本發(fā)明涉及一種氮雜環(huán)噻吩[2,3-d]嘧啶酮苯磺酰胺類衍生物在小鼠B16細(xì)胞中黑素合成、乙酰膽堿酯酶和丁酰膽堿酯酶抑制劑藥物中的用途，該類化合物經(jīng)細(xì)胞活性篩選，其中23個化合物可用于臨床上治療白癜風(fēng)的藥物；有3個化合物具備在臨床上抑制乙酰膽堿酯酶的藥物用途；有2個化合物具備在臨床上抑制丁酰膽堿酯酶的藥物用途。

背景技術(shù)：

白癜風(fēng)是一種常見的自發(fā)或特發(fā)性的色素脫失性皮膚病，被稱為世界皮膚病三大頑癥之一，困擾全世界5000萬以上的患者。在世界不同地域、不同種族間發(fā)病率從0.1％—8％不等，我國一般人群患病率為0.56％左右，大約一半患者于20周歲以前發(fā)病，男性和女性的患病率相等。白癜風(fēng)主要表現(xiàn)為皮膚、粘膜的白斑及灰/白色毛發(fā)等。西醫(yī)認(rèn)為白癜風(fēng)是由于皮膚和毛囊的黑素細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶系統(tǒng)的功能減退、喪失而引起的。

補(bǔ)骨脂素類化合物(Psoralen)是目前臨床上治療白癜風(fēng)最常用的光敏性藥物，但是必須配合日光或長波紫外線(UVA)照射治療。常用的有8-甲氧基補(bǔ)骨脂素(8-MOP)、5-甲氧補(bǔ)骨脂素(5-MOP)和三甲基補(bǔ)骨脂素(TMP)的結(jié)構(gòu)為：

三種常用補(bǔ)骨脂素類化合物的結(jié)構(gòu)

在白癜風(fēng)的治療中，補(bǔ)骨脂素類化合物長波紫外線照射治療能夠激活酪氨酸酶活性，催化黑素合成，促進(jìn)黑素細(xì)胞的分裂及移動，最終使黑色素合成增加，白斑顏色逐漸恢復(fù)。雜環(huán)化合物由于其廣譜高效低毒的生物活性而引起各國化學(xué)家的重視，如殺蟲、殺菌、除草、抗病毒、消炎、抗腫瘤和殺微生物等活性。含氮雜環(huán)化合物因其具有良好生物活性而在醫(yī)藥領(lǐng)域以及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮著重要的作用，已有許多含氮雜環(huán)化合物被開發(fā)成醫(yī)藥和農(nóng)藥新品種。國內(nèi)外關(guān)于含氮新型雜環(huán)化合物的合成及生物活性的研究十分活躍,

具有噻吩并嘧啶酮環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物是一類具有良好的生物活性和藥理活性的雜環(huán)化合物，早在二十世紀(jì)七十年代就備受人們的關(guān)注。有大量的文獻(xiàn)報道噻吩并嘧啶酮類衍生物具有抗過敏，抗菌，抗癌及抗腫瘤，抗炎，抗驚厥以及用于治療帕金森氏綜合癥，抑制人體血小板聚集，除草，殺蟲等活性。

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本發(fā)明在國內(nèi)外有關(guān)專利、文獻(xiàn)的綜合分析的基礎(chǔ)上，對氮雜環(huán)噻吩[2,3-d]嘧啶酮-3-胺進(jìn)行全合成，并進(jìn)行簡單的改造和修飾，將含不同取代基的苯磺酰氯引入到氮雜環(huán)噻吩[2,3-d]嘧啶酮-3-胺分子中，以期提高其成藥性，并研究了這些化合物對小鼠B16細(xì)胞中黑素生成、乙酰膽堿酯酶和丁酰膽堿酯酶抑制活性的影響，以期發(fā)現(xiàn)療效顯著、靶點(diǎn)明確、作用機(jī)理清晰的抗白癜風(fēng)新藥和新型的乙酰膽堿酯酶和丁酰膽堿酯酶抑制劑的候選藥物。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于，提供一種氮雜環(huán)噻吩[2,3-d]嘧啶酮苯磺酰胺類衍生物及用途。該類化合物以草酸二乙酯為起始原料，在乙基溴化鎂的作用下反應(yīng)，接著在三乙胺的作用下與氰基乙酸乙酯和硫粉反應(yīng)得到2-氨基-5-甲基-3,4-噻吩二甲酸乙酯(2)，然后在三氯氧磷的作用下，與不同的內(nèi)酰胺反應(yīng)得到氮雜環(huán)噻吩嘧啶酮-3-甲酸乙酯類化合物(3-5)，接著氫氧化鋰作用下水解、庫爾提斯重排反應(yīng)生成氮雜環(huán)噻吩[2,3-d]嘧啶酮-3-胺化合物(9-11)，再以氮雜環(huán)噻吩[2,3-d]嘧啶酮-3-胺化合物為母核，分別和不同取代的苯磺酰氯反應(yīng)得到23種氮雜環(huán)噻吩[2,3-d]嘧啶酮苯磺酰胺類化合物(9a-9h,10a-10j,11a-11e)，并考察了這23種化合物在小鼠B16細(xì)胞中對黑素生成量的影響，對乙酰膽堿酯酶、丁酰膽堿酯酶抑制活性，小鼠B16細(xì)胞中對黑素生成量的影響結(jié)果顯示：與陽性對照(不給藥組)相比，所有化合物對黑素生成的促進(jìn)作用均優(yōu)于陽性對照，其中化合物10f和10j對黑素生成的促進(jìn)作用接近陽性對照的5倍；大部分化合物對乙酰膽堿酯酶有較好的抑制活性，且抑制率從0％到41.7％不等，其中化合物10f、11a、11e對乙酰膽堿酯酶抑制率達(dá)30％以上；一部分化合物對丁酰膽堿酯酶有較好的抑制活性，且抑制率從0％到34.27％不等，其中化合物9e、11e對丁酰膽堿酯酶抑制率達(dá)30％以上。

