本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種從土壤中分離長(zhǎng)喙殼菌的方法。

背景技術(shù)：

長(zhǎng)喙殼菌(Ceratocystis spp.)是一種對(duì)農(nóng)作物、經(jīng)濟(jì)林木具有嚴(yán)重危害的土壤習(xí)居菌，其寄主廣泛，可危害14個(gè)屬30余種木本及草本植物。在我國(guó)，長(zhǎng)喙殼菌主要危害甘薯、石榴、芋頭、枇杷、桉樹(shù)、三角椰和天南星等植物，近年來(lái)其危害的發(fā)生有蔓延加劇之勢(shì)。該菌危害塊莖類(lèi)作物，主要引起腐爛等癥狀；危害木本植物，主要引起潰瘍、萎蔫等癥狀，嚴(yán)重時(shí)造成整株植物枯萎死亡。我國(guó)疆土遼闊，作物種類(lèi)豐富，土壤類(lèi)型多樣，農(nóng)田和自然生態(tài)土壤中潛藏著長(zhǎng)喙殼屬真菌，在土壤微生物菌群和植物長(zhǎng)期共同進(jìn)化過(guò)程中，該菌存在引發(fā)病害并給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)重大損失的風(fēng)險(xiǎn)。

土壤中病原菌的分離作為植物病理研究以及病害防控研究中最基本的步驟，目前，土壤中病原菌的分離方法大多采用稀釋平板法。該方法將適量土壤樣品置于蒸餾水中搖培2h，靜置30min后取其上清液作為土壤浸提液，通過(guò)系列稀釋的方法設(shè)置3-5個(gè)稀釋濃度，隨后分別取各濃度下的稀釋液200μL涂布于培養(yǎng)基后進(jìn)行觀察培養(yǎng)及靶標(biāo)菌的分離。該方法的不足在于：1)整個(gè)分菌過(guò)程均需在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行，且要求嚴(yán)格的無(wú)菌條件，所用實(shí)驗(yàn)器材及儀器設(shè)備較多，這為野外考察、田間調(diào)查過(guò)程中病樣直接分離獲得靶標(biāo)菌種帶來(lái)不便；2)用該方法分離土壤中的靶標(biāo)菌時(shí)工作量較大，不同的土壤樣品在分離靶標(biāo)菌時(shí)土壤浸提液的稀釋倍數(shù)較難把控，對(duì)長(zhǎng)喙殼菌等一些生長(zhǎng)較慢的靶標(biāo)菌的分離效率極低。

目前，研究人員在分離長(zhǎng)喙殼菌侵染的植物組織上的靶標(biāo)菌時(shí)，主要采用PDA平板分離法或胡蘿卜誘導(dǎo)分離法，而鮮有從土壤樣品中分離長(zhǎng)喙殼菌的報(bào)道，至今尚無(wú)研究闡述從土壤樣品中利用植物材料富集和分離長(zhǎng)喙殼菌的方法。因此，為提高病原研究效率及病害的前期防控，開(kāi)發(fā)一種簡(jiǎn)單、有效、易操作的從土壤生境中分離長(zhǎng)喙殼菌的方法是必要的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提出一種從土壤中分離長(zhǎng)喙殼菌的方法，具體技術(shù)方案如下：

一種從土壤中分離長(zhǎng)喙殼菌的方法，具體包括如下步驟：

1)胡蘿卜用自來(lái)水清洗干凈，去表皮后置于乙醇中消毒，用餐巾紙將其表面的乙醇吸干，用解剖刀切成厚度均勻的薄片，之后用打孔器在薄片中央制取相等直徑的碟片，備用；

