本發(fā)明涉及微生物轉(zhuǎn)化提取植物有效成分的技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，是提供一種從化橘紅葉原料中轉(zhuǎn)化和制備柚皮素和芹菜素的方法。

背景技術(shù)：

柚皮素屬二氫黃酮類化合物，它是柚皮苷的苷元，白色針狀結(jié)晶，熔點(diǎn)260℃，溶于乙醇、乙醚和苯，幾乎不溶于水，分子式為C15H12O5，分子量為272.25，結(jié)構(gòu)式如式1所示。具有抗菌、抗炎、抗氧化、止咳祛痰、降血脂、抗腫瘤、利膽、預(yù)防和治療肝病、抑制血小板凝結(jié)等作用，可被廣泛地應(yīng)用于醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域。

目前，制備柚皮素的方法主要有兩種：1、提取法，即從含有柚皮素的植物原料中通過(guò)特定工藝流程進(jìn)行提取，由于天然植物材料中含量低，提取分離工藝復(fù)雜，因此，收率低且三廢排放量大。2、水解法，即以柚皮苷作為反應(yīng)物，通過(guò)對(duì)反應(yīng)物進(jìn)行水解反應(yīng)制備柚皮素。水解法主要包括酶解法和酸水解法。酶解法是以提取得到的柚皮苷為底物，用由α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶組成混合柚苷酶催化水解，產(chǎn)物為柚皮素、鼠李糖和葡萄糖，但柚苷酶造價(jià)高，易失活，效率低，成本高。酸水解法一般采用硫酸水解柚皮苷得到柚皮素，但該方法所得到的柚皮素需要用乙醇反復(fù)結(jié)晶才能得到高純度柚皮素，有機(jī)溶媒進(jìn)行酸水解也增加了成本和操作復(fù)雜程度。

芹菜素屬黃酮類化合物，幾乎不溶于水，部分溶于熱酒精，溶于稀KOH 溶液。分子式：C15H10O5 ，分子量：270.24，熔點(diǎn)345～350℃，結(jié)構(gòu)式如式2所示。來(lái)源于傘形科植物旱芹葉，具有抑制致癌物質(zhì)的致癌活性，作為治療HIV和其它病毒感染的抗病毒藥物，治療各種炎癥，具有抗氧化、鎮(zhèn)靜、安神和降壓等作用。

目前，國(guó)內(nèi)外制備芹菜素有兩種方式：天然提取和半合成。天然的含量很低，提取工藝復(fù)雜，效率低。半合成是從柚皮苷分解得到柚皮素再脫氫得到芹菜素。以柚皮苷為原料要經(jīng)過(guò)兩步反應(yīng)才能制備，過(guò)程復(fù)雜，而且碘的用量較大。

化橘紅葉中含有豐富的黃酮柚皮苷和野漆樹苷（二者占葉干物質(zhì)6～13.6%），并同時(shí)含有少量的柚皮素和芹菜素（二者占葉干物質(zhì)0.1～0.6%），柚皮苷和野漆樹苷具有延緩衰老、防腐、抗菌、抗氧化等功效，通常情況下黃酮苷是通過(guò)體內(nèi)分解成苷元而起到生理作用，苷元比其苷有更強(qiáng)的生理活性，因此，把黃酮苷轉(zhuǎn)化成其苷元能提高中藥藥效。通過(guò)微生物使化橘紅葉黃酮苷轉(zhuǎn)化，提高藥材中的苷元含量，或分別制備柚皮素和芹菜素，能有效地提高化橘紅的利用價(jià)值?；偌t營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)速度快，年抽稍3～5次，枝葉產(chǎn)量巨大，目前廣東化州市及周邊地區(qū)化橘紅種植面積約20萬(wàn)畝，并以每年增加1萬(wàn)畝的速度擴(kuò)大種植規(guī)模，因此，化橘紅葉類黃酮的資源供應(yīng)充足。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種通過(guò)微生物轉(zhuǎn)化化橘葉黃酮制備柚皮素和芹菜素的方法，以解決上述背景技術(shù)中提出的問(wèn)題。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