本發(fā)明所述的一種氮雜環(huán)噻吩[2,3-d]嘧啶酮苯磺酰胺類衍生物，該類化合物的結(jié)構(gòu)式為：

其中：

化合物9a為4-溴-N-(2-甲基-4-羰基-4,6,7,8-四氫吡咯[1,2-a]噻吩[2,3-d]嘧啶-3-氨基)苯磺酰胺；

化合物9b為4-硝基-N-(2-甲基-4-羰基-4,6,7,8-四氫吡咯[1,2-a]噻吩[2,3-d]嘧啶-3-氨基)苯磺酰胺；

化合物9c為4-甲氧基-N-(2-甲基-4-羰基-4,6,7,8-四氫吡咯[1,2-a]噻吩[2,3-d]嘧啶-3-氨基)苯磺酰胺；

化合物9d為2-三氟甲基-N-(2-甲基-4-羰基-4,6,7,8-四氫吡咯[1,2-a]噻吩[2,3-d]嘧啶-3-氨基)苯磺酰胺；

化合物9e為3-三氟甲基-N-(2-甲基-4-羰基-4,6,7,8-四氫吡咯[1,2-a]噻吩[2,3-d]嘧啶-3-氨基)苯磺酰胺；

化合物9f為4-三氟甲基-N-(2-甲基-4-羰基-4,6,7,8-四氫吡咯[1,2-a]噻吩[2,3-d]嘧啶-3-氨基)苯磺酰胺；

化合物9g為4-三氟甲氧基-N-(2-甲基-4-羰基-4,6,7,8-四氫吡咯[1,2-a]噻吩[2,3-d]嘧啶-3-氨基)苯磺酰胺；

化合物9h為3,5-二氯-N-(2-甲基-4-羰基-4,6,7,8-四氫吡咯[1,2-a]噻吩[2,3-d]嘧啶-3-氨基)苯磺酰胺；

化合物10a為3-氟-N-(2-甲基-4-羰基-6,7,8,9-四氫吡啶[1,2-a]噻吩[2,3-d]嘧啶-3-氨基)苯磺酰胺；

化合物10b為4-硝基-N-(2-甲基-4-羰基-6,7,8,9-四氫吡啶[1,2-a]噻吩[2,3-d]嘧啶-3-氨基)苯磺酰胺；

化合物10c為3-三氟甲基-N-(2-甲基-6,7,8,9-四氫吡啶[1,2-a]噻吩[2,3-d]嘧啶-3-氨基)苯磺酰胺；

化合物10d為4-三氟甲基-N-(2-甲基-4-羰基-6,7,8,9-四氫吡啶[1,2-a]噻吩[2,3-d]嘧啶-3-氨基)苯磺酰胺；

化合物10e為4-三氟甲氧基-N-(2-甲基-4-羰基-6,7,8,9-四氫吡啶[1,2-a]噻吩[2,3-d]嘧啶-3-氨基)苯磺酰胺；

化合物10f為3,5-二氟-N-(2-甲基-4-羰基-6,7,8,9-四氫吡啶[1,2-a]噻吩[2,3-d]嘧啶-3-氨基)苯磺酰胺；

化合物10g為3,4-二氟-N-(2-甲基-4-羰基-6,7,8,9-四氫吡啶[1,2-a]噻吩[2,3-d]嘧啶-3-氨基)苯磺酰胺；

化合物10h為2,5-二氟-N-(2-甲基-4-羰基-6,7,8,9-四氫吡啶[1,2-a]噻吩[2,3-d]嘧啶-3-氨基)苯磺酰胺；

化合物10i為3-硝基-4-氯-N-(2-甲基-4-羰基-6,7,8,9-四氫吡啶[1,2-a]噻吩[2,3-d]嘧啶-3-氨基)苯磺酰胺；

化合物10j為3,5-二氯-N-(2-甲基-4-羰基-6,7,8,9-四氫吡啶[1,2-a]噻吩[2,3-d]嘧啶-3-氨基)苯磺酰胺；

化合物11a為4-硝基-N-(2-甲基-4-羰基-4,6,7,8,9,10-六氫噻吩[2',3':4,5]嘧啶[1,2-a]氮雜卓-3-氨基)苯磺酰胺；

化合物11b為3,5-二氟-N-(2-甲基-4-羰基-4,6,7,8,9,10-六氫噻吩[2',3':4,5]嘧啶[1,2-a]氮雜卓-3-氨基)苯磺酰胺；

化合物11c為3-氟-4-甲基-N-(2-甲基-4-羰基-4,6,7,8,9,10-六氫噻吩[2',3':4,5]嘧啶[1,2-a]氮雜卓-3-氨基)苯磺酰胺；

化合物11d為4-氯-3-硝基-N-(2-甲基-4-羰基-4,6,7,8,9,10-六氫噻吩[2',3':4,5]嘧啶[1,2-a]氮雜卓-3-氨基)苯磺酰胺；

化合物11e為3,5-二氯-N-(2-甲基-4-羰基-4,6,7,8,9,10-六氫噻吩[2',3':4,5]嘧啶[1,2-a]氮雜卓-3-氨基)苯磺酰胺。

所述氮雜環(huán)噻吩嘧啶酮苯磺酰胺類衍生物中的化合物9a-9h、10a-10j和11a-11e在制備治療白癜風(fēng)藥物中的用途

所述氮雜環(huán)噻吩嘧啶酮苯磺酰胺類衍生物中化合物10f、11a和11e在制備乙酰膽堿酯酶的藥物中的用途。

所述氮雜環(huán)噻吩嘧啶酮苯磺酰胺類衍生物中化合物9e和11e在制備對丁酰膽堿酯酶的藥物中的用途。

本發(fā)明所述的氮雜環(huán)噻吩[2,3-d]嘧啶酮苯磺酰胺類衍生物，其結(jié)構(gòu)如通式(I)所示：

本發(fā)明以常見的試劑為起始原料，經(jīng)六步反應(yīng)合成氮雜環(huán)噻吩[2,3-d]嘧啶酮苯磺酰胺類類化合物，并研究了這些化合物在細(xì)胞中黑素合成、乙酰膽堿酯酶和丁酰膽堿酯酶抑制劑藥物中的用途，所得的化合物對黑素生成的促進(jìn)作用均優(yōu)于陽性對照，其中化合物10f和10j對黑素生成的促進(jìn)作用接近陽性對照的5倍；大部分化合物對乙酰膽堿酯酶有較好的抑制活性，且抑制率從0％到42.41％不等，其中化合物10f、11a和11e對乙酰膽堿酯酶抑制率達(dá)30％以上；一部分化合物對丁酰膽堿酯酶有較好的抑制活性，且抑制率從0％到34.27％不等，其中化合物9e和11e對丁酰膽堿酯酶抑制率達(dá)30％以上。

本發(fā)明所述的氮雜環(huán)噻吩[2,3-d]嘧啶酮苯磺酰胺類衍生物在細(xì)胞中黑素合成、乙酰膽堿酯酶和丁酰膽堿酯酶抑制劑藥物中的用途，其中氮雜環(huán)噻吩[2,3-d]嘧啶酮苯磺酰胺類衍生物的制備方法，按下列步驟進(jìn)行：

化合物1的制備

在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將草酸二乙酯(1.46g,10m mol)溶于無水四氫呋喃(10ml)中，在-20度攪拌10分鐘，然后滴加溶于四氫呋喃的乙基溴化鎂溶液(1.56g，1.2m mol)，滴加時間持續(xù)半小時，接著，常溫攪拌5小時，蒸去溶劑得淡黃色化合物1，不需要純化用于下步反應(yīng)。

化合物2的制備

在冰浴條件下，將上步得到的淡黃色化合物1(1.3g，10mmol)、氰基乙酸乙酯(1.35g，12mmol)和硫粉(0.32g，10mmol)加入到25ml乙醇中，在攪拌下緩慢滴加三乙胺(1.2ml，12mmol)至全部溶解，升溫至45℃，充分?jǐn)嚢枋蛊浞磻?yīng)完全，反應(yīng)液傾倒入冰水中，靜置后采用二氯甲烷萃取，合并有機(jī)相，干燥、濃縮，柱層析純化，即得化合物2。

化合物3的制備

將化合物2(2.57g，10mmol)溶解在50mL的無水二氯甲烷中，并加入吡咯烷酮(1.02g，12mmol)，然后緩慢滴加三氯氧磷(3.77g，2.5mmol)，回流反應(yīng)至原料全部消失，反應(yīng)液過濾，濃縮，柱層析純化，得到氮雜環(huán)噻吩嘧啶酮化合物3。

化合物4的制備

將化合物2(2.57g，10mmol)溶解在50mL的無水二氯甲烷中，并加入哌啶酮(1.2g，12mmol)，然后緩慢滴加三氯氧磷(3.77g，2.5mmol)，回流反應(yīng)至原料全部消失，反應(yīng)液過濾，濃縮，柱層析純化，得到氮雜環(huán)噻吩嘧啶酮化合物4。

化合物5的制備

將化合物2(2.57g，10mmol)溶解在50mL的無水二氯甲烷中，并加入己內(nèi)酰胺(1.32g，12mmol)，然后緩慢滴加三氯氧磷(3.77g，2.5mmol)，回流反應(yīng)至原料全部消失，反應(yīng)液過濾，濃縮，柱層析純化，得到氮雜環(huán)噻吩嘧啶酮化合物5。

化合物6的制備

在常溫下，將2-甲基-4-羰基-4,6,7,8-四氫吡咯[1,2-a]噻吩[2,3-d]嘧啶-3-甲酸乙酯化合物3(2.78g，10m mol)溶解在無水甲醇(10ml)中，接著加入氫氧化鋰(0.36g，15m mol)，室溫攪拌過夜，反應(yīng)至原料完全消失，滴加3M鹽酸中和至pH＝5，有大量白色固體析出，抽濾并用大量水洗滌濾餅，真空干燥即得化合物6。

化合物7的制備

在常溫下，將2-甲基-4-羰基-6,7,8,9-四氫吡啶[1,2-a]噻吩[2,3-d]嘧啶-3-甲酸乙酯化合物4(2.9g，10m mol)溶解在無水甲醇(10ml)中，接著加入氫氧化鋰(0.36g，15mmol)，室溫攪拌過夜，反應(yīng)至原料完全消失，滴加3M鹽酸中和至pH＝5，有大量白色固體析出，抽濾并用大量水洗滌濾餅，真空干燥即得化合物7。

化合物8的制備

在常溫下，將2-甲基-4-羰基-4,6,7,8,9,10-六氫噻吩[2',3':4,5]嘧啶[1,2-a]氮雜卓-3-甲酸乙酯5(3.1g，10m mol)溶解在無水甲醇(10ml)中，接著加入氫氧化鋰(0.36g，15m mol)，室溫攪拌過夜，反應(yīng)至原料完全消失，滴加3M鹽酸中和至pH＝5，有大量白色固體析出，抽濾并用大量水洗滌濾餅，真空干燥即得化合物8。

