本發(fā)明涉及生物檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及用于人類ROS1融合基因的核酸、試劑盒及方法。
背景技術(shù)：
：肺癌是世界上發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤。從組織病理學(xué)上可以分為小細胞肺癌(Smallcelllungcancer，SCLC)和非小細胞肺癌(Non-smallcelllungcancer，NSCLC)兩大類，其中NSCLC包括鱗癌、腺癌、腺鱗癌、大細胞癌、類癌等，NSCLC約占肺癌總病例的85％。在發(fā)達國家肺癌患者的5年生存率可以達到20％左右，而我國肺癌患者的5年生存率僅為13％，而約70％的NSCLC在確診時己處于晚期。其主要原因是大多數(shù)肺癌由于缺乏高靈敏的基因突變檢測和確診技術(shù)，以及與之相配的科學(xué)治療方案，從而使患者錯失了治療的最佳時機。據(jù)我國衛(wèi)生部的統(tǒng)計，肺癌相關(guān)死亡率居惡性腫瘤總死亡率的首位。手術(shù)、放療和化療一直是NSCLC的主要治療方法。手術(shù)治療是NSCLC最佳治療方法，但當NSCLC被發(fā)現(xiàn)時，僅20～30％的病例有手術(shù)指征，且術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率仍高達50％以上。其主要治療方法化療的療效也并不讓人滿意。隨著腫瘤分子生物學(xué)的發(fā)展，肺癌的分子靶向治療因其特異性高，毒副作用低，日益成為臨床醫(yī)生首選治療方式。近年來，隨著對腫瘤發(fā)病機制及其生物學(xué)行為研究的不斷深入，肺癌的分子靶向治療領(lǐng)域成為研究熱點?；钚匝趸鶊F基因1(ReactiveOxygenSpecies1，ROS1)是胰島素受體家族的一種跨膜酪氨酸激酶，與禽流感肉瘤病毒UR2的v-ros序列具有同源性，因此被命名為ROS基因。ROS1基因編碼一種受體酪氨酸激酶，當與CD74、EZR、SLC34A2等基因發(fā)生融合后，會持續(xù)激活ROS1酪氨酸激酶區(qū)及下游PI3K/AKT、JAK/STAT、RAS/MAPK等信號通路，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。ROS1融合基因是NSCLC中最新發(fā)現(xiàn)的分子靶標，其融合基因具有生物學(xué)活性。就目前的研究而言，20～30％的NSCLC患者存在ROSl的高表達，作為最新發(fā)現(xiàn)的肺癌驅(qū)動基因，對臨床實踐具有非常重要的指導(dǎo)意義。臨床實踐證明，小分子酪氨酸激酶抑制劑克唑替尼(Crizotinib)對于ROS1融合陽性的NSCLC患者有顯著療效，檢測ROS1融合基因可篩選出對ROS1融合基因突變靶向藥物受益的患者。臨床上檢測ROS1融合基因突變的檢測方法主要為直接測序法和熒光原位雜交(FISH)法。然而，直接測序的靈敏度低，檢測靈敏度只有20-30％，易出現(xiàn)假陰性；檢測操作復(fù)雜，效率低，通常要1-2天才可出檢測結(jié)果；而FISH法檢測特異性差，靈敏度低，檢測時間長。此外，F(xiàn)ISH檢測需要昂貴的專用儀器設(shè)備，試劑成本較高，操作復(fù)雜，使臨床檢測廣泛使用受到了限制。FISH檢測要求檢測樣本保存時間不宜過長，采用保存時間長的樣本進行檢測會導(dǎo)致假陰性的發(fā)生，影響了檢測的準確性。因而，直接測序法和熒光原位雜交(FISH)法無法滿足臨床檢測實際的需求，臨床迫切需要開發(fā)一種快速融合基因突變檢測的方法，以實現(xiàn)對融合基因突變進行快速、準確地檢測。技術(shù)實現(xiàn)要素：為克服以上現(xiàn)有檢測人類ROS1融合基因方法的不足，本發(fā)明的目的是提供用于檢測人類ROS1融合基因的核酸組。本發(fā)明的另一個目的是提供一種用于檢測人類ROS1融合基因的試劑盒。