一種通過(guò)微生物轉(zhuǎn)化化橘葉黃酮制備柚皮素和芹菜素的方法，具體步驟如下：

1. 一種通過(guò)微生物轉(zhuǎn)化化橘紅葉黃酮制備柚皮素和芹菜素的方法，其特征在于，具體步驟如下：

（1）采摘化橘紅嫩葉洗凈，太陽(yáng)曬干或置于烘箱中50～60℃烘干至恒重，粉碎過(guò)60～80目篩，得到化橘紅嫩葉粉末，備用；

（2）取化橘紅嫩葉粉末，用蒸餾水濕潤(rùn)，充分?jǐn)噭颍謩e放置在培養(yǎng)皿中，敞開，置于溫度為25～30℃、濕度為75～95％的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72～96h，自然生長(zhǎng)繁殖的細(xì)菌或霉菌作菌種；

（3）取細(xì)菌、霉菌制成懸浮液，接種于馬鈴薯液體培養(yǎng)基中，30~40℃、180~250 rpm 培養(yǎng)48~72 h，得種子菌培養(yǎng)液；

（4）取化橘紅葉粉末加入適量水，攪拌均勻制成轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基，加入上述培養(yǎng)的種子菌培養(yǎng)液，攪拌均勻，在搪瓷托盤中鋪平，置于溫度為30～40℃，濕度為75～95%生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)48～96h；

（5）將經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)基置于100～110℃下進(jìn)行加熱以終止發(fā)酵，后調(diào)節(jié)溫度至50～60℃進(jìn)行烘干，粉碎過(guò)70～90目篩，得到菌絲和培養(yǎng)基混合粉末；

（6）將所得的混合粉末裝入玻璃層析柱中，用95%的乙醇作為洗脫液提取，收集2倍體積的洗脫液；

（7）將洗脫液經(jīng)減壓濃縮回收乙醇，濃縮液轉(zhuǎn)移并用蒸餾水洗滌合并到分液漏斗，加入等量體積石油醚萃取3次，去除上層液，得到下層含有柚皮素和芹菜素混合液；

（8）將所得的含有柚皮素和芹菜素混合液，用乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)減壓濃縮，得到柚皮素和芹菜素粗產(chǎn)品，所得浸膏用甲醇復(fù)溶，過(guò)濾，除去沉淀，濾液旋干備用；

（9）將所得的粗產(chǎn)品經(jīng)D101大孔樹脂分離純化，首先用蒸餾水預(yù)洗除雜，再用2%KOH 水溶液洗去色素，然后依次用不同濃度的乙醇溶液進(jìn)行洗脫，用紫外吸收光譜和高效液相跟蹤檢測(cè)，分別收集兩組分含量最高的洗脫液，減壓濃縮，分別得到柚皮素和芹菜素。

作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：所述的種子菌培養(yǎng)基，其成分包括馬鈴薯、化橘紅果實(shí)粉末和水分，配制方法：將煮熟馬鈴薯150g磨成漿，加入化橘紅果實(shí)細(xì)粉末50g，搖勻，定容到1000mL。所述的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基是用適量的水濕潤(rùn)嫩葉粉末制成。

作為本發(fā)明進(jìn)一步的方案：所述步驟（8）中，在用KOH 水溶液水洗后，分別用體積分?jǐn)?shù)為4BV/h的20%乙醇、2BV/h的30%乙醇、2BV/h的40%乙醇、2BV/h的50%乙醇、2BV/h的60%的乙醇、4BV/h的70%乙醇進(jìn)行洗脫。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

本發(fā)明方法不需要分別提取柚皮苷和野漆樹苷，而是直接利用微生物轉(zhuǎn)化化橘紅葉中同時(shí)存在的柚皮苷和野漆樹苷底物。本發(fā)明的條件溫和，方法簡(jiǎn)單易操作，成本低，避免了酸水解帶來(lái)的污染問(wèn)題，由于菌種取于自然生長(zhǎng)在化橘紅枝條或果實(shí)上的，因而具有專一性強(qiáng)、轉(zhuǎn)化率高的優(yōu)點(diǎn)，制備的柚皮素和芹菜素純度可達(dá)98% 以上。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

實(shí)施例1

采摘化橘紅嫩葉洗凈，太陽(yáng)曬干或置烘箱中60℃烘干至恒重，粉碎過(guò)80目篩備用。取葉粉末100 g，用蒸餾水適量，濕潤(rùn)，充分?jǐn)噭?，分盛在直?2cm的培養(yǎng)皿中，敞開，置溫度25℃，濕度85%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h，自然生長(zhǎng)繁殖的細(xì)菌或霉菌作菌種。將煮熟馬鈴薯150g磨成漿，加入化橘紅果實(shí)粉末50g，搖勻，用水定容到1000mL，制成馬鈴薯種子菌培養(yǎng)基。取上述菌種2 g (含培養(yǎng)基)接種于500mL馬鈴薯液體種子菌培養(yǎng)基中，30℃、180 rpm 培養(yǎng)60 h，得種子菌培養(yǎng)液。