化合物9的制備

在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將2-甲基-4-羰基-4,6,7,8-四氫吡咯[1,2-a]噻吩[2,3-d]嘧啶-3-甲酸化合物6(0.25g，1m mol)溶解在無水叔丁醇(10ml)溶液中，緩慢滴加疊氮磷酸二苯酯(0.33g，1.2m mol)，充分?jǐn)嚢杓訜峄亓靼胄r后，再滴加三乙胺(0.12ml，1.2m mol)，反應(yīng)繼續(xù)攪拌過夜，減壓蒸去溶劑，然后加入3M鹽酸乙醇溶液(8ml)溶解，繼續(xù)攪拌5小時，反應(yīng)至原料完全消失。加碳酸氫鈉溶液使溶液pH＝9，然后二氯甲烷萃取，濃縮，柱層析純化，即得化合物9。

化合物10的制備

在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將2-甲基-4-羰基-6,7,8,9-四氫吡啶[1,2-a]噻吩[2,3-d]嘧啶-3-甲酸化合物7(0.26g，1m mol)溶解在無水叔丁醇(10ml)溶液中，緩慢滴加疊氮磷酸二苯酯(0.33g，1.2m mol)，充分?jǐn)嚢杓訜峄亓靼胄r后，再滴加三乙胺(0.12ml，1.2m mol)，反應(yīng)繼續(xù)攪拌過夜，減壓蒸去溶劑，然后加入3M鹽酸乙醇溶液(8ml)溶解，繼續(xù)攪拌5小時，反應(yīng)至原料完全消失。加碳酸氫鈉溶液使溶液pH＝9，然后二氯甲烷萃取，濃縮，柱層析純化，即得化合物10。

2-甲基-4-羰基-6,7,8,9-四氫吡啶[1,2-a]噻吩[2,3-d]嘧啶-3-胺(化合物10)

化合物11的制備

在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將2-甲基-4-羰基-4,6,7,8,9,10-六氫噻吩[2',3':4,5]嘧啶[1,2-a]氮雜卓-3-甲酸化合物8(0.28g，1m mol)溶解在無水叔丁醇(10ml)溶液中，緩慢滴加疊氮磷酸二苯酯(0.33g，1.2m mol)，充分?jǐn)嚢杓訜峄亓靼胄r后，再滴加三乙胺(0.12ml，1.2m mol)，反應(yīng)繼續(xù)攪拌過夜，減壓蒸去溶劑，然后加入3M鹽酸乙醇溶液(8ml)溶解，繼續(xù)攪拌5小時，反應(yīng)至原料完全消失。加碳酸氫鈉溶液使溶液pH＝9，然后二氯甲烷萃取，濃縮，柱層析純化，即得化合物11。

化合物9a-9h的制備

在常溫下，將2-甲基-4-羰基-4,6,7,8-四氫吡咯[1,2-a]噻吩[2,3-d]嘧啶-3-胺鹽酸鹽化合物9(1m mol)溶解在無水二氯甲烷(10ml)中，接著加入不同取代基的苯磺酰氯(1.1mmol)，在攪拌下緩慢加入三乙胺(1.2m mol)，室溫攪拌過夜，反應(yīng)至原料完全消失，二氯甲烷萃取，濃縮，柱層析純化，即得化合物9a-9h。

化合物10a-10j的制備

在常溫下，將2-甲基-4-羰基-6,7,8,9-四氫吡啶[1,2-a]噻吩[2,3-d]嘧啶-3-胺鹽酸鹽化合物10(1m mol)溶解在無水二氯甲烷(10ml)中，接著加入不同取代基的苯磺酰氯(1.1m mol)，在攪拌下緩慢加入三乙胺(1.2m mol)，室溫攪拌過夜，反應(yīng)至原料完全消失，二氯甲烷萃取，濃縮，柱層析純化，即得化合物10a-10j。

化合物11a-11e的制備

在常溫下，將2-甲基-4-羰基-4,6,7,8,9,10-六氫噻吩[2',3':4,5]嘧啶[1,2-a]氮雜卓-3-胺鹽酸鹽化合物11(1m mol)溶解在無水二氯甲烷(10ml)中，接著加入苯磺酰氯(1.1m mol)，在攪拌下緩慢加入三乙胺(1.2m mol)，室溫攪拌過夜，反應(yīng)至原料完全消失，二氯甲烷萃取，濃縮，柱層析純化，即得化合物11a-11e。

本發(fā)明所述的氮雜環(huán)噻吩[2,3-d]嘧啶酮苯磺酰胺類化合物，是以草酸二乙酯為起始原料，先后經(jīng)五步合成氮雜環(huán)噻吩[2,3-d]嘧啶酮-3-胺類化合物，然后，分別與不同取代的苯磺酰氯反應(yīng)得到氮雜環(huán)噻吩[2,3-d]嘧啶酮苯磺酰胺類化合物，其合成路線如下：

具體實(shí)施方式

依據(jù)實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)一步說明，但本發(fā)明不僅限于這些實(shí)施例；

試劑：所有試劑均為市售的分析純；

實(shí)施例1

制備化合物1

在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將草酸二乙酯(1.46g,10m mol)溶于無水四氫呋喃(10ml)中，在-20度攪拌10分鐘，然后滴加溶于四氫呋喃的乙基溴化鎂溶液(1.56g，1.2m mol)，滴加時間持續(xù)半小時，接著，常溫攪拌5小時，蒸去溶劑得淡黃色化合物1，不需要純化用于下步反應(yīng)。

實(shí)施例2

制備化合物2

在冰浴條件下，將上步得到的淡黃色化合物1(1.3g，10mmol)、氰基乙酸乙酯(1.35g，12mmol)和硫粉(0.32g，10mmol)加入到25ml乙醇中，在攪拌下緩慢滴加三乙胺(1.2ml，12mmol)至全部溶解，升溫至45℃，充分?jǐn)嚢枋蛊浞磻?yīng)完全，反應(yīng)液傾倒入冰水中，靜置后采用二氯甲烷萃取，合并有機(jī)相，干燥、濃縮，采用體積比10:1的石油醚∶乙酸乙酯柱層析梯度洗脫，即得化合物2；產(chǎn)率：73％,淡黃色固體,mp 112-114℃；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ5.74(s,2H),4.29(q,J＝7.1Hz,2H),4.21(q,J＝7.1Hz,2H),2.25(s,3H),1.34(t,J＝7.2Hz,3H),1.27(t,J＝7.1Hz,3H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ165.90(s),164.34(s),160.54(s),128.60(s),122.41(s),104.86(s),61.08(s),59.95(s),14.22(s),14.19(s),13.03(s)。

實(shí)施例3

制備化合物3

將化合物2(2.57g，10mmol)溶解在50mL的無水二氯甲烷中，并加入吡咯烷酮(1.02g，12mmol)，然后緩慢滴加三氯氧磷(3.77g，2.5mmol)，回流反應(yīng)至原料全部消失，反應(yīng)液過濾，濃縮，采用體積比1:1的石油醚∶乙酸乙酯柱層析梯度洗脫，得到氮雜環(huán)噻吩嘧啶酮化合物3；產(chǎn)率：87％,淡黃色固體,mp 172-173℃；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ4.43(q,J＝7.1Hz,2H),4.17(t,J＝7.2Hz,,2H),3.14(t,J＝8.0Hz,2H),2.54(s,3H),2.34–2.22(m,2H),1.40(t,J＝7.1Hz,3H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ164.43(s),163.21(s),160.22(s),155.84(m),138.43(m),125.77(m),120.09(s),61.61(s),46.60(s),32.22(s),19.66(s),14.32(s),14.22(s)。

實(shí)施例4

制備化合物4

將化合物2(2.57g，10mmol)溶解在50mL的無水二氯甲烷中，并加入哌啶酮(1.2g，12mmol)，然后緩慢滴加三氯氧磷(3.77g，2.5mmol)，回流反應(yīng)至原料全部消失，反應(yīng)液過濾，濃縮，采用體積比3:1的石油醚∶乙酸乙酯柱層析梯度洗脫，得到氮雜環(huán)噻吩嘧啶酮化合物4；產(chǎn)率：78％,淡黃色固體,mp 162-164℃；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ4.43(q,J＝7.1Hz,2H),4.02(t,J＝6.1Hz,2H),2.95(t,J＝6.6Hz,2H),2.53(s,3H),2.07–1.79(m,4H),1.40(t,J＝7.1Hz,3H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ164.48(s),161.37(s),156.96(s),155.90(s),138.20(s),131.59(s),126.00(s),61.57(s),42.21(s),31.58(s),22.04(s),19.13(s),14.24(s)。

