttaa 120

taagtaagtt aagggatgca taaactgcat cccttaactt gtttttcgtg tgcctatttt 180

ttgtgaatcg gattcacaga tgtctgcctg ttcatccgcg tccagctcgt tgagtttctc 240

cagaagcgtt aatgtctggc ttctgataaa gcgggccatg ttaagggcgg ttttttcctg 300

tttggtcact gatgcctccg tgtaaggggg atttctgttc atgggggtaa tgataccgat 360

gaaacgagag aggatgctca cgatacgggt tactgatgat gaacatgccc ggttactgga 420

acgttgtgag ggtaaacaac tggcggtatg gatgcggcgg gaccagagaa aaatcactca 480

gggtcaatgc cagcgcttcg ttaatacaga tgtaggtgtt ccacagggta gccagcagca 540

tcctgcgatg cagatccgga acataatggt gcagggcgct gacttccgcg tttccagact 600

ttacgaaaca cggaaaccga agaccattca tgttgttgct caggtcgcag acgttttgca 660

gcagcagtcg cttcacgttc gctcgcgtat cggtgattca ttctgctaac cagtaaggca 720

accccgccag cctagccggg tcctcaacga caggagcacg atcatgcgca cccgtggcca 780

ggacccaacg ctgcccgaaa ttctgcagga attcgaatgg ccatgggacg tcgacctgag 840

gtaattataa cccgggccct atatatggat ccatttcaga tattaattgt taattctaga 900

actcatcggt tgaacaatcg gaaatcaaca attaatatct gattcaaata gggaaaagag 960

aattctcctt cgggaggatt ttttaataag cttacttaag ttaatttttt tcactattct 1020

aggttccctt cagtaatacg tttcaaaccc atctctttta ggttcgaaag ccatgtgatt 1080

tcacatcgct ttttgcccaa tgcaaaaata cctcttataa catctctctt cttgaattat 1140

attttttcaa tatgatcatt gtataagttc ttcttactcg taccttattt tatcaaattt 1200

gacagaattt tgatagaata gtagtaataa atttttgtaa gcggttttta cataatgaaa 1260

tatttaactt ttatcatgta aatcaatttt gggggaaaat ttttatgaat catattccag 1320

tttttggcga aaagaatgaa ggaaaagact atcaagcaag atatggcgtc tactcaattg 1380

tagcaagaga gaacaaagaa atttgccttg ttcaagcccc taacggaatt ccaaatcttt 1440

aaaatgcccc ttaaaattca aaataaaggc atttaaaatt taaatatttc ttgtgataaa 1500

gtttgttaaa aaggagtggt tttatgactg ttatgtggtt atcgatagat ctgcgcgcga 1560

tcgatatcag cgctttaaat ttgcgcatgc tagctatagt tctagaggta ccggttgtta 1620

acgttagccg gctacgtata ctccggaata ttaataggcc taggatgcat atggcggccg 1680

cctgcagcaa ctcttcgtaa gtcatcttgc ccaacgtgaa tttttctagt gctatatatg 1740

ttttctccgc tgaggtattc attctattat gacattcatt cactaactca ttttcatttg 1800

ttattggctc atgtatatgt tctttttttc gaaatgcttc ataatatctt ataccaaata 1860

ttctctggga catcgcattg atgtgaatta attcgatcat tttgtttatt gcaatcgtat 1920

tgctattaat cgcaacatca aaccaaaata aaagccccct tcgactttcg tcaggggggc 1980

ttttatttat tcaataatcc ctcctctcaa taaatctatt gttgtactta attcaacttc 2040

catttctctg tatctttcaa tacgctcttt taagtcctta atttcttttt ttaattcctc 2100

attttcagca aataactctt tttctttgtt tgtcatttta tttcccccgt ttcagcatca 2160

agaacctttg cataacttgc tctatatcca cactgataat tgccctcaaa ccataatcta 2220

aaggcgctag agtttgttga aacaatatct tttacatcat tcgtatttaa aattccaaac 2280

tccgctcccc taaggcgaat aaaagccatt aaatcttttg tatttaccaa attatagtca 2340

tccactatat ctaaaagtaa attcttcaat tctctttttt ggctttcatc aagtgttata 2400

