本發(fā)明涉及核酸檢測(cè)領(lǐng)域，特別涉及一種核酸檢測(cè)的復(fù)合物及其制備方法與核酸檢測(cè)的方法。

背景技術(shù)：

眾所周知，核酸與病原基因和遺傳疾病、基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞增殖和凋亡以及癌癥的發(fā)生、發(fā)展存在著重要的聯(lián)系。生物的組織、細(xì)菌、病毒均具有獨(dú)特的核酸序列，這些特定序列的檢測(cè)在基因分析、疾病診斷、食品污染、法醫(yī)鑒定和環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域起著重要作用。研究新的核酸檢測(cè)技術(shù)對(duì)促進(jìn)生物功能研究、疾病診斷以及相關(guān)基因藥物開(kāi)發(fā)具有重大意義。

在過(guò)去的幾十年中，特定核酸序列的檢測(cè)方法具有用時(shí)長(zhǎng)、操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)費(fèi)力的技術(shù)缺陷。

伴隨著生物放大技術(shù)和納米技術(shù)的迅速發(fā)展，利用新穎的生物放大技術(shù)和特殊性質(zhì)的納米探針，構(gòu)建基于雙倍信號(hào)放大的超靈敏核酸傳感器是當(dāng)前的發(fā)展方向。但是由于核酸序列沒(méi)有可顯示的信號(hào)，核酸的檢測(cè)方法，總要對(duì)核酸進(jìn)行復(fù)雜的信號(hào)標(biāo)記，這使得檢測(cè)變得更為復(fù)雜。因此研發(fā)一種高靈敏的、無(wú)標(biāo)記的核酸檢測(cè)方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員亟待解決的技術(shù)問(wèn)題。

目前所知的納米粒子具有催化的特殊性質(zhì)，因此，能應(yīng)用于很多有機(jī)反應(yīng)。而納米粒子的催化活性完全依賴(lài)于其表面性質(zhì)，其表面微小的形態(tài)變化可以影響其催化行為，進(jìn)而影響催化產(chǎn)物的數(shù)量?；谏鲜鲈?，利用納米粒子的表面性質(zhì)和催化產(chǎn)物數(shù)量的對(duì)應(yīng)關(guān)系，可以作為新的設(shè)計(jì)思路研發(fā)一種高靈敏的、無(wú)標(biāo)記的核酸檢測(cè)產(chǎn)品。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，為了解決上述的技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明公開(kāi)了一種核酸檢測(cè)復(fù)合物以及制備方法與核酸檢測(cè)的方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了一種核酸檢測(cè)復(fù)合物，包括核酸、金納米粒子和氧化石墨烯；所述核酸負(fù)載在納米粒子修飾的氧化石墨烯上。

作為優(yōu)選，所述核酸為單鏈DNA或RNA。

本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，所述核酸檢測(cè)復(fù)合物中所述核酸的含量依賴(lài)于所述負(fù)載金納米粒子氧化石墨烯的含量，而所述納米粒子的含量依賴(lài)于所述氧化石墨烯的含量，以達(dá)到飽和負(fù)載為止。

本發(fā)明還提供了所述核酸檢測(cè)復(fù)合物的制備方法，金納米粒子與氧化石墨烯結(jié)合，得到金納米粒子負(fù)載的氧化石墨烯，然后與核酸分子結(jié)合得到核酸檢測(cè)復(fù)合物。

本發(fā)明還提供了一種核酸檢測(cè)的組合物，包括本發(fā)明上述的核酸檢測(cè)的復(fù)合物和3-(羥乙基哌嗪)-2-羥基丙磺酸(HEPPSO)。

本發(fā)明還提供了一種核酸檢測(cè)的方法，包括以下步驟：

步驟1，將待測(cè)樣品加入緩沖溶液中，得到待測(cè)溶液；

步驟2，將權(quán)利要求1所述核酸檢測(cè)的復(fù)合物溶液與3-羥乙基哌嗪-2-羥基丙磺酸溶液混合，然后與待測(cè)溶液混合，檢測(cè)其紫外可見(jiàn)吸收光譜；