實(shí)施例5

制備化合物5

將化合物2(2.57g，10mmol)溶解在50mL的無水二氯甲烷中，并加入己內(nèi)酰胺(1.32g，12mmol)，然后緩慢滴加三氯氧磷(3.77g，2.5mmol)，回流反應(yīng)至原料全部消失，反應(yīng)液過濾，濃縮，采用體積比5:1的石油醚∶乙酸乙酯柱層析梯度洗脫，得到氮雜環(huán)噻吩嘧啶酮化合物5；產(chǎn)率：90％,淡黃色固體,mp 157-159℃；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ4.43(q,J＝7.1Hz,2H),4.34(t,J＝7.2Hz,,2H),3.02(t,J＝7.3Hz,2H),2.51(s,3H),1.78-1.84(m,4H),1.71-1.75(m,2H),1.39(t,J＝7.1Hz,3H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ164.60(s),161.26(s),160.56(s),156.72(s),138.19(s),126.32(s),119.81(s),61.62(s),42.62(s),37.38(s),29.54(s),27.52(s),25.06(s),14.23(s)。

實(shí)施例6

制備化合物6

在常溫下，將2-甲基-4-羰基-4,6,7,8-四氫吡咯[1,2-a]噻吩[2,3-d]嘧啶-3-甲酸乙酯化合物3(2.78g，10m mol)溶解在無水甲醇(10ml)中，接著加入氫氧化鋰(0.36g，15m mol)，室溫攪拌過夜，反應(yīng)至原料完全消失，滴加3M鹽酸中和至pH＝5，有大量白色固體析出，抽濾并用大量水洗滌濾餅，真空干燥即得化合物6；產(chǎn)率：92％,白色固體,mp272-273℃；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ4.29(t,J＝7.6Hz,2H),3.25(t,J＝8.0Hz,2H),2.90(s,3H),2.46–2.35(m,2H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ163.38(s),162.31(s),159.68(s),159.58(s),151.91(s),122.53(s),118.27(s),47.45(s),31.84(s),19.66(s),17.34(s)。

實(shí)施例7

制備化合物7

在常溫下，將2-甲基-4-羰基-6,7,8,9-四氫吡啶[1,2-a]噻吩[2,3-d]嘧啶-3-甲酸乙酯化合物4(2.9g，10m mol)溶解在無水甲醇(10ml)中，加入氫氧化鋰(0.36g，15m mol)，室溫攪拌過夜，反應(yīng)至原料完全消失，滴加3M鹽酸中和至pH＝5，有大量白色固體析出，抽濾并用大量水洗滌濾餅，真空干燥即得化合物7；產(chǎn)率：87％,白色固體,mp 256-258℃；¹HNMR(400MHz,CDCl₃)δ4.13(t,J＝6.2Hz,2H),3.05(t,J＝6.7Hz,2H),2.88(s,3H),2.13–1.92(m,4H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ162.40(s),161.68(s),160.90(s),155.05(s),151.74(s),122.51(s),118.03(s),43.65(s),31.49(s),21.83(s),18.87(s),17.29(s)。

實(shí)施例8

制備化合物8

在常溫下，將2-甲基-4-羰基-4,6,7,8,9,10-六氫噻吩[2',3':4,5]嘧啶[1,2-a]氮雜卓-3-甲酸乙酯5(3.1g，10m mol)溶解在無水甲醇(10ml)中，加入氫氧化鋰(0.36g，15m mol)，室溫攪拌過夜，反應(yīng)至原料完全消失，滴加3M鹽酸中和至pH＝5，有大量白色固體析出，抽濾并用大量水洗滌濾餅，真空干燥即得化合物8；產(chǎn)率：91％,白色固體,mp290-292℃；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ4.46(t,J＝6.8Hz,2H),3.11(t,J＝7.1Hz,2H),2.90(s,3H),1.98–1.74(m,6H).¹³C NMR(101MHz,CDCl₃)δ162.45(s),161.50(s),160.73(s),159.72(s),152.12(s),122.81(s),118.18(s),43.92(s),37.06(s),29.30(s),27.23(s),24.86(s),17.41(s)。

實(shí)施例9

制備化合物9

在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將2-甲基-4-羰基-4,6,7,8-四氫吡咯[1,2-a]噻吩[2,3-d]嘧啶-3-甲酸化合物6(0.25g，1m mol)溶解在無水叔丁醇(10ml)溶液中，緩慢滴加疊氮磷酸二苯酯(0.33g，1.2m mol)，充分?jǐn)嚢杓訜峄亓靼胄r后，再滴加三乙胺(0.12ml，1.2m mol)，反應(yīng)繼續(xù)攪拌過夜，減壓蒸去溶劑，然后加入3M鹽酸乙醇溶液(8ml)溶解，繼續(xù)攪拌5小時，反應(yīng)至原料完全消失，加碳酸氫鈉溶液使溶液pH＝9，然后二氯甲烷萃取，濃縮，采用體積比1:1的石油醚∶乙酸乙酯柱層析梯度洗脫，即得化合物9；產(chǎn)率：73％,白色固體,mp210-212℃；¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ4.18(t,J＝7.8Hz,2H),3.19(t,J＝8.0Hz,2H),2.55(s,3H),2.37–2.27(m,2H).¹³C NMR(101MHz,CD₃OD)δ162.78(s),161.40(s),156.97(s),129.52(s),117.98(s),115.09(s),46.51(s),31.65(s),19.07(s),10.37(s)。

實(shí)施例10

制備化合物10

在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將2-甲基-4-羰基-6,7,8,9-四氫吡啶[1,2-a]噻吩[2,3-d]嘧啶-3-甲酸化合物7(0.26g，1m mol)溶解在無水叔丁醇(10ml)溶液中，緩慢滴加疊氮磷酸二苯酯(0.33g，1.2m mol)，充分?jǐn)嚢杓訜峄亓靼胄r后，再滴加三乙胺(0.12ml，1.2m mol)，反應(yīng)繼續(xù)攪拌過夜，減壓蒸去溶劑，然后加入3M鹽酸乙醇溶液(8ml)溶解，繼續(xù)攪拌5小時，反應(yīng)至原料完全消失。加碳酸氫鈉溶液使溶液pH＝9，然后二氯甲烷萃取，濃縮，采用體積比3:1的石油醚∶乙酸乙酯柱層析梯度洗脫，即得化合物10；產(chǎn)率：75％,淡黃色固體,mp 224-226℃；¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ4.21(t,J＝7.7Hz,2H),3.14(t,J＝8.0Hz,2H),2.53(s,3H),2.10–1.94(m,4H).¹³C NMR(101MHz,CD₃OD)δ158.89(s),157.07(s),155.75(s),129.91(s),118.53(s),115.20(s),42.47(s),20.90(s),17.80(s),17.69(s),10.42(s)。

實(shí)施例11

制備化合物11

在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將2-甲基-4-羰基-4,6,7,8,9,10-六氫噻吩[2',3':4,5]嘧啶[1,2-a]氮雜卓-3-甲酸化合物8(0.28g，1m mol)溶解在無水叔丁醇(10ml)溶液中，緩慢滴加疊氮磷酸二苯酯(0.33g，1.2m mol)，充分?jǐn)嚢杓訜峄亓靼胄r后，再滴加三乙胺(0.12ml，1.2m mol)，反應(yīng)繼續(xù)攪拌過夜，減壓蒸去溶劑，然后加入3M鹽酸乙醇溶液(8ml)溶解，繼續(xù)攪拌5小時，反應(yīng)至原料完全消失。加碳酸氫鈉溶液使溶液pH＝9，然后二氯甲烷萃取，濃縮，采用體積比5:1的石油醚∶乙酸乙酯柱層析梯度洗脫，即得化合物11；產(chǎn)率：71％,白色固體,mp 236-238℃；¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ4.43(t,J＝7.8Hz,2H),3.10(t,J＝8.0Hz,2H),2.56(s,3H),1.93–1.71(m,6H).¹³C NMR(101MHz,CD₃OD)δ162.64(s),158.27(s),157.51(s),130.09(s),118.47(s),115.09(s),42.24(s),36.19(s),28.84(s),26.75(s),24.32(s),10.45(s)。