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：用于檢測人類ROS1融合基因的核酸組，該核酸組包括以下S01～S12的12種ROS1融合基因變體類型的檢測引物對的一組或多組：S01：CD74:ROS1(C6:R32)的檢測引物對：核苷酸序列如SEQIDNo.1和SEQIDNO.2所示；S02：SDC4:ROS1(S2:R32)的檢測引物對：核苷酸序列如SEQIDNo.4和SEQIDNO.2所示；S03：SDC4:ROS1(S4:R32)的檢測引物對：核苷酸序列如SEQIDNo.5和SEQIDNO.2所示；S04：SLC34A2:ROS1(S4:R32)的檢測引物對：核苷酸序列如SEQIDNo.6和SEQIDNO.2所示；S05：SDC4:ROS1(S4:R34)的檢測引物對：核苷酸序列如SEQIDNo.7和SEQIDNO.8所示；S06：CD74:ROS1(C6:R34)的檢測引物對：核苷酸序列如SEQIDNo.10和SEQIDNO.8所示；S07：EZR:ROS1(E10:R34)的檢測引物對：核苷酸序列如SEQIDNo.11和SEQIDNO.8所示；S08：SLC34A2:ROS1(S4:R34)的檢測引物對：核苷酸序列如SEQIDNo.12和SEQIDNO.8所示；S09：TPM3:ROS1(T8:R35)的檢測引物對：核苷酸序列如SEQIDNo.13和SEQIDNO.14所示；S10：LRIG3:ROS1(L16:R35)的檢測引物對：核苷酸序列如SEQIDNo.16和SEQIDNO.14所示；S11：GOPC:ROS1(G8:R35)的檢測引物對：核苷酸序列如SEQIDNo.17和SEQIDNO.14所示；S12：GOPC:ROS1(G4:R36)的檢測引物對：核苷酸序列如SEQIDNo.18和SEQIDNO.19所示。如上所述核酸組，還包括用于熒光RT-PCR檢測時，各基因相應(yīng)的如下檢測探針：S01：CD74:ROS1(C6:R32)的檢測探針：核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；S02：SDC4:ROS1(S2:R32)的檢測探針：核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；S03：SDC4:ROS1(S4:R32)的檢測探針：核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；S04：SLC34A2:ROS1(S4:R32)的檢測探針：核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；S05：SDC4:ROS1(S4:R34)的檢測探針：核苷酸序列如SEQIDNO.9所示；S06：CD74:ROS1(C6:R34)的檢測探針：核苷酸序列如SEQIDNO.9所示；S07：EZR:ROS1(E10:R34)的檢測探針：核苷酸序列如SEQIDNO.9所示；S08：SLC34A2:ROS1(S4:R34)的檢測探針：核苷酸序列如SEQIDNO.9所示；S09：TPM3:ROS1(T8:R35)的檢測探針：核苷酸序列如SEQIDNO.15所示；S10：LRIG3:ROS1(L16:R35)的檢測探針：核苷酸序列如SEQIDNO.15所示；S11：GOPC:ROS1(G8:R35)的檢測探針：核苷酸序列如SEQIDNO.15所示；S12：GOPC:ROS1(G4:R36)的檢測探針：核苷酸序列如SEQIDNO.20所示，上述檢測探針的5’端標記熒光基團，3’端標記淬滅基團。如上所述核酸組，還包括用于每組基因檢測的內(nèi)部質(zhì)控，所述內(nèi)部質(zhì)控包括質(zhì)控引物對和質(zhì)控探針，所述質(zhì)控引物對的核苷酸序列如SEQIDNo.21和SEQIDNo.22所示，所述質(zhì)控探針的核苷酸序列如SEQIDNo.23所示，所述質(zhì)控探針的5’端標記有不同于所述檢測探針的熒光基團，3’端標記淬滅基團。如上所述核酸組，還包括S01～S12的12種ROS1融合基因變體類型中的一組或多組如下的陽性對照品：S01：CD74:ROS1(C6:R32)的陽性對照品：含有核苷酸序列如SEQIDNo.24所示；S02：SDC4:ROS1(S2:R32)的陽性對照品：含有核苷酸序列如SEQIDNo.25所示；S03：SDC4:ROS1(S4:R32)的陽性對照品：含有核苷酸序列如SEQIDNo.26所示；S04：SLC34A2:ROS1(S4:R32)的陽性對照品：含有核苷酸序列如SEQIDNo.27所示；S05：SDC4:ROS1(S4:R34)的陽性對照品：含有核苷酸序列如SEQIDNo.28所示；S06：CD74:ROS1(C6:R34)的陽性對照品：含有核苷酸序列如SEQIDNo.29所示；S07：EZR:ROS1(E10:R34)的陽性對照品：含有核苷酸序列如SEQIDNo.30所示；S08：SLC34A2:ROS1(S4:R34)的陽性對照品：含有核苷酸序列如SEQIDNo.31所示；S09：TPM3:ROS1(T8:R35)的陽性對照品：含有核苷酸序列如SEQIDNo.32所示；S10：LRIG3:ROS1(L16:R35)的陽性對照品：含有核苷酸序列如SEQIDNo.33所示；S11：GOPC:ROS1(G8:R35)的陽性對照品：含有核苷酸序列如SEQIDNo.34所示；S12：GOPC:ROS1(G4:R36)的陽性對照品：含有核苷酸序列如SEQIDNo.35所示。