其中所述核酸檢測(cè)的復(fù)合物中的核酸序列為與待測(cè)樣品中的核酸序列特異性結(jié)合的序列。

3-(羥乙基哌嗪)-2-羥基丙磺酸可以吸附于金納米粒子的表面，并被金催化得到具有紫外吸收(340nm)的催化產(chǎn)物-酸酐類(lèi)衍生物。但當(dāng)核酸序列(單鏈的核酸)吸附于金納米粒子表面時(shí)，由于核酸分子和金納米粒子的相互作用，阻止了金納米粒子表面和HEPPSO的作用，沒(méi)有催化產(chǎn)物產(chǎn)生。當(dāng)與待測(cè)溶液混合時(shí)，由于待測(cè)溶液中的核酸分子和金納米粒子表面核酸分子的相互作用發(fā)生特異性結(jié)合，形成互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合的雙鏈核酸，會(huì)導(dǎo)致金納米粒子表面的核酸分子脫離下來(lái)，使得HEPPSO和金納米粒子表面再發(fā)生相互作用，誘導(dǎo)催化產(chǎn)物的出現(xiàn)，其紫外吸收強(qiáng)度升高。根據(jù)待測(cè)溶液中的核酸分子的數(shù)量與催化產(chǎn)物吸收強(qiáng)度增加的對(duì)應(yīng)關(guān)系，可以定量檢測(cè)核酸分子。

此外，3-(羥乙基哌嗪)-2-羥基丙磺酸還可以判斷所述核酸檢測(cè)的復(fù)合物中的核酸分子和金納米粒子是否充分反應(yīng)，判斷該核酸檢測(cè)的復(fù)合物是否可用于核酸檢測(cè)。所述核酸檢測(cè)的復(fù)合物與HEPPSO反應(yīng)，所述復(fù)合物在340nm不出現(xiàn)吸收峰時(shí)，即反應(yīng)充分，可用于核酸檢測(cè)。

其中，所述3-羥乙基哌嗪-2-羥基丙磺酸溶液的制備方法為HEPPSO溶解于水中，氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH至7.4-7.5。

作為優(yōu)選，所述核酸檢測(cè)的復(fù)合物的工作濃度為0.5mg/mL-1mg/mL，所述3-(羥乙基哌嗪)-2-羥基丙磺酸的工作濃度為25mmol/L。

作為優(yōu)選，所述核酸檢測(cè)的方法中，所述待測(cè)樣品為體液或血清。

所述待測(cè)樣品中的核酸包括但不限于病毒核酸或細(xì)菌核酸，還可以為疾病的標(biāo)志物的核酸。如腫瘤標(biāo)志物的核酸。

進(jìn)一步，所述待測(cè)樣品中的核酸為單鏈DNA或RNA。

作為優(yōu)選，所述單鏈DNA或RNA的濃度為1.0×10^-11mol/L-2.5×10^-7mol/L。

本發(fā)明所述核酸檢測(cè)的方法中所述檢測(cè)波長(zhǎng)優(yōu)選為340nm。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的核酸檢測(cè)復(fù)合物及核酸檢測(cè)的組合物化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，同時(shí)在室溫條件下可長(zhǎng)時(shí)間保存，應(yīng)用方便。本發(fā)明提供的核酸檢測(cè)的方法無(wú)需對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理，操作簡(jiǎn)單、識(shí)別靈敏度高，廣泛適用于醫(yī)院臨床疾病和健康狀況診斷。

附圖說(shuō)明

為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹。

圖1示實(shí)施例2中核酸復(fù)合物中加入核酸后催化產(chǎn)物的紫外可見(jiàn)吸收光譜圖，吸收強(qiáng)度隨著分析物濃度的增加而增強(qiáng)；

圖2示實(shí)施例2中核酸復(fù)合物對(duì)核酸檢測(cè)的濃度范圍曲線圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明公開(kāi)了一種核酸復(fù)合物，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類(lèi)似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過(guò)較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。

本發(fā)明提供的一種核酸檢測(cè)的復(fù)合物及其制備方法與核酸檢測(cè)的方法，其中所用原料及試劑均可由市場(chǎng)購(gòu)得。

HEPPSO溶液的配制：將HEPPSO溶解在二次蒸餾水中，利用摩爾濃度為6mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH,得到濃度為100mmol/L，pH值為7.5的HEPPSO溶液

下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：

實(shí)施例1：核酸檢測(cè)的復(fù)合物的制備：

將濃度為6nmol/L Au納米粒子與濃度為0.5mg/mL的氧化石墨烯充分反應(yīng)，然后離心純化，最后得到負(fù)載有Au納米粒子的石墨烯復(fù)合物，最終其濃度調(diào)節(jié)為0.5mg/mL，再把濃度為1μmol/L與待測(cè)核酸反向互補(bǔ)的核酸序列(序列為5’-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3’，SEQ ID NO.1)負(fù)載到所述納米粒子氧化石墨烯的復(fù)合結(jié)構(gòu)上，離心2次去除多余核酸分子，得到核酸檢測(cè)的復(fù)合物。