實(shí)施例12

制備化合物9a

在常溫下，將2-甲基-4-羰基-4,6,7,8-四氫吡咯[1,2-a]噻吩[2,3-d]嘧啶-3-胺鹽酸鹽化合物9(0.29g，1m mol)溶解在無水二氯甲烷(10ml)中，接著加入4-溴苯磺酰氯(0.28g，1.1m mol)，在攪拌下緩慢加入三乙胺(0.12g，1.2m mol)，室溫攪拌過夜，反應(yīng)至原料完全消失，二氯甲烷萃取，濃縮，采用體積比2:1的石油醚∶乙酸乙酯柱層析梯度洗脫，即得化合物9a；產(chǎn)率：89％,白色固體,mp 174-175℃；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.58(s,1H),7.49(d,J＝8.6Hz,2H),7.44(d,J＝8.6Hz,2H),3.92(t,J＝7.2Hz,2H),3.10(t,J＝7.9Hz,2H),2.62(s,3H),2.31–2.19(m,2H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ161.07(s),159.94(s),156.70(s),137.29(s),132.26(s),131.49(s),129.55(s),127.69(s),124.28(s),115.75(s),46.08(s),32.06(s),19.63(s),13.82(s)。

實(shí)施例13

制備化合物9b

在常溫下，將2-甲基-4-羰基-4,6,7,8-四氫吡咯[1,2-a]噻吩[2,3-d]嘧啶-3-胺鹽酸鹽化合物9(0.29g，1m mol)溶解在無水二氯甲烷(10ml)中，接著加入4-硝基苯磺酰氯(0.24g，1.1m mol)，在攪拌下緩慢加入三乙胺(0.12g，1.2m mol)，室溫攪拌過夜，反應(yīng)至原料完全消失，二氯甲烷萃取，濃縮，采用體積比2:1的石油醚∶乙酸乙酯柱層析梯度洗脫，即得化合物9b；產(chǎn)率：71％,淡黃色固體,mp 225-226℃；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.18–8.10(m,2H),7.89–7.81(m,2H),7.70(s,1H),3.87(t,J＝7.4Hz,2H),3.08(t,J＝8.0Hz,2H),2.64(s,3H),2.28-2.19(m,2H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ161.37(s),160.11(s),156.73(s),150.11(s),144.12(s),132.76(s),129.23(s),123.53(s),123.45(s),115.33(s),46.06(s),32.03(s),19.42(s),13.89(s)。

實(shí)施例14

制備化合物9c

在常溫下，將2-甲基-4-羰基-4,6,7,8-四氫吡咯[1,2-a]噻吩[2,3-d]嘧啶-3-胺鹽酸鹽化合物9(0.29g，1m mol)溶解在無水二氯甲烷(10ml)中，接著加入4-甲氧基苯磺酰氯(0.23g，1.1m mol)，在攪拌下緩慢加入三乙胺(0.12g，1.2m mol)，室溫攪拌過夜，反應(yīng)至原料完全消失，二氯甲烷萃取，濃縮，采用體積比2:1的石油醚∶乙酸乙酯柱層析梯度洗脫，即得化合物9c；產(chǎn)率：82％,淡黃色固體,mp 248-249℃；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.65(s,1H),7.63–7.56(m,2H),6.81–6.72(m,2H),3.93(t,J＝7.4Hz,2H),3.79(s,3H),3.06(d,J＝8.0Hz,2H),2.60(s,3H),2.27–2.15(m,2H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ162.70(s),159.12(s),157.12(s),154.34(s),131.17(s),130.36(s),124.73(s),116.11(s),114.89(s),55.71(s,41.43(s),32.45(s),18.74(s),13.71(s)。

實(shí)施例15

制備化合物9d

在常溫下，將2-甲基-4-羰基-4,6,7,8-四氫吡咯[1,2-a]噻吩[2,3-d]嘧啶-3-胺鹽酸鹽化合物9(0.29g，1m mol)溶解在無水二氯甲烷(10ml)中，接著加入2-三氟甲基苯磺酰氯(0.27g，1.1m mol)，在攪拌下緩慢加入三乙胺(0.12g，1.2m mol)，室溫攪拌過夜，反應(yīng)至原料完全消失，二氯甲烷萃取，濃縮，采用體積比2:1的石油醚∶乙酸乙酯柱層析梯度洗脫，即得化合物9d；產(chǎn)率：83％,淡黃色固體,mp 203-204℃；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.86(d,J＝7.8Hz,1H),7.80(d,J＝7.9Hz,1H),7.65–7.54(m,2H),7.47(t,J＝7.4Hz,1H),3.86(t,J＝7.4Hz,2H),3.07(t,J＝8.0Hz,2H),2.53(s,3H),2.23–2.14(m,2H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ160.47(s),158.78(s),156.79(s),139.37(s),134.08(s),133.46(s),132.85(s),131.88(s),128.97(d,J＝33.5Hz),127.87(q,J＝6.3Hz),125.73((q,J＝3.8Hz)),123.54(s),116.12(s),41.52(s),32.04(s),18.96(s),13.80(s)。

實(shí)施例16

制備化合物9e

在常溫下，將2-甲基-4-羰基-4,6,7,8-四氫吡咯[1,2-a]噻吩[2,3-d]嘧啶-3-胺鹽酸鹽化合物9(0.29g，1m mol)溶解在無水二氯甲烷(10ml)中，接著加入3-三氟甲基苯磺酰氯(0.27g，1.1m mol)，在攪拌下緩慢加入三乙胺(0.12g，1.2m mol)，室溫攪拌過夜，反應(yīng)至原料完全消失，二氯甲烷萃取，濃縮，采用體積比2:1的石油醚∶乙酸乙酯柱層析梯度洗脫，即得化合物9e；產(chǎn)率：79％,淡黃色固體,mp 191-192℃；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.91(d,J＝7.8Hz,1H),7.82(s,1H),7.69(d,J＝7.8Hz,1H),7.61(s,1H),7.49(t,J＝7.9Hz,1H),3.85(t,J＝7.4Hz,2H),3.06(t,J＝8.0Hz,2H),2.64(s,3H),2.24–2.15(m,2H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ161.22(s),159.99(s),156.63(s),139.52(s),132.77(s),131.28(s),130.77(d,J＝33.5Hz),129.20(s),129.10(q,J＝3.7Hz),125.01(q,J＝4.0Hz),123.98(s),115.54(s),45.88(s),31.98(s),19.60(s),13.74(s)。

實(shí)施例17

制備化合物9f

在常溫下，將2-甲基-4-羰基-4,6,7,8-四氫吡咯[1,2-a]噻吩[2,3-d]嘧啶-3-胺鹽酸鹽化合物9(0.29g，1m mol)溶解在無水二氯甲烷(10ml)中，接著加入4-三氟甲基苯磺酰氯(0.27g，1.1m mol)，在攪拌下緩慢加入三乙胺(0.12g，1.2m mol)，室溫攪拌過夜，反應(yīng)至原料完全消失，二氯甲烷萃取，濃縮，采用體積比2:1的石油醚∶乙酸乙酯柱層析梯度洗脫，即得化合物9f；產(chǎn)率：80％,白色固體,mp 216-217℃；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.76(d,J＝8.3Hz,2H),7.57(d,J＝8.3Hz,2H),7.51(s,1H),3.82(t,J＝7.4Hz,2H),3.06(t,J＝8.0Hz,2H),2.64(s,3H),2.23–2.15(m,2H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ160.91(s),159.94(s),156.66(s),137.29(s),132.28(s),131.49(s),129.55(s),127.70(s),124.30(s),115.76(s),77.27(d,J＝11.5Hz),77.01(s),76.70(s),46.08(s),32.04(s),19.63(s),13.82(s)。

實(shí)施例18

制備化合物9g

在常溫下，將2-甲基-4-羰基-4,6,7,8-四氫吡咯[1,2-a]噻吩[2,3-d]嘧啶-3-胺鹽酸鹽化合物9(0.29g，1m mol)溶解在無水二氯甲烷(10ml)中，接著加入4-三氟甲氧基苯磺酰氯(0.29g，1.1m mol)，在攪拌下緩慢加入三乙胺(0.12g，1.2m mol)，室溫攪拌過夜，反應(yīng)至原料完全消失，二氯甲烷萃取，濃縮，采用體積比2:1的石油醚∶乙酸乙酯柱層析梯度洗脫，即得化合物9g；產(chǎn)率：88％,淡黃色固體,mp 181-182℃；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.72–7.65(m,2H),7.53(s,1H),7.13(d,J＝8.2Hz,2H),3.87(t,J＝7.4Hz,2H),3.07(t,J＝8.0Hz,2H),2.63(s,3H),2.25–2.15(m,2H).¹³CNMR(100MHz,CDCl₃)δ161.07(s),159.89(s),156.64(s),152.14(d,J＝1.4Hz),136.67(s),132.62(s),130.16(s),124.27(s),120.33(s),115.66(s),45.94(s),31.97(s),19.46(s),13.78(s)。