2)將步驟1)中的胡蘿卜碟片置于培養(yǎng)皿中，兩兩重疊，土壤樣品置于胡蘿卜碟片之間，25～28℃培養(yǎng)3～10天，富集長(zhǎng)喙殼菌；

3)用接種環(huán)挑取步驟2)中富集的長(zhǎng)喙殼菌的子囊殼喙頂端的單個(gè)子囊孢子團(tuán)，在MYEA培養(yǎng)基上劃線，25～28℃培養(yǎng)3～5天，挑取單個(gè)菌落在新的MYEA培養(yǎng)基上劃線，即得長(zhǎng)喙殼菌株的單菌落；

4)將步驟3)獲得的靶標(biāo)菌的純菌落在MYEA培養(yǎng)基上培養(yǎng)2周后，在光學(xué)顯微鏡下觀察其菌絲、子囊殼、分生孢子、厚垣孢子及子囊孢子形態(tài)；另外，刮取菌落表面的菌絲及孢子的混合物，提取總DNA，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并進(jìn)行序列比對(duì)；結(jié)合序列鑒定和形態(tài)觀察結(jié)果確定分離到的標(biāo)靶菌為長(zhǎng)喙殼屬的真菌。

步驟1)中乙醇的體積濃度為70～75％，消毒時(shí)間為1～2min，薄片的厚度為3～5mm，碟片的直徑為2.5cm。

步驟2)中培養(yǎng)皿的中央放置一團(tuán)無(wú)菌水浸濕的棉花。

步驟2)中土壤樣品的質(zhì)量為1g。

步驟3)和步驟4)中MYEA培養(yǎng)基的組成為：麥芽提取物20g/L、酵母2g/L、瓊脂16g/L和100mg/L氯霉素。

步驟4)中PCR擴(kuò)增的引物為：

上游引物ITS1F：5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’和

下游引物ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。

步驟4)中靶標(biāo)菌的形態(tài)特征為：菌株能產(chǎn)生芳香性活性揮發(fā)物，子囊殼直立生長(zhǎng)于培養(yǎng)基上，喙頂端著生子囊孢子團(tuán)，粘稠、黃色至金黃色，形狀不規(guī)則。子囊殼棕色至黑色，基部球形，喙修長(zhǎng)，喙端孔口菌絲無(wú)色透明，呈分散狀或聚合狀。子囊孢子為典型的帽盔狀，分生孢子棒形，粉孢子厚壁、表面光滑、單生或串生、棕色至淺棕色。

步驟4)中擴(kuò)增序列如SEQ ID No.1所示

所述解剖刀、打孔器及接種環(huán)用95％的乙醇消毒，并在酒精燈的外焰上反復(fù)灼燒2～3遍。

本發(fā)明的有益效果為：

(1)菌株分離效率高：本發(fā)明從土壤中分離長(zhǎng)喙殼菌的方法在程度上規(guī)避了稀釋平板法不同土壤樣品的靶標(biāo)菌分離時(shí)土壤浸提液的稀釋倍數(shù)較難把控的難題，減少了工作量；胡蘿卜作為有效的分離長(zhǎng)喙殼菌的植物材料，能顯著提高長(zhǎng)喙殼菌等一些生長(zhǎng)較慢的靶標(biāo)菌的分離效率；本發(fā)明結(jié)合長(zhǎng)喙殼菌的形態(tài)特征，采用挑取單個(gè)子囊孢子團(tuán)劃線的方法進(jìn)行靶標(biāo)菌的分離純化，提高了分離純化效率，節(jié)省時(shí)間。

(2)儀器設(shè)備簡(jiǎn)單：部分操作無(wú)需嚴(yán)格的無(wú)菌條件，需無(wú)菌操作的步驟在超凈臺(tái)內(nèi)即可完成。

(3)培養(yǎng)過(guò)程簡(jiǎn)單：分離過(guò)程僅需一種植物材料和一種培養(yǎng)基。

(4)成本低：菌株分離全過(guò)程所用到的儀器簡(jiǎn)單，誘導(dǎo)富集靶標(biāo)菌所用的植物材料價(jià)格便宜，易購(gòu)買(mǎi)。