一種用于檢測人類ROS1融合基因的試劑盒，該試劑盒包括如上所述的核酸組。如上所述的試劑盒，優(yōu)選地，該試劑盒用于熒光RT-PCR檢測，其中，所述熒光基團為FAM、JOE、CY3、HEX、VIC中任意一種，所述淬滅基團為MGB、BHQ1、TAMRA、BHQ2中任意一種。如上所述的試劑盒，優(yōu)選地，該試劑盒用于熒光RT-PCR檢測，試劑盒內(nèi)包括：不同基因類型的檢測試劑：每一個ROS1融合基因變體的檢測引物和檢測探針在一個反應(yīng)體系中，該基因類型的反應(yīng)體系中還含有質(zhì)控引物對和質(zhì)控探針，以及PCR緩沖液，構(gòu)成一管該基因類型的檢測試劑；一管含反轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶的酶試劑；有陽性對照品的，還有一管陽性對照品混合液，陽性對照混合液內(nèi)含與該試劑盒內(nèi)所有檢測引物基因類型相應(yīng)的該種ROS1融合基因類型的陽性對照品。其中，PCR緩沖液含buffer、dNTPs、Mg2+等，可以直接購買市售商品，也可以自行配制，為現(xiàn)有技術(shù)已知內(nèi)容。如上所述的試劑盒，優(yōu)選地，試劑盒中包括全部12種ROS1融合基因類型的檢測引物對和檢測探針，每種基因類型的檢測引物和探針，連同質(zhì)控引物對和質(zhì)控探針以及PCR緩沖液獨立包裝在一管內(nèi)。本發(fā)明還提供了以上任一所述的用于檢測人類ROS1融合基因的試劑盒，用于熒光RT-PCR檢測，其中所述各基因的檢測探針的5’端標記FAM，所述質(zhì)控探針的5’端標記JOE，，使用方法是將待檢樣品提取RNA，加入到各種ROS1融合基因類型的檢測反應(yīng)體系中，進行熒光定量PCR反應(yīng)，收集反應(yīng)信號，JOE信號應(yīng)達到設(shè)定閾值Ct值小于26，檢測結(jié)果有效，否則實驗失敗，應(yīng)重新檢測；檢測JOE信號滿足Ct值小于26后，進行下列判斷：每種檢測體系中FAM信號Ct值＞30或無Ct值，表明該樣本陰性不存在ROS1融合基因；其中某種檢測體系中FAM信號Ct值≤30，表明該待檢樣品中含有該種類型的ROS1融合基因。優(yōu)選地，上述使用方法中，熒光定量PCR反應(yīng)程序為：45℃反應(yīng)5min，1個循環(huán)；95℃反應(yīng)5min，1個循環(huán)；95℃反應(yīng)30s，58℃反應(yīng)45s，共10個循環(huán)；95℃反應(yīng)15s，58℃反應(yīng)45s，共35個循環(huán)，在58℃時收集信號。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：(1)檢測融合類型多：可以檢測出多種ROS1融合基因，見表1。(2)明確融合類型：一種融合類型對應(yīng)一個反應(yīng)孔，使樣本檢測出來的融合類型很明確，見表4。(3)適用于多種樣本類型：本技術(shù)對標本RNA獲取質(zhì)量要求低，無論是新鮮組織還是石蠟組織，血清，血漿都能獲得理想的檢測效果。(4)操作簡單，檢測時間短：目前市場產(chǎn)品和技術(shù)都是兩步PCR，第一步反轉(zhuǎn)錄把RNA轉(zhuǎn)錄成cDNA，第二步開管把cDNA加入到PCR反應(yīng)條。但本試劑盒只需要一次加樣直接加入提取好的樣本RNA即可，反轉(zhuǎn)錄和PCR擴增在封閉的同一管反應(yīng)體系中進行，這樣不但降低了污染幾率，而且降低了結(jié)果出現(xiàn)偏差的幾率。一次檢測只需90分鐘完成。(5)特異性好：用本試劑盒檢測A549細胞系提取RNA，檢測ALK融合基因，檢測RET融合基因，檢測結(jié)果均為陰性。(6)靈敏度高：經(jīng)分析靈敏度，驗證1～10copyDNA基因組均可檢出。