實(shí)施例19

制備化合物9h

在常溫下，將2-甲基-4-羰基-4,6,7,8-四氫吡咯[1,2-a]噻吩[2,3-d]嘧啶-3-胺鹽酸鹽化合物9(0.29g，1m mol)溶解在無水二氯甲烷(10ml)中，接著加入對聯(lián)苯磺酰氯(0.25g，1.1m mol)，在攪拌下緩慢加入三乙胺(0.12g，1.2m mol)，室溫攪拌過夜，反應(yīng)至原料完全消失，二氯甲烷萃取，濃縮，采用體積比2:1的石油醚∶乙酸乙酯柱層析梯度洗脫，即得化合物9h；產(chǎn)率：82％,淡黃色固體,mp 167-168℃；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.68(d,J＝8.3Hz,2H),7.65(s,1H),7.50(d,J＝7.5Hz,4H),7.44(t,J＝7.3Hz,2H),7.41–7.35(m,1H),3.82(t,J＝7.1Hz,2H),2.99(t,J＝7.7Hz,2H),2.62(s,3H),2.09-2.03(m,2H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ160.89(s),159.70(s),156.73(s),145.36(s),139.17(s),136.86(s),131.71(s),129.07(s),128.53(s),128.50(s),127.04(s),126.69(s),124.79(s),115.93(s),45.95(s),31.96(s),19.43(s),13.84(s)。

實(shí)施例20

制備化合物10a

在常溫下，將2-甲基-4-羰基-6,7,8,9-四氫吡啶[1,2-a]噻吩[2,3-d]嘧啶-3-胺鹽酸鹽化合物10(0.31g，1m mol)溶解在無水二氯甲烷(10ml)中，接著加入3-氟苯磺酰氯(0.21g，1.1m mol)，在攪拌下緩慢加入三乙胺(0.12g，1.2m mol)，室溫攪拌過夜，反應(yīng)至原料完全消失，二氯甲烷萃取，濃縮，采用體積比5:1的石油醚∶乙酸乙酯柱層析梯度洗脫，即得化合物10a；產(chǎn)率：84％,淡黃色固體,mp 159-160℃；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.73(s,1H),7.48–7.39(m,2H),7.33–7.26(m,1H),7.13(td,J＝8.3,1.8Hz,1H),3.76(t,J＝6.1Hz,2H),2.90(t,J＝6.5Hz,2H),2.61(s,3H),1.96–1.80(m,4H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ161.83(d,J＝251.3Hz),159.11(s),157.83(s),155.31(s),140.46(d,J＝6.8Hz),131.55(s),129.92(d,J＝7.5Hz),124.22(s),123.70(d,J＝3.6Hz),119.69(d,J＝21.1Hz),115.30(s),115.29(d,J＝24.7Hz).41.71(s),31.43(s),21.80(s),18.93(s),13.76(s)。

實(shí)施例21

制備化合物10b

在常溫下，將2-甲基-4-羰基-6,7,8,9-四氫吡啶[1,2-a]噻吩[2,3-d]嘧啶-3-胺鹽酸鹽化合物19(0.31g，1m mol)溶解在無水二氯甲烷(10ml)中，接著加入4-硝基苯磺酰氯(0.24g，1.1m mol)，在攪拌下緩慢加入三乙胺(0.12g，1.2m mol)，室溫攪拌過夜，反應(yīng)至原料完全消失，二氯甲烷萃取，濃縮，采用體積比5:1的石油醚∶乙酸乙酯柱層析梯度洗脫，即得化合物10b；產(chǎn)率：70％,淡黃色固體,mp 250-251℃；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.14(d,J＝8.9Hz,2H),7.85(d,J＝8.9Hz,2H),7.72(s,1H),3.67(t,J＝6.1Hz,2H),2.90(t,J＝6.5Hz,2H),2.64(s,3H),1.94–1.78(m,4H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ159.44(s),157.78(s),155.63(s),150.13(s),144.18(s),132.55(s),129.29(s),123.51(s),123.40(s),115.04(s),41.85(s),31.48(s),21.71(s),18.88(s),13.85(s)。

實(shí)施例22

制備化合物10c

在常溫下，將2-甲基-4-羰基-6,7,8,9-四氫吡啶[1,2-a]噻吩[2,3-d]嘧啶-3-胺鹽酸鹽化合物10(0.31g，1m mol)溶解在無水二氯甲烷(10ml)中，接著加入3-三氟甲基苯磺酰氯(0.27g，1.1m mol)，在攪拌下緩慢加入三乙胺(0.12g，1.2m mol)，室溫攪拌過夜，反應(yīng)至原料完全消失，二氯甲烷萃取，濃縮，采用體積比5:1的石油醚∶乙酸乙酯柱層析梯度洗脫，即得化合物10c；產(chǎn)率：85％,淡黃色固體,mp 204-205℃；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.90(d,J＝7.9Hz,1H),7.82(s,1H),7.67(d,J＝7.8Hz,1H),7.64(s,1H),7.48(t,J＝7.9Hz,1H),3.66(t,J＝6.0Hz,2H),2.87(t,J＝6.4Hz,2H),2.63(s,3H),1.93–1.78(m,4H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ159.53(s),157.72(s),155.43(s),139.53(s),132.43(s),131.31(s),129.11(s),129.03(q,J＝10.3Hz),125.05(q,J＝3.9Hz),123.97(s),115.17(s),41.59(s),31.49(s),21.75(s),18.93(s),13.68(s)。

實(shí)施例23

制備化合物10d

在常溫下，將2-甲基-4-羰基-6,7,8,9-四氫吡啶[1,2-a]噻吩[2,3-d]嘧啶-3-胺鹽酸鹽化合物10(0.31g，1m mol)溶解在無水二氯甲烷(10ml)中，接著加入4-三氟甲基苯磺酰氯(0.27g，1.1m mol)，在攪拌下緩慢加入三乙胺(0.12g，1.2m mol)，室溫攪拌過夜，反應(yīng)至原料完全消失，二氯甲烷萃取，濃縮，采用體積比5:1的石油醚∶乙酸乙酯柱層析梯度洗脫，即得化合物10d；產(chǎn)率：83％,淡黃色固體,mp 193-194℃；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.74(d,J＝8.2Hz,2H),7.57(d,J＝9.8Hz,2H),7.53(s,1H),3.63(t,J＝5.9Hz,2H),2.87(t,J＝6.4Hz,2H),2.64(s,3H),1.89–1.80(m,4H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ159.42(s),157.61(s),155.37(s),141.69(s),134.18(d,J＝32.9Hz),132.54(s),128.56(s),125.14(q,J＝3.7Hz),123.89(s),123.22(d,J＝272.9Hz),115.23(s),41.71(s),31.50(s),21.66(s),18.89(s),13.67(s)。

實(shí)施例24

制備化合物10e

在常溫下，將2-甲基-4-羰基-6,7,8,9-四氫吡啶[1,2-a]噻吩[2,3-d]嘧啶-3-胺鹽酸鹽化合物10(0.31g，1m mol)溶解在無水二氯甲烷(10ml)中，接著加入4-三氟甲氧基苯磺酰氯(0.29g，1.1m mol)，在攪拌下緩慢加入三乙胺(0.12g，1.2m mol)，室溫攪拌過夜，反應(yīng)至原料完全消失，二氯甲烷萃取，濃縮，采用體積比5:1的石油醚∶乙酸乙酯柱層析梯度洗脫，即得化合物10e；產(chǎn)率：86％,淡黃色固體,mp 158-159℃；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.72–7.61(m,2H),7.59(s,1H),7.11(dd,J＝8.8,0.6Hz,2H),3.68(t,J＝6.1Hz,2H),2.87(t,J＝6.5Hz,2H),2.63(s,3H),1.94–1.78(m,4H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ159.41(s),157.76(s),155.33(s),152.11(s),136.71(s),132.25(s),130.15(s),124.22(s),120.15(d,J＝259.1Hz),120.19(s),115.31(s),77.34(s),77.02(s),76.70(s),41.81(s),31.56(s),21.73(s),18.95(s),13.72(s)。