(5)適用范圍廣：本發(fā)明因部分操作無(wú)需嚴(yán)格的無(wú)菌條件，植物材料胡蘿卜可預(yù)先在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)備好，因此適合野外考察、田間調(diào)查過(guò)程中的菌株收集，大大提高了工作效率；同時(shí)可減少因土壤樣品的長(zhǎng)時(shí)間保存引起的微生物大量滋生而給靶標(biāo)菌分離帶來(lái)的干擾，有效的提高了分離效率。

(6)安全環(huán)保：分離過(guò)程中植物材料胡蘿卜選用乙醇消毒，避免了常用的烈性消毒劑如次氯酸鈉、升汞等，整個(gè)操作過(guò)程更加安全、環(huán)保。

附圖說(shuō)明

圖1為胡蘿卜誘導(dǎo)富集土壤樣品中長(zhǎng)喙殼菌的方法示意圖，其中A為胡蘿卜碟片，B為棉花團(tuán)。

圖2為胡蘿卜碟片富集的長(zhǎng)喙殼菌株示意圖，其中A為胡蘿卜碟片，B為長(zhǎng)喙殼菌株子囊殼修長(zhǎng)的喙，C為喙頂端子囊孢子團(tuán)。

圖3為長(zhǎng)喙殼菌株子囊殼喙頂端的單個(gè)子囊孢子團(tuán)的分離純化示意圖。

圖4為長(zhǎng)喙殼菌單菌落的形態(tài)特征圖，其中A為菌落形態(tài)，B為子囊殼形態(tài)。

圖5為長(zhǎng)喙殼菌株子囊殼和子囊孢子團(tuán)形態(tài)特征圖。

圖6為長(zhǎng)喙殼菌株顯微結(jié)構(gòu)特征圖，其中A為分生孢子，B為子囊殼，C粉孢子，D為菌絲，E喙端孔口菌絲形態(tài)。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提出了一種從土壤中分離長(zhǎng)喙殼菌的方法，下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步介紹。

下述實(shí)施例中所用實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法；所用的材料、試劑等如無(wú)特殊說(shuō)明，均可通過(guò)商業(yè)途徑購(gòu)買(mǎi)到。

實(shí)施例1：長(zhǎng)喙殼菌的分離純化

(1)新鮮且健康的胡蘿卜用自來(lái)水沖洗干凈，去其表皮后置于體積濃度為75％的乙醇中消毒1～2min，用潔凈的餐巾紙吸干其表面乙醇，之后切成厚度為3～5mm且均勻的薄片，再用直徑為2.5cm的打孔器在胡蘿卜薄片中央取相等直徑的碟片，備用；

(2)將步驟(1)中的胡蘿卜碟片置于直徑為9cm的培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿中放置12片胡蘿卜碟片，兩兩重疊，同時(shí)用電子天平秤取從云南蒙自采集的土壤樣品，1g/份；將稱(chēng)好的土壤樣品置于兩片重疊的胡蘿卜碟片之間，并在培養(yǎng)皿的中央放置一團(tuán)無(wú)菌水浸濕的棉花保濕(如圖1)；置于26℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～10天，觀察胡蘿卜碟片上長(zhǎng)喙殼菌的富集情況(如圖2)；從胡蘿卜碟片誘導(dǎo)分菌的第3天起，每隔一天觀察胡蘿卜碟片上富集到的真菌中是否有長(zhǎng)喙殼菌的子囊殼形成，此外注意觀察培養(yǎng)皿內(nèi)水氣的產(chǎn)生量，若培養(yǎng)皿內(nèi)有可流動(dòng)的水滴，應(yīng)在超凈工作臺(tái)內(nèi)將其晾干；

(3)用接種環(huán)挑取步驟(2)中胡蘿卜碟片上富集到的長(zhǎng)喙殼菌的子囊殼喙頂端的單個(gè)子囊孢子團(tuán)，在MYEA培養(yǎng)基上以劃線的方法分離、純化，于26℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天(如圖3)后挑取單個(gè)菌落在新的MYEA培養(yǎng)基上劃線，純化培養(yǎng)，如此重復(fù)1-2次，即得長(zhǎng)喙殼菌的純菌落(如圖4)。