(7)結(jié)果判讀明確直觀：直接看擴增曲線和Ct值就可判斷結(jié)果?？傊?，本發(fā)明涉及的人類ROS1融合基因檢測試劑盒適用于臨床多種樣本類型選擇，具有檢測種類多，靈敏度高，實驗操作簡單，周期短，安全無毒，成本低等顯著優(yōu)點。附圖說明圖1為本發(fā)明試劑盒檢測含ROS1融合基因的非小細胞肺腺癌FFPE樣本RNA擴增曲線圖。圖2為本發(fā)明試劑盒檢測S1體系靈敏度的擴增曲線圖。圖3為本發(fā)明試劑盒檢測S2體系靈敏度的擴增曲線圖。圖4為本發(fā)明試劑盒檢測S3體系靈敏度的擴增曲線圖。圖5為本發(fā)明試劑盒檢測S4體系靈敏度的擴增曲線圖。圖6為本發(fā)明試劑盒檢測S5體系靈敏度的擴增曲線圖。圖7為本發(fā)明試劑盒檢測S6體系靈敏度的擴增曲線圖。圖8為本發(fā)明試劑盒檢測S7體系靈敏度的擴增曲線圖。圖9為本發(fā)明試劑盒檢測S8體系靈敏度的擴增曲線圖。圖10為本發(fā)明試劑盒檢測S9體系靈敏度的擴增曲線圖。圖11為本發(fā)明試劑盒檢測S10體系靈敏度的擴增曲線圖。圖12為本發(fā)明試劑盒檢測S11體系靈敏度的擴增曲線圖。圖13為本發(fā)明試劑盒檢測S12體系靈敏度的擴增曲線圖。圖14為本發(fā)明試劑盒檢測不含ROS1融合基因的A549細胞系RNA模板擴增曲線圖。圖15為本發(fā)明試劑盒檢測含有ALK融合基因定的擴增曲線圖。圖16為本發(fā)明試劑盒檢測含有RET融合基因模板的擴增曲線圖。具體實施方式以下結(jié)合具體實例對本發(fā)明做進一步詳細說明，并非對本發(fā)明的限定，本發(fā)明的實施方式并不限于此，本發(fā)明提供的核苷酸序列的互補序列也可實現(xiàn)本發(fā)明，如無特殊說明，所用試劑為常規(guī)試劑，因此凡依照本公開內(nèi)容所作出的本領(lǐng)域的等同替換，均屬于本發(fā)明的保護范圍。實施例1引物、探針、驗證模板設(shè)計本發(fā)明是針對人類ROS1融合基因12組不同融合基因類型來設(shè)計檢測引物，本發(fā)明設(shè)計的檢測引物用于普通PCR可擴增出對應(yīng)的融合基因類型的特異性產(chǎn)物，并設(shè)計檢測探針用于實時熒光RT-PCR的檢測，具體融合基因的類型見表1.表1本發(fā)明可檢測融合基因的類型通過對檢測引物對、檢測探針的篩選和體系的優(yōu)化，最終確定的各基因的檢測引物對和檢測探針及可以作為陽性對照品的各基因?qū)?yīng)擴增產(chǎn)物的序列如下，其中檢測引物對及探針的核苷酸序列見表2，ROS1融合基因外顯子拼接序列，即陽性對照品的序列見表3。S01：ROS1融合基因變體：CD74:ROS1(C6:R32)的檢測引物對：上游引物(SEQIDNO.1)，下游引物(SEQIDNO.2)、檢測探針(SEQIDNO.3)；其陽性對照品(含SEQIDNO.24)；S02：ROS1融合基因變體：SDC4:ROS1(S2:R32)的檢測引物對：上游引物(SEQIDNO.4)，下游引物(SEQIDNO.2)；檢測探針(SEQIDNO.3)、其陽性對照品(SEQIDNO.25)；S03：ROS1融合基因變體：SDC4:ROS1(S4:R32)的檢測引物對：上游引物(SEQIDNO.5)，下游引物(SEQIDNO.2)；檢測探針：(SEQIDNO.3),其陽性對照品(SEQIDNO.26)；S04：ROS1融合基因變體：SLC34A2:ROS1(S4:R32)的檢測引物對：上游引物(SEQIDNO.6)，下游引物(SEQIDNO.2)；檢測探針(SEQIDNO.3)，其陽性對照品(SEQIDNO.27)；S05：ROS1融合基因變體：SDC4:ROS1(S4:R34)的檢測引物對：上游引物(SEQIDNO.7)，下游引物(SEQIDNO.8)，檢測探針(SEQIDNO.9)，其陽性對照品(SEQIDNO.28)；S06：ROS1融合基因變體：CD74:ROS1(C6:R34)的檢測引物對：上游引物(SEQIDNO.10)，下游引物(SEQIDNO.8)，檢測探針(SEQIDNO.9)，其陽性對照品(SEQIDNO.29)；S07：ROS1融合基因變體：EZR:ROS1(E10:R34)的檢測引物對：上游引物(SEQIDNO.11)，下游引物(SEQIDNO.8)，檢測探針(SEQIDNO.9)，其陽性對照品(SEQIDNO.30)；S08：ROS1融合基因變體：SLC34A2:ROS1(S4:R34)的檢測引物對：上游引物(SEQIDNO.12)，下游引物(SEQIDNO.