實(shí)施例25

制備化合物10f

在常溫下，將2-甲基-4-羰基-6,7,8,9-四氫吡啶[1,2-a]噻吩[2,3-d]嘧啶-3-胺鹽酸鹽化合物10(0.31g，1m mol)溶解在無水二氯甲烷(10ml)中，接著加入3,5-二氟苯磺酰氯(0.23g，1.1m mol)，在攪拌下緩慢加入三乙胺(0.12g，1.2m mol)，室溫攪拌過夜，反應(yīng)至原料完全消失，二氯甲烷萃取，濃縮，采用體積比5:1的石油醚∶乙酸乙酯柱層析梯度洗脫，即得化合物10f；產(chǎn)率：82％,白色固體,mp 198-199℃；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.77(s,1H),7.24(dt,J＝6.1,3.6Hz,2H),6.88(tt,J＝8.5,2.3Hz,1H),3.79(t,J＝6.0Hz,2H),2.92(t,J＝6.5Hz,2H),2.61(s,3H),1.98–1.81(m,4H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ162.12(dd,J＝254.1,11.3Hz),159.42(s),157.94(s),155.46(s),141.79(t,J＝8.5Hz),131.88(s),123.71(s),115.14(s),111.49(q,J＝27.9Hz),108.05(t,J＝25.0Hz),41.78(s),31.49(s),21.80(s),18.94(s),13.77(s)。

實(shí)施例26

制備化合物10g

在常溫下，將2-甲基-4-羰基-6,7,8,9-四氫吡啶[1,2-a]噻吩[2,3-d]嘧啶-3-胺鹽酸鹽化合物10(0.31g，1m mol)溶解在無水二氯甲烷(10ml)中，接著加入3,4-二氟苯磺酰氯(0.23g，1.1m mol)，在攪拌下緩慢加入三乙胺(0.12g，1.2m mol)，室溫攪拌過夜，反應(yīng)至原料完全消失，二氯甲烷萃取，濃縮，采用體積比5:1的石油醚∶乙酸乙酯柱層析梯度洗脫，即得化合物10g；產(chǎn)率：84％,淡黃色固體,mp 188-189℃；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.68(s,1H),7.56(ddd,J＝9.5,7.3,2.2Hz,1H),7.43(ddd,J＝8.6,3.9,1.9Hz,1H),7.09(dd,J＝16.6,9.1Hz,1H),3.78(t,J＝6.0Hz,2H),2.93(t,J＝6.4Hz,2H),2.61(s,3H),1.96–1.81(m,4H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ159.29(s),157.86(s),155.53(s),153.12(dd,J＝256.7,12.6Hz),149.50(dd,J＝253.7,13.5Hz),135.20(d,J＝4.3Hz),132.04(s),125.15(dd,J＝7.5,4.0Hz),124.03(s),117.97(d,J＝20.1Hz),117.21(d,J＝18.4Hz),115.26(s),41.82(s),31.48(s),21.79(s),18.94(s),13.80(s)。

實(shí)施例27

制備化合物10h

在常溫下，將2-甲基-4-羰基-6,7,8,9-四氫吡啶[1,2-a]噻吩[2,3-d]嘧啶-3-胺鹽酸鹽化合物10(0.31g，1m mol)溶解在無水二氯甲烷(10ml)中，接著加入2,5-二氟苯磺酰氯(0.23g，1.1m mol)，在攪拌下緩慢加入三乙胺(0.12g，1.2m mol)，室溫攪拌過夜，反應(yīng)至原料完全消失，二氯甲烷萃取，濃縮，采用體積比5:1的石油醚∶乙酸乙酯柱層析梯度洗脫，即得化合物10h；產(chǎn)率：83％,淡黃色固體,mp 114-115℃；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.93(s,1H),7.37–7.31(m,1H),7.15(dtd,J＝10.6,7.0,3.4Hz,1H),7.05(td,J＝8.9,4.0Hz,1H),3.79(t,J＝6.0Hz,2H),2.92(t,J＝6.4Hz,2H),2.54(s,3H),1.96–1.83(m,4H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ159.47(s),157.89(s),157.68(dd,J＝168.6,2.7Hz),155.44(s),155.19(dd,J＝175.7,2.7Hz),132.70(s),128.37(dd,J＝16.7,6.8Hz),123.29(s),121.35(dd,J＝23.9,8.5Hz),118.14(dd,J＝24.5,7.8Hz),117.05(d,J＝26.9Hz),115.54(s),41.85(s),31.57(s),21.84(s),19.00(s),13.77(s)。

實(shí)施例28

制備化合物10i

在常溫下，將2-甲基-4-羰基-6,7,8,9-四氫吡啶[1,2-a]噻吩[2,3-d]嘧啶-3-胺鹽酸鹽化合物10(0.31g，1m mol)溶解在無水二氯甲烷(10ml)中，接著加入4-氯-3-硝基苯磺酰氯(0.33g，1.1m mol)，在攪拌下緩慢加入三乙胺(0.12g，1.2m mol)，室溫攪拌過夜，反應(yīng)至原料完全消失，二氯甲烷萃取，濃縮，采用體積比5:1的石油醚∶乙酸乙酯柱層析梯度洗脫，即得化合物10i；產(chǎn)率：72％,淡黃色固體,mp 229-230℃；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.97(d,J＝2.1Hz,1H),7.80(dd,J＝8.4,2.1Hz,1H),7.59(s,1H),7.51(d,J＝8.4Hz,1H),3.73(t,J＝6.0Hz,2H),2.93(t,J＝6.5Hz,2H),2.63(s,3H),1.98–1.83(m,4H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ159.82(s),157.77(s),155.85(s),147.48(s),138.48(s),133.47(s),130.86(s),124.85(s),123.19(s),115.03(s),41.90(s),31.57(s),21.72(s),18.96(s),13.69(s)。

實(shí)施例29

制備化合物10j

在常溫下，將2-甲基-4-羰基-6,7,8,9-四氫吡啶[1,2-a]噻吩[2,3-d]嘧啶-3-胺鹽酸鹽化合物10(0.31g，1m mol)溶解在無水二氯甲烷(10ml)中，接著加入3,5-二氯苯磺酰氯(0.27g，1.1m mol)，在攪拌下緩慢加入三乙胺(0.12g，1.2m mol)，室溫攪拌過夜，反應(yīng)至原料完全消失，二氯甲烷萃取，濃縮，采用體積比5:1的石油醚∶乙酸乙酯柱層析梯度洗脫，即得化合物10j；產(chǎn)率：84％,白色固體,mp 202-203℃；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.69(s,1H),7.54(d,J＝1.9Hz,2H),7.39(t,J＝1.9Hz,1H),3.81(t,J＝6.1Hz,2H),2.93(t,J＝6.5Hz,2H),2.61(s,3H),2.00–1.83(m,5H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ159.32(s),157.78(s),155.56(s),141.16(s),135.07(s),132.55(s),132.30(s),129.72(s),126.40(s),123.64(s),115.23(s),109.91(s),41.78(s),31.45(s),21.82(s),18.96(s),13.69(s)。

實(shí)施例30

制備化合物11a

在常溫下，將2-甲基-4-羰基-4,6,7,8,9,10-六氫噻吩[2',3':4,5]嘧啶[1,2-a]氮雜卓-3-胺鹽酸鹽化合物11(0.32g，1m mol)溶解在無水二氯甲烷(10ml)中，接著加入4-硝基苯磺酰氯(0.24g，1.1m mol)，在攪拌下緩慢加入三乙胺(0.12g，1.2m mol)，室溫攪拌過夜，反應(yīng)至原料完全消失，二氯甲烷萃取，濃縮，采用體積比10:1的石油醚∶乙酸乙酯柱層析梯度洗脫，即得化合物11a；產(chǎn)率：73％,白色固體,mp 224-225℃；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.17–8.09(m,2H),7.87–7.80(m,2H),7.69(s,1H),4.01(t,J＝4.8Hz,2H),2.94(t,J＝4Hz,2H),2.65(s,3H),1.79–1.70(m,4H),1.50(m,2H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ160.29(s),159.17(s),157.47(s),150.10(s),144.02(s),133.15(s),129.31(s),123.65(s),123.31(s),114.96(s),41.88(s),37.07(s),29.12(s),27.32(s),24.82(s),13.78(s)。