取化橘紅葉粉末1000g加3000mL水，攪勻，即成轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基，加入上述培養(yǎng)的種子菌液250mL，攪拌均勻，分裝在4個(gè)20*30cm型搪瓷托盤，鋪平，置于溫度35℃，濕度75%生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)72小時(shí)；轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基置105℃溫度下加熱2h以終止發(fā)酵，后調(diào)節(jié)溫度65℃烘干，粉碎過(guò)80目篩，混合粉末裝入直徑為8cm玻璃層析柱中，用95%的乙醇作為洗脫液提取，收集2倍體積（mL/g）即2000mL洗脫液，洗脫液經(jīng)減壓濃縮回收乙醇，濃縮液轉(zhuǎn)移并用少量水洗合并約100mL到分液漏斗。每次加入等量體積石油醚萃取3次，去除上層液（含葉色素），得到下層含有柚皮素和芹菜素混合液。用乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)減壓濃縮得到柚素和芹菜素粗產(chǎn)品，所得浸膏用甲醇復(fù)溶，過(guò)濾，除去沉淀，濾液用水稀釋到200mL。

選取直徑為8 cm玻璃層析柱，裝入預(yù)處理好的大孔吸附樹脂D101，將上述樣液注入層析柱中，上樣流速3 mL/min，上樣量200mL，等樣液完全滲透到樹脂后，首先用5 BV/h 蒸餾水預(yù)洗除雜，再用2BV/h 2%KOH 水溶液洗去殘余色素，然后依次用體積分?jǐn)?shù)為4BV/h的20%乙醇、2BV/h 30%乙醇、2BV/h 40%乙醇、2BV/h 50% 乙醇、2BV/h 60% 、4BV/h 70% 乙醇洗脫，每收集小管收集10mL，紫外吸收光譜和高效液相跟蹤檢測(cè)，分別合并兩組份含量最高的前后共5支收集管洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，至無(wú)乙醇，分別得到柚皮素和芹菜素。轉(zhuǎn)化與分離純化結(jié)果見表1。

表1 化橘紅葉類黃酮物質(zhì)微生物轉(zhuǎn)化前后的含量及苷元的回收率

實(shí)施例2

采摘化橘紅嫩葉洗凈，太陽(yáng)曬干或置烘箱中60℃烘干至恒重，粉碎過(guò)80目篩備用。取葉粉末100 g，加蒸餾水200mL，濕潤(rùn)，充分?jǐn)噭颍质⒃谥睆?2 cm的培養(yǎng)皿中，敞開，置溫度25℃，濕度95%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96小時(shí)，得到種子菌。將煮熟馬鈴薯150g磨成漿，加入化橘紅果實(shí)粉末50g，搖勻，用水定容到1000mL，制成馬鈴薯種子菌培養(yǎng)基。取上述菌種3 g (含培養(yǎng)基)接種于500mL馬鈴薯液體種子菌培養(yǎng)基中，35℃、220 rpm 培養(yǎng)48 h，得種子菌培養(yǎng)液。

取化橘紅葉粉末1000g加3500mL水，攪勻，即成轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基，加入上述培養(yǎng)的種子菌液200mL，攪拌均勻，分裝在4個(gè)20*30cm型搪瓷托盤，鋪平，置于溫度35℃，濕度95%生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)60小時(shí)；轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基置100℃1小時(shí)終止發(fā)酵，后調(diào)節(jié)溫度65℃烘干，粉碎過(guò)80目篩，混合粉末裝入直徑為8cm玻璃層析柱中，用95%的乙醇作為洗脫液提取，收集2倍體積（mL/g）即2000mL洗脫液，洗脫液經(jīng)減壓濃縮回收乙醇，濃縮液轉(zhuǎn)移并用少量水洗合并約100mL到分液漏斗。每次加入等量體積石油醚萃取3次，去除上層液（含葉色素），得到下層含有柚皮素和芹菜素混合液。用乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)減壓濃縮得到柚皮素和芹菜素粗產(chǎn)品，所得浸膏用甲醇復(fù)溶，過(guò)濾，除去沉淀，濾液用水稀釋到200mL。