8)，檢測探針(SEQIDNO.9)，其陽性對照品(SEQIDNO.31)；S09：ROS1融合基因變體：TPM3:ROS1(T8:R35)的檢測引物對：上游引物(SEQIDNO.13)，下游引物(SEQIDNO.14)，檢測探針(SEQIDNO.15)，其陽性對照品(SEQIDNO.32)；S10：ROS1融合基因變體：LRIG3:ROS1(L16:R35)的檢測引物對：上游引物(SEQIDNO.16)，下游引物(SEQIDNO.14)，檢測探針(SEQIDNO.15)，其陽性對照品(SEQIDNO.33)；S11：ROS1融合基因變體：GOPC:ROS1(G8:R35)的檢測引物對：上游引物(SEQIDNO.17)，下游引物(SEQIDNO.14)，檢測探針(SEQIDNO.15)，其陽性對照品(SEQIDNO.34)；S12：ROS1融合基因變體：GOPC:ROS1(G4:R36)的檢測引物對：上游引物(SEQIDNO.18)，下游引物(SEQIDNO.19)，檢測探針(SEQIDNO.20)，其陽性對照品(SEQIDNO.35)。表2相關(guān)引物探針序列編號序列(5＇-3＇)SEQIDNO.1TGTTTGAAATGAGCAGGCACTSEQIDNO.2CATTATCTTCAGCTTTCTCCCACTGSEQIDNO.3TTTGGGAATGCCTGGTTSEQIDNO.4GGCAGGAATCTGATGACTTSEQIDNO.5AGAGAATCTCACCCGTTGAAGAGSEQIDNO.6GGATATTCTTAGTAGCGCCTTCCSEQIDNO.7GTTTGAAATGAGCAGGCACTSEQIDNO.8CAAAGGTCAGTGGGATTGTAACASEQIDNO.9CCAGAAATATTCCAACTATSEQIDNO.10GACAGGCGGTGGATCAGATAASEQIDNO.11ACTGTGCAGGGCAGCAACASEQIDNO.12GGATATTCTTAGTAGCGCCTTCCSEQIDNO.13TAGTTATTTGTCATCTCAGGGAACGSEQIDNO.14GTATTGCATAGCAGGCATTAGCCSEQIDNO.15CCTACTCCGGCTGCCASEQIDNO.16TTGAGGCTCAGGCGGAGAASEQIDNO.17CTTGATGAGTTAGAAGGAGGTGGTASEQIDNO.18GAATGAAGCCCTTCGTAGACATASEQIDNO.19CTTCATACACTTCTCCAAAGGCTCSEQIDNO.20CCGAGGGAAGGCAGGSEQIDNO.21ACCGAGCGCGGCTACAGSEQIDNO.22CTTAATGTCACGCACGATTTCCSEQIDNO.23ACCACCACGGCCGAG表3ROS1融合基因外顯子拼接進一步，為了對上述各組基因檢測時，對實時熒光PCR反應(yīng)體系和實驗操作過程進行質(zhì)控，同時檢測樣本的質(zhì)量，避免漏檢，本發(fā)明選用根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫公布的人類ACTB基因設(shè)計的內(nèi)部控制引物和內(nèi)控探針，并對內(nèi)控的上下游引物進行篩選，使非模版體系(NTC)不起線，樣本起線正常，并且要求設(shè)計的質(zhì)控引物、質(zhì)控探針、及質(zhì)控擴增產(chǎn)物均不會與上述基因的檢測引物對、檢測探針及擴增產(chǎn)物有交叉反應(yīng)。通過內(nèi)部質(zhì)控的質(zhì)控引物對、質(zhì)控探針的篩選和體系優(yōu)化，建立了實時熒光PCR內(nèi)部質(zhì)控檢測體系，其中，質(zhì)控引物對(SEQIDNO.21～22)、質(zhì)控探針(SEQIDNO.23)最后確定的核苷酸序列如表1中所示。作為內(nèi)部質(zhì)控的質(zhì)控引物對進行PCR擴增時，其擴增序列的大小為60bp，將擴增序列作為內(nèi)部質(zhì)控陽性對照物，即包含如SEQIDNo.36所示序列，作為驗證是否漏檢的質(zhì)控陽性對照。實施例2：用于檢測人類ROS1融合基因的試劑盒用于檢測人類ROS1融合基因的試劑盒包括有實施例1中的檢測12種不同的ROS1融合基因變體類型的檢測引物對，可用于普通PCR擴增，來檢測相對應(yīng)的ROS1融合基因變體。優(yōu)選地，在上述試劑盒的基礎(chǔ)上，用于實時熒光RT-PCR檢測時，添加有各基因檢測探針，檢測探針的5’端標記熒光基團，3’端標記淬滅基團，可用實時熒光RT-PCR來檢測相應(yīng)的ROS1融合基因變體。