tagcggtcaa tatcaaaatc attaatgttc aaaatatctt ttttgtcgta tatatgttta 2460

ttcttagcaa tagcgtcctt tgattcatga gtcaaatatt catatgaacc tttgatataa 2520

tcaagtatct caacatgagc aactgaacta ttccccaatt ttcgcttaat cttgttccta 2580

acgctttcta ttgttacagg atttcgtgca atatatataa cgtgatagtg tggtttttta 2640

tagtgctttc catttcgtat aacatcacta ctattccatg tatctttatc ttttttttcg 2700

tccatatcgt gtaaaggact gacagccata gatacgccca aactctctaa tttttctttc 2760

caatcattag gaattgagtc aggatataat aaaaatccaa aatttctagc tttagtattt 2820

ttaatagcca tgatataatt accttgtcaa aaacaagtag cgaaaactcg tatccttcta 2880

aaaacgcgag ctttcgctta ttttttttgt tctgattcct ttcttgcata ttcttctata 2940

gctaacgccg caaccgcaga ttttgaaaaa cctttttgtt tcgccatatc tgttaatttt 3000

ttatcttgct cttttgtcag agaaatcata actctttttt tcgattctga aatcaccatt 3060

taaaaaactc caatcaaata attttataaa attagtgtat cactttgtaa tcataaaaac 3120

aacaataaag ctacttaaat atagatttat aaaaaacgtt ggcgaaaacg ttggcgattc 3180

gttggcgatt gaaaaacccc tcaaaccctt gagccagttg ggatagagcg tttttggcac 3240

aaaaattggc actcggcact taatgggggg tcgtagtacg gaagcaaaat tcgcttcctt 3300

tcccccccat ttttttccaa attccaaatt tttttcaaaa attttccagc gctaccgctc 3360

ggcaaaattg caagcaattt ttaaaatcaa acccatgagg gaatttcatt ccctcaaact 3420

cccttgagcc tcctccaacc gaaatagaag gacgctgcgc ttattatttc attcagtcat 3480

cggctttcat aatctaacag acaacatctt cgctgcaaag ccacgctacg ctcaagggct 3540

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gaccaaaact ataaaacctt taagaacttt ctttttttac aagaaaaaag aaattagata 3840

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tcatcatgtt catatttatc agagctcgtg ctataattat actaatttta taaggaggaa 3960

aaaatatggg catttttagt atttttgtaa tcagcacagt tcattatcaa ccaaacaaaa 4020

aataagtggt tataatgaat cgttaataag caaaattcat ataaccaaat taaagagggt 4080

tataatgaac gagaaaaata taaaacacag tcaaaacttt attacttcaa aacataatat 4140

agataaaata atgacaaata taagattaaa tgaacatgat aatatctttg aaatcggctc 4200

aggaaaaggc cattttaccc ttgaattagt aaagaggtgt aatttcgtaa ctgccattga 4260

aatagaccat aaattatgca aaactacaga aaataaactt gttgatcacg ataatttcca 4320

agttttaaac aaggatatat tgcagtttaa atttcctaaa aaccaatcct ataaaatata 4380

tggtaatata ccttataaca taagtacgga tataatacgc aaaattgttt ttgatagtat 4440

agctaatgag atttatttaa tcgtggaata cgggtttgct aaaagattat taaatacaaa 4500

acgctcattg gcattacttt taatggcaga agttgatatt tctatattaa gtatggttcc 4560

aagagaatat tttcatccta aacctaaagt gaatagctca cttatcagat taagtagaaa 4620

aaaatcaaga atatcacaca aagataaaca aaagtataat tatttcgtta tgaaatgggt 4680

taacaaagaa tacaaga 4697

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cgcggatcct cctccccttt catatttaga a 31

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cgacctgagg taattataac cc 22