MYEA培養(yǎng)基的配置方法：1L蒸餾水中加入麥芽提取物20g、酵母2g、瓊脂16g、氯霉素0.1g，加熱至各溶質(zhì)溶化后用蒸餾水定容至1L，高溫121℃，滅菌20min，倒入9cm×1.5cm平皿中，每皿20ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)基凝固后備用。

實(shí)施例2：分離物的鑒定

(1)序列鑒定

將步驟(3)獲得的靶標(biāo)菌的純菌落在MYEA培養(yǎng)基上培養(yǎng)2周后，用解剖刀(解剖刀手柄型號(hào)為4號(hào)，刀片型號(hào)為24號(hào))刮取200mg的菌落表面的菌絲及孢子的混合物，用CTAB法提取總DNA，提取的總DNA采用下述引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增：

上游引物ITS1F：5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’和

下游引物ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’，

擴(kuò)增序列如SEQ ID No.1所示。PCR產(chǎn)物用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送博邁德公司測(cè)序，并將測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中比對(duì)分析以進(jìn)一步確定分離物。

PCR反應(yīng)體系：

PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5min；隨后94℃變性45s，56℃退火40s，72℃延伸1min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min，置于4℃保持。

(2)形態(tài)觀察

將步驟(3)獲得的靶標(biāo)菌的純菌落在MYEA培養(yǎng)基上培養(yǎng)2周后，在光學(xué)顯微鏡下觀察其菌絲、子囊殼、分生孢子、厚垣孢子及子囊孢子形態(tài)，如圖5和6。靶標(biāo)菌能產(chǎn)生芳香氣味，子囊殼直立生長(zhǎng)于培養(yǎng)基上，喙頂端著生子囊孢子團(tuán)，粘稠、黃色，形狀不規(guī)則；子囊殼黑色，基部球形，喙修長(zhǎng)，喙端孔口菌絲無(wú)色透明，呈分散狀；子囊孢子為典型的帽盔狀，分生孢子棒形，粉孢子厚壁、表面光滑、單生或串生、棕色至淺棕色。結(jié)合《真菌鑒定手冊(cè)》分類(lèi)方法進(jìn)行鑒定。

結(jié)合上述序列鑒定和形態(tài)觀察可以確定分離到的標(biāo)靶菌為長(zhǎng)喙殼屬的真菌。

SEQUENCE LISTING

<110> 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120> 一種從土壤中分離長(zhǎng)喙殼菌的方法

<130> 2016

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 667

<212> DNA

<213> 擴(kuò)增序列

<400> 1

tttcctccgc cttattgata tgcttaagtt cagcgggtat tcctacctga tccgaggtca 60

accttgtgaa aagttcaaca aaagttgagc gggtttagcg gcgtgttaca caagaacttc 120

aaagtgtaaa aattagaaat tttatactac acaggggagt tggcaagtat aacagccgat 180

acatttcggc ggcctgttca ggggagaaca ggacctccaa cgccaagaac aaaagagtct 240

tgagtggtga aatgacgctc ggacaggcat gcctggcaga atactgccag gcgcaatgtg 300

cgttcaaaga ttcgatgatt cactgaattc tgcaattcac attacttatc gcatttcgct 360

gcgttcttca tcgatgctag agccaagaga tccgttgttg aaagttttaa ctttttttat 420

agttatgcca ctcagcaatg aaaaatctag aaaataataa aaagagttta cagtggcgaa 480

gactaatact gctggcagcg gtgccctctc ttcagaaggg ccctaccacc aaaacagcat 540

tcatctcact acaagatagg gtacgttcac acatggttta tagagtacaa aaactcagta 600

atgatccctc cgctggttca ccaacggaga ccttgttacg acttttactt cctctaaatg 660

accaaga 667