檢測效率高，耗時短，不用跑電泳就可以獲得檢測結(jié)果。其中，熒光基團為FAM、JOE、CY3、HEX、VIC中任意一種，所述淬滅基團為MGB、BHQ1、TAMRA、BHQ2中任意一種。為了便于PCR反應(yīng)時，反應(yīng)體系的配置，試劑盒還配有其他的反應(yīng)試劑如PCR緩沖液、反轉(zhuǎn)錄酶、DNA聚合酶、DEPC水等。在實際操作中，反應(yīng)體系需要一一配置，本發(fā)明中提供一種配置好反應(yīng)體系的試劑盒，該試劑盒用于人類ROS1融合基因的檢測試劑盒，含12個PCR反應(yīng)體系(兩條6聯(lián)條PCR管)，用來檢測待檢樣本ROS1融合基因變體的情況。試劑盒內(nèi)還有一管酶試劑(含有RT酶、TaqDNA酶)，試劑盒內(nèi)PCR反應(yīng)體系組成及檢測ROS1融合類型見表4。表4ROS1融合基因熒光PCR檢測試劑盒組成其中，RT酶為逆轉(zhuǎn)錄酶，用于將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA；TaqDNA酶為DNA聚合酶；buffer為反應(yīng)緩沖液；檢測探針為TaqMan-MGB探針，5’端可標記FAM、JOE、CY3、HEX、VIC中任意一種，3’端可標記MGB、BHQ1、TAMRA、BHQ2中任意一種。對樣品進行檢測時，為避免漏檢，如避免有的反應(yīng)體系中未加檢測樣本的情況出現(xiàn)，在每個檢測體系中均設(shè)置有內(nèi)部質(zhì)控，即將質(zhì)控引物對和質(zhì)控探針都加入上述各檢測體系中，其質(zhì)控引物對和質(zhì)控探針具體序列如實施例1中所述。應(yīng)當注意的是檢測探針與質(zhì)控探針熒光基團標記為不同檢測模式的熒光基團。實施例3實時熒光RT-PCR法擴增臨床樣本RNA1.臨床樣本RNA的提取本實施例是從同濟醫(yī)院獲得的4例非小細胞肺腺癌患者的石蠟包埋組織切片中提取RNA，并對其進行定量，作為檢測模板。采用Qiagen公司的Cat.NO.73504QIAamp石蠟包埋組織提取試劑盒，具體詳見該說明書，最后將將提取的RNA用紫外分光光度計進行定量，并稀釋RNA濃度到1ng/μL。2.運用實施例2中表4所述的試劑盒進行檢測，其中，檢測探針的5’端標記為熒光基團為FAM，3’端標記淬滅基團為MGB質(zhì)控探針的5’端標記為JOE，3’端標記淬滅基團BHQ1，檢測步驟如下：(1)首先取6支離心管(PCR級，需自備)在管蓋分別標記樣本1、樣本2、樣本3、樣本4、陰性對照和陽性對照；其次對相應(yīng)6支離心管分別加入65μL(2ng/μL)待檢測樣本、陽性對照(STD)及非模板對照NTC(超純水)至管底；最后再向6支離心管各自加入酶試劑(含RT酶和TaqDNA聚合酶)6.5μL；蓋緊離心管蓋后輕微震蕩，離心，置于冰上，待用。(2)取PCR反應(yīng)條，確定好管號后輕輕打開PCR反應(yīng)條管蓋，，將步驟(1)混勻的待用液分別加到相對應(yīng)的PCR孔中，5.5μL/孔。蓋緊PCR反應(yīng)條管蓋，混勻離心，確保試劑全在PCR反應(yīng)管的管底。(3)把離心好的PCR反應(yīng)條放于熒光定量PCR儀中，其中，PCR反應(yīng)體系為：(4)設(shè)定反應(yīng)程序如下：第一階段：45℃反應(yīng)5min；第二階段：95℃5min；第三階段：95℃30s，58℃45s，10個循環(huán)；第四階段：95℃反應(yīng)15s，58℃反應(yīng)45s，35個循環(huán)；第四階段：35個循環(huán)時，58℃45s收集FAM和JOE信號。本發(fā)明通過各反應(yīng)體系檢測的FAM和JOE的熒光強度來判斷檢測結(jié)果；JOE是內(nèi)控信號，用于檢測是否漏加樣本及判定樣本質(zhì)量，JOE信號應(yīng)達到設(shè)定閾值(CT值＜26)；FAM是檢測信號，用于檢測是否存在ROS1融合基因位點；在內(nèi)控信號達到要求后，以FAM信號達到設(shè)定閾值所需的循環(huán)次數(shù)Ct值作為判斷標準，若12孔PCR管的FAM信號通道的Ct值＞30或無Ct證明樣本陰性不存在融合類型，若12孔PCR管的FAM信號通道的任何一孔有擴增曲線且Ct值＜30則證明樣本陽性存在融合類型，哪一孔有擴增曲線就判定次樣本為對應(yīng)哪種ROS1融合類型。