選取直徑為8cm玻璃層析柱，裝入預(yù)處理好的D101大孔吸附樹脂，將上述樣液注入層析柱中，上樣流速3 mL/min，上樣量200mL，等樣液完全滲透到樹脂后，首先用5 BV/h 蒸餾水預(yù)洗除糖，再用2 BV/h 2%KOH 水溶液洗去殘余色素，然后依次用4 BV/h 20% 乙醇、4 BV/h 40% 乙醇、4 BV/h 60% 、4 BV/h 70% 乙醇洗脫，每收集小管收集10 mL，紫外吸收光譜和高效液相跟蹤檢測(cè)，分別合并兩組份含量最高的前后共5支收集管洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，至無(wú)乙醇，分別得到柚皮素和芹菜素。轉(zhuǎn)化與分離純化結(jié)果見表2。

表2 化橘紅葉類黃酮物質(zhì)微生物轉(zhuǎn)化前后的含量及苷元的回收率

實(shí)施例3

采摘化橘紅嫩葉洗凈，太陽(yáng)曬干或置烘箱中60℃烘干至恒重，粉碎過(guò)80目篩備用。取葉粉末100 g加200mL，濕潤(rùn)，充分?jǐn)噭?，分盛在直?2 cm的培養(yǎng)皿中，敞開，置溫度35℃，濕度95%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)84h，得到種子菌。將煮熟馬鈴薯150g磨成漿，加入化橘紅果實(shí)粉末50g，搖勻，用水定容到1000mL，制成馬鈴薯種子菌培養(yǎng)基。取上述菌種3 g (含培養(yǎng)基)接種于500mL馬鈴薯液體種子菌培養(yǎng)基中，40℃、250 rpm 培養(yǎng)72 h，得種子菌培養(yǎng)液。

取化橘紅葉粉末1000g加4000mL水，攪勻，即成轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基，加入上述培養(yǎng)的種子菌液250mL，攪拌均勻，分裝在4個(gè)20*30cm型搪瓷托盤，鋪平，置于溫度30℃，濕度85%生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)96小時(shí)；發(fā)酵培養(yǎng)基置于110℃溫度下加熱0.5h以終止發(fā)酵，后調(diào)節(jié)溫度60℃烘干，粉碎過(guò)80目篩，混合粉末裝入直徑為8cm玻璃層析柱中，用95%的乙醇作為洗脫液提取，收集2倍體積（mL/g）即2000mL洗脫液，洗脫液經(jīng)減壓濃縮回收乙醇，濃縮液轉(zhuǎn)移并用少量水洗合并約100mL到分液漏斗。每次加入等量體積石油醚萃取3次，去除上層液（含葉色素），得到下層含有柚皮素和芹菜素混合液。用乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)減壓濃縮得到柚皮素和芹菜素粗產(chǎn)品，所得浸膏用甲醇復(fù)溶，過(guò)濾，除去沉淀，濾液用水稀釋到200mL。

選取直徑為8cm玻璃層析柱，裝入預(yù)處理好的大孔吸附樹脂D101，將上述樣液注入層析柱中，上樣流速3mL/min，上樣量200mL，等樣液完全滲透到樹脂后，首先用5 BV 蒸餾水預(yù)洗除糖，再用2BV 2%KOH 水溶液洗去殘余色素，然后依次用4BV 20% 乙醇、4BV 40% 乙醇、4BV 60% 、4BV 70% 乙醇洗脫，每收集小管收集10mL，紫外吸收光譜和高效液相跟蹤檢測(cè)，分別合并兩組份含量最高的前后共5支收集管洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，至無(wú)乙醇，分別得到柚皮素和芹菜素。轉(zhuǎn)化與分離純化結(jié)果見表3。

表3 化橘紅葉類黃酮物質(zhì)微生物轉(zhuǎn)化前后的含量及苷元的的純化回收率

對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，顯然本發(fā)明不限于上述示范性實(shí)施例的細(xì)節(jié)，而且在不背離本發(fā)明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實(shí)現(xiàn)本發(fā)明。因此，無(wú)論從哪一點(diǎn)來(lái)看，均應(yīng)將實(shí)施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求而不是上述說(shuō)明限定，因此旨在將落在權(quán)利要求的等同要件的含義和范圍內(nèi)的所有變化囊括在本發(fā)明內(nèi)。