將制得的核酸檢測(cè)的復(fù)合物與濃度為25mmol/L的HEPPSO反應(yīng)，若所述復(fù)合物在340nm不出現(xiàn)吸收峰，則該復(fù)合物中的金納米粒子和核酸分子充分反應(yīng)，可用于核酸檢測(cè)。

實(shí)施例2：檢測(cè)核酸分子：

將待測(cè)核酸(序列為5’-AACTCTGCTCGACGGATT-3，SEQ ID NO.2)溶于緩沖溶液中，配成0.01mol/L的核酸儲(chǔ)備溶液，用緩沖溶液將所述待測(cè)核酸儲(chǔ)備液分別稀釋為1.0×10^-11，5.0×10^-11，1.0×10^-10，5.0×10^-10，1.0×10^-9，5.0×10^-9，1.0×10^-8，5.0×10^-8，1.0×10^-7，5.0×10^-7，1.0×10^-6，2.5×10^-6，1.0×10^-5，2.0×10^-5，3.0×10^-5和1.0×10^-4mol/L。取17份實(shí)施例1制備的核酸復(fù)合物，編號(hào)為1-17，每份180μL，向第2-17份核酸復(fù)合物中分別加入20μL上述各個(gè)濃度的核酸儲(chǔ)備溶液，第1份核酸復(fù)合物中添加20μL緩沖溶液，混勻放置1小時(shí)后，將各溶液在6000rmp下離心15分鐘，取上清液，測(cè)定各上清液的吸收光譜，結(jié)果參見(jiàn)圖1。圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的試劑混合液中加入核酸以后催化產(chǎn)物的紫外可見(jiàn)吸收光譜圖。

參見(jiàn)圖1，圖1中的曲線由下到上分別為空白的上清液、含1.0×10^-12mol/L、5.0×10^-12mol/L、1.0×10^-11mol/L、5.0×10^-11mol/L、1.0×10^-10mol/L、5.0×10^-10mol/L、1.0×10^-9mol/L、5.0×10^-9mol/L、1.0×10^-8mol/L、5.0×10^-8mol/L、1.0×10^-7mol/L、2.5×10^-7mol/L、1.0×10^-6mol/L、2.0×10^-6mol/L、3.0×10^-6mol/L和1.0×10^-5mol/L待測(cè)核酸的核酸復(fù)合物的上清液的紫外可見(jiàn)吸收光譜圖。由圖1可知，吸收強(qiáng)度隨著分析物濃度的增加而增強(qiáng)。當(dāng)核酸濃度達(dá)到5.0×10^-12mol/L時(shí)，催化產(chǎn)物吸收光譜在340nm開(kāi)始出現(xiàn)；隨著核酸濃度的增加，催化產(chǎn)物吸收光譜的增加程度更加明顯；當(dāng)濃度達(dá)到1.0×10^-5mol/L時(shí)，吸收光譜最強(qiáng)。因此，本發(fā)明提供的核酸復(fù)合物檢測(cè)核酸的靈敏度可達(dá)5.0×10^-12mol/L，靈敏度較高。

參見(jiàn)圖2可知，從1.0×10^-11mol/L-2.5×10^-7mol/L可以很好的線性擬合，因此本發(fā)明提供的核酸復(fù)合物檢出核酸的濃度線性范圍為1.0×10^-11mol/L-2.5×10^-7mol/L。

綜上所述，本發(fā)明解決了現(xiàn)有技術(shù)中檢測(cè)特定核酸序列的費(fèi)時(shí)費(fèi)力的技術(shù)問(wèn)題。本發(fā)明提供的檢測(cè)方法無(wú)需對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理，操作簡(jiǎn)單、識(shí)別靈敏度高。同時(shí)，本發(fā)明提供的核酸檢測(cè)復(fù)合物化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，在室溫條件下可長(zhǎng)時(shí)間保存，應(yīng)用方便，可用于醫(yī)院臨床疾病和健康狀況診斷。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春光學(xué)精密機(jī)械與物理研究所

<120> 一種核酸檢測(cè)的復(fù)合物及其制備方法與核酸檢測(cè)的方法

<130> MP1621579

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aatccgtcga gcagagtt 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

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