具體判定見表5。表5：試劑盒結(jié)果判定參考值經(jīng)過陽性對照品驗證后，樣本陰陽性的檢測結(jié)果完全準確，其中，樣本3含ROS1融合基因的非小細胞肺腺癌FFPE樣本RNA擴增曲線圖，見圖1。實施例4本發(fā)明試劑盒靈敏度和特異性檢測1.靈敏度檢測將實施例2的試劑盒中的陽性對照品進行稀釋，加入上述12種各基因檢測的反應(yīng)體系中，使在每個反應(yīng)體系中，分別含有濃度為1000拷貝/反應(yīng)、100拷貝/反應(yīng)、10拷貝/反應(yīng)、1拷貝/反應(yīng)的陽性對照品，進行實施例3中的實時熒光RT-PCR擴增，各個反應(yīng)體系的靈敏度擴增圖見圖2～圖13，由擴增圖可看出，本發(fā)明的試劑盒可以準確檢出低至1～10copyDNA基因的基因組DNA。2.特異性檢測運用實施例2制備的試劑盒對由同濟醫(yī)院提供的不含ROS1融合基因的A549細胞系RNA、含有ALK融合基因和RET融合基因的樣本為模板，進行實施例3中的實時熒光RT-PCR法檢測，擴增曲線：其中不含ROS1融合基因的A549細胞系RNA的檢測結(jié)果如圖14，顯示只有JOE有曲線，F(xiàn)AM信號通道無曲線；含有ALK融合基因為模板的檢測結(jié)果見圖15，顯示只有JOE有曲線，F(xiàn)AM信號通道無曲線；其中含有RET融合基因為模板的檢測結(jié)果見圖16，顯示只有JOE有曲線，F(xiàn)AM信號通道無曲線。說明本發(fā)明設(shè)計的引物對與檢測探針具有較強的特異性。特異性強，與其它非目的基因沒有非特異性擴增。以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實施例而已，并非是對本發(fā)明做其它形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容加以變更或改型為等同變化的等效實施例。但是凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實質(zhì)對以上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與改型，仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護范圍。SEQUENCELISTING<110>武漢海吉力生物科技有限公司<120>用于檢測人類ROS1融合基因的核酸、試劑盒及方法<130><160>36<170>PatentInversion3.5<210>1<211>21<212>DNA<213>人工合成<400>1tgtttgaaatgagcaggcact21<210>2<211>25<212>DNA<213>人工合成<400>2cattatcttcagctttctcccactg25<210>3<211>17<212>DNA<213>人工合成<400>3tttgggaatgcctggtt17<210>4<211>19<212>DNA<213>人工合成<400>4ggcaggaatctgatgactt19<210>5<211>23<212>DNA<213>人工合成<400>5agagaatctcacccgttgaagag23<210>6<211>23<212>DNA<213>人工合成<400>6ggatattcttagtagcgccttcc23<210>7<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>7gtttgaaatgagcaggcact20<210>8<211>23<212>DNA<213>人工合成<400>8caaaggtcagtgggattgtaaca23<210>9<211>19<212>DNA<213>人工合成<400>9ccagaaatattccaactat19<210>10<211>21<212>DNA<213>人工合成<400>10gacaggcggtggatcagataa21<210>11<211>19<212>DNA<213>人工合成<400>11actgtgcagggcagcaaca19<210>12<211>23<212>DNA<213>人工合成<400>12ggatattcttagtagcgccttcc23<210>13<211>25<212>DNA<213>人工合成<400>13tagttatttgtcatctcagggaacg25