實(shí)施例31

制備化合物11b

在常溫下，將2-甲基-4-羰基-4,6,7,8,9,10-六氫噻吩[2',3':4,5]嘧啶[1,2-a]氮雜卓-3-胺鹽酸鹽化合物11(0.32g，1m mol)溶解在無水二氯甲烷(10ml)中，接著加入3,5-二氟苯磺酰氯(0.23g，1.1m mol)，在攪拌下緩慢加入三乙胺(0.12g，1.2m mol)，室溫攪拌過夜，反應(yīng)至原料完全消失，二氯甲烷萃取，濃縮，采用體積比10:1的石油醚∶乙酸乙酯柱層析梯度洗脫，即得化合物11b；產(chǎn)率：80％,淡黃色固體,mp 205-206℃；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.76(s,1H),7.21(dt,J＝6.0,3.7Hz,2H),6.88(tt,J＝8.4,2.3Hz,1H),4.13(t,J＝4.8Hz,2H),2.97(t,J＝4Hz,2H),2.61(s,3H),1.84-1.73(m,4H),1.67-1.59(m,2H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ160.11(s),158.46(s),156.03(s),152.91(s),137.46(s),132.79(s),130.77(s),125.62(s),121.75(d,J＝260.1Hz),120.59(s),115.63(s),41.84(s),37.31(s),29.37(s),27.51(s),24.89(s),13.71(s)。

實(shí)施例32

制備化合物11c

在常溫下，將2-甲基-4-羰基-4,6,7,8,9,10-六氫噻吩[2',3':4,5]嘧啶[1,2-a]氮雜卓-3-胺鹽酸鹽化合物11(0.32g，1m mol)溶解在無水二氯甲烷(10ml)中，接著加入3-氟-4-甲基苯磺酰氯(0.23g，1.1m mol)，在攪拌下緩慢加入三乙胺(0.12g，1.2m mol)，室溫攪拌過夜，反應(yīng)至原料完全消失，二氯甲烷萃取，濃縮，采用體積比10:1的石油醚∶乙酸乙酯柱層析梯度洗脫，即得化合物11c；產(chǎn)率：77％,淡黃色固體,mp 200-201℃；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.74(s,1H),7.35–7.27(m,2H),7.11(t,J＝7.7Hz,1H),4.10(t,J＝4.8Hz,2H),2.96(t,J＝4Hz,4H),2.61(s,3H),2.23(d,J＝1.8Hz,3H),1.84-1.75(m,4H),1.63-1.55(m,2H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ161.42(s),159.96(s),158.99(d,J＝8.7Hz),157.64(s),137.59(d,J＝7.0Hz),131.91(s),131.14(d,J＝4.9Hz),130.37(d,J＝17.1Hz),124.77(s),123.50(d,J＝3.7Hz),115.37(s),114.86(d,J＝24.6Hz),41.87(s),37.15(s),29.26(s),27.40(s),24.95(s),14.70(d,J＝3.6Hz),13.78(s)。

實(shí)施例33

制備化合物11d

在常溫下，將2-甲基-4-羰基-4,6,7,8,9,10-六氫噻吩[2',3':4,5]嘧啶[1,2-a]氮雜卓-3-胺鹽酸鹽化合物11(0.32g，1m mol)溶解在無水二氯甲烷(10ml)中，接著加入4-氯-3-硝基苯磺酰氯(0.33g，1.1m mol)，在攪拌下緩慢加入三乙胺(0.12g，1.2m mol)，室溫攪拌過夜，反應(yīng)至原料完全消失，二氯甲烷萃取，濃縮，采用體積比10:1的石油醚∶乙酸乙酯柱層析梯度洗脫，即得化合物11d；產(chǎn)率：75％,淡黃色固體,mp 211-212℃；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.95(d,J＝2.1Hz,1H),7.78(dd,J＝8.4,2.1Hz,1H),7.62(s,1H),7.51(d,J＝8.4Hz,1H),4.07(t,J＝4.8Hz,2H),2.97(t,J＝4Hz,2H),2.63(s,3H),1.85-1.74(m,4H),1.63-1.54(m,2H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ160.53(s),159.62(s),157.50(s),147.41(s),138.44(s),134.08(s),131.93(s),131.74(s),130.96(s),124.94(s),123.46(s),114.98(s),42.06(s),37.26(s),29.35(s),27.38(s),24.83(s),13.71(s)。

實(shí)施例34

制備化合物11e

在常溫下，將2-甲基-4-羰基-4,6,7,8,9,10-六氫噻吩[2',3':4,5]嘧啶[1,2-a]氮雜卓-3-胺鹽酸鹽化合物11(0.32g，1m mol)溶解在無水二氯甲烷(10ml)中，接著加入3,5-二氯苯磺酰氯(0.27g，1.1m mol)，在攪拌下緩慢加入三乙胺(0.12g，1.2m mol)，室溫攪拌過夜，反應(yīng)至原料完全消失，二氯甲烷萃取，濃縮，采用體積比10:1的石油醚∶乙酸乙酯柱層析梯度洗脫，即得化合物11e；產(chǎn)率：81％,淡黃色固體,mp 184-185℃；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.68(s,1H),7.51(d,J＝1.8Hz,2H),7.39(t,J＝1.8Hz,1H),4.13(t,J＝4.8Hz,2H),2.98(t,J＝4Hz,2H),2.62(s,3H),1.87-1.79(m,4H),1.69-1.61(m,2H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ160.24(s),159.36(s),157.61(s),141.05(s),135.11(s),132.99(s),132.36(s),126.39(s),123.98(s),115.15(s),42.02(s),37.28(s),29.38(s),27.49(s),24.89(s),13.76(s)。

實(shí)施例35

所獲得的氮雜環(huán)噻吩[2,3-d]嘧啶酮甲酰胺類化合物對B16黑素瘤細(xì)胞的黑素含量得測定：

(1)篩選模型：小鼠B16黑素瘤細(xì)胞；

(2)細(xì)胞來源：中科院細(xì)胞庫提供；

(3)培養(yǎng)條件：10％胎牛血清、1％雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基來培養(yǎng)細(xì)胞24h后加入不同濃度的藥物和陽性對照，分別在48h和72h測定酪氨酸活性和黑素含量；

(4)測定方法：

蛋白定量用Bradford法測定：

完全溶解蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(5mg/mlBSA)，取10μl稀釋至100μl，使終濃度為0.5mg/ml，蛋白樣品在什么溶液中，標(biāo)準(zhǔn)品也宜用什么溶液稀釋；但是為了簡便起見，也可以用0.9％NaCl或PBS稀釋標(biāo)準(zhǔn)品；將稀釋后標(biāo)準(zhǔn)品(0.5mg/mlBSA)按0，1，2，4，8，12，16，20μl分別加到96孔板中，加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液將所有標(biāo)準(zhǔn)品補(bǔ)足到20μl；加適當(dāng)體積樣品到96孔板的樣品孔中，加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液補(bǔ)足到20μl；各孔加入200μl Bradford染色液，用加樣槍輕輕吹打混勻(注意不要弄出氣泡影響讀數(shù))室溫放置3-5分鐘；用酶標(biāo)儀測定A595；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中的蛋白濃度。

黑素的含量用堿消化法進(jìn)行測定：

正處于對數(shù)生長期的B16黑素瘤細(xì)胞接種于6cm培養(yǎng)皿中、濃度為2×10⁵個/ml，各孔加5ml細(xì)胞懸浮液；接種12h后、待細(xì)胞完全貼壁后用藥，用藥濃度分別為5、10、20和40μg/ml；在72h后收集細(xì)胞；在不破碎細(xì)胞的情況下加入200μl的1M NaOH/10％DMSO溶液，置溫度80℃水浴中2h后在470nm處測定吸收值A(chǔ)。未用藥的組作為對照組與用藥組進(jìn)行對比見表1：

表1衍生物(9a-9h,10a-10j,11a-11e)對細(xì)胞中黑素合成、乙酰膽堿酯酶和丁酰膽堿酯酶抑制活性結(jié)果

從表中可以看出：所有化合物均可促進(jìn)小鼠B16細(xì)胞中黑素的生成，其中化合物10f和10j對黑素生成的促進(jìn)作用接近陽性對照的5倍；化合物10f、11a和11e對乙酰膽堿酯酶抑制率達(dá)30％以上；化合物9e和11e對丁酰膽堿酯酶抑制率達(dá)30％以上。