<210>14<211>23<212>DNA<213>人工合成<400>14gtattgcatagcaggcattagcc23<210>15<211>16<212>DNA<213>人工合成<400>15cctactccggctgcca16<210>16<211>19<212>DNA<213>人工合成<400>16ttgaggctcaggcggagaa19<210>17<211>25<212>DNA<213>人工合成<400>17cttgatgagttagaaggaggtggta25<210>18<211>23<212>DNA<213>人工合成<400>18gaatgaagcccttcgtagacata23<210>19<211>24<212>DNA<213>人工合成<400>19cttcatacacttctccaaaggctc24<210>20<211>15<212>DNA<213>人工合成<400>20ccgagggaaggcagg15<210>21<211>17<212>DNA<213>人工合成<400>21accgagcgcggctacag17<210>22<211>22<212>DNA<213>人工合成<400>22cttaatgtcacgcacgatttcc22<210>23<211>15<212>DNA<213>人工合成<400>23accaccacggccgag15<210>24<211>141<212>DNA<213>人工合成<400>24tgtttgaaatgagcaggcactccttggagcaaaagcccactgacgctccaccgaaagctg60gagtcccaaataaaccaggcattcccaaattactagaagggagtaaaaattcaatacagt120gggagaaagctgaagataatg141<210>25<211>129<212>DNA<213>人工合成<400>25ggcaggaatctgatgactttgagctgtctggctctggagatctggctggagtcccaaata60aaccaggcattcccaaattactagaagggagtaaaaattcaatacagtgggagaaagctg120aagataatg129<210>26<211>189<212>DNA<213>人工合成<400>26agagaatctcacccgttgaagagagtgaggatgtgtccaacaaggtgtcaatgtccagca60ctgtgcagggcagcaacatctttgagagaacggaggtcctggcagctggagtcccaaata120aaccaggcattcccaaattactagaagggagtaaaaattcaatacagtgggagaaagctg180aagataatg189<210>27<211>119<212>DNA<213>人工合成<400>27ggatattcttagtagcgccttccagctggttggagctggagtcccaaataaaccaggcat60tcccaaattactagaagggagtaaaaattcaatacagtgggagaaagctgaagataatg119<210>28<211>130<212>DNA<213>人工合成<400>28actgtgcagggcagcaacatctttgagagaacggaggtcctggcagatgatttttggata60ccagaaacaagtttcatacttactattatagttggaatatttctggttgttacaatccca120ctgacctttg130<210>29<211>141<212>DNA<213>人工合成<400>29tgtttgaaatgagcaggcactccttggagcaaaagcccactgacgctccaccgaaagatg60atttttggataccagaaacaagtttcatacttactattatagttggaatatttctggttg120ttacaatcccactgacctttg141<210>30<211>122<212>DNA<213>人工合成<400>30gacaggcggtggatcagataaagagccaggagcagctgatgatttttggataccagaaac60aagtttcatacttactattatagttggaatatttctggttgttacaatcccactgacctt120tg122<210>31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