本發(fā)明涉及青貯領(lǐng)域，尤其涉及一種玉米秸稈青貯用復(fù)合菌劑。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，隨著產(chǎn)業(yè)化沼氣工程在我國(guó)的發(fā)展，對(duì)厭氧發(fā)酵原料的需求量逐漸增加。我國(guó)每年有大量的未利用的作物秸稈。作物秸稈是一種良好的厭氧發(fā)酵原料，將作物秸稈經(jīng)微生物厭氧發(fā)酵生產(chǎn)沼氣，是重要的生物質(zhì)能源轉(zhuǎn)化技術(shù)。由于秸稈的生產(chǎn)具有季節(jié)性，而產(chǎn)業(yè)沼氣工程的運(yùn)行需要原料的穩(wěn)定持續(xù)供應(yīng)，所以原料的保存非常重要。
作物秸稈的保存主要有風(fēng)干和青貯兩種方式。風(fēng)干過(guò)程會(huì)造成可溶性物質(zhì)消耗、纖維化程度增高、木質(zhì)素含量升高、干物質(zhì)損失嚴(yán)重等，從而降低秸稈的可降解性和產(chǎn)氣潛力。
和風(fēng)干相比，青貯是更好的保存作物秸稈的方式，能夠有效保存青綠秸稈的營(yíng)養(yǎng)成分，抑制纖維化過(guò)程；并且青貯保存造成的干物質(zhì)損失遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于風(fēng)干保存。但是在不良的保存條件下或者在出料階段，青貯料接觸氧氣后會(huì)發(fā)生二次發(fā)酵，造成干物質(zhì)損失。
在青貯料制作過(guò)程中通常需要使用添加劑來(lái)提高成功率。乳酸菌添加劑是一種主要的發(fā)酵促進(jìn)劑。使用乳酸菌添加劑的目的是保證乳酸菌在發(fā)酵中占優(yōu)勢(shì)，抑制不良微生物的活動(dòng)，減少營(yíng)養(yǎng)損失，獲得優(yōu)質(zhì)的青貯料。
市面上有多種乳酸菌制劑，大多數(shù)為應(yīng)用于青貯飼料的提高乳酸產(chǎn)量的同型發(fā)酵乳酸菌制劑，而異型發(fā)酵乳酸菌制劑較少。同型發(fā)酵乳酸菌制劑能夠提高乳酸產(chǎn)量，降低乙酸產(chǎn)量，提高可溶性糖剩余量，而乳酸和可溶性糖都是酵母菌可以利用的底物，所以同型發(fā)酵往往會(huì)降低有氧穩(wěn)定性，使青貯料易于腐敗。異型發(fā)酵乳酸菌在青貯過(guò)程中能夠提高乙酸產(chǎn)量，乙酸能夠抑制酵母霉菌等真菌生長(zhǎng)，因而能提高青貯料的有氧穩(wěn)定性，防止二次發(fā)酵的發(fā)生，減少出料階段干物質(zhì)損失，因而異型乳酸菌劑的開(kāi)發(fā)應(yīng)引起足夠的重視。
另外，市面上的乳酸菌通常為單純化的單一菌劑或者幾種乳酸菌的簡(jiǎn)單混合菌劑。純化的單一菌劑存在純化過(guò)程中產(chǎn)酸功能降低，對(duì)生長(zhǎng)條件的適應(yīng)范圍窄，難以在青貯中取得優(yōu)勢(shì)地位，以及接種效果不理想的缺點(diǎn)。而簡(jiǎn)單混合的菌劑，由于組成簡(jiǎn)單，并且組成菌之間的協(xié)作關(guān)系或者拮抗關(guān)系尚有待證實(shí)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種玉米秸稈青貯用復(fù)合菌劑，其活性菌包括：副布氏乳桿菌Lactobacillus parabuchneri、短乳桿菌Lactobacillus brevis和植物乳桿菌Lactobacillus plantarum，副干酪乳桿菌Lactobacillus paracasei，戊糖乳桿菌Lactobacillus pentosus和粘膜乳桿菌Lactobacillus mucosae。
本發(fā)明所述的復(fù)合菌劑，其活性菌副布氏乳桿菌Lactobacillus parabuchneri，短乳桿菌Lactobacillus brevis，植物乳桿菌Lactobacillus plantarum，副干酪乳桿菌Lactobacillus paracasei，戊糖乳桿菌Lactobacillus pentosus和粘膜乳桿菌Lactobacillus mucosae等各乳酸菌之間具有高度協(xié)同關(guān)系和高效穩(wěn)定性，接種后在玉米秸稈中能夠成為優(yōu)勢(shì)菌群，能夠提高乳酸和乙酸的產(chǎn)量，提高乙酸/乳酸的比例，降低玉米青貯料的pH值，能夠提高有氧穩(wěn)定性抑制玉米青貯料二次發(fā)酵，進(jìn)而有效減少干物質(zhì)的損失。
本發(fā)明所述復(fù)合菌劑，以活菌數(shù)占總活菌數(shù)的百分比計(jì)，所述副布氏乳桿菌Lactobacillus parabuchneri、植物乳桿菌Lactobacillus plantarum、短乳桿菌Lactobacillus brevis、副干酪乳桿菌Lactobacillus paracasei、戊糖乳桿菌Lactobacillus pentosus和粘膜乳桿菌Lactobacillus mucosae分別為：28％～35％、28％～35％、20％～25％、5％～8％、4％～6％和1％～2.5％。
優(yōu)選的，以活菌數(shù)占總活菌數(shù)的百分比計(jì)，所述副布氏乳桿菌Lactobacillus parabuchneri、植物乳桿菌Lactobacillus plantarum、短乳桿菌Lactobacillus brevis、副干酪乳桿菌Lactobacillus paracasei、戊糖乳桿菌Lactobacillus pentosus和粘膜乳桿菌Lactobacillus mucosae分別為：31.7％、31.7％和23.3％、6.7％、5.0％、1.6％。
本發(fā)明所述復(fù)合菌劑，所述副布氏乳桿菌Lactobacillus parabuchneri、植物乳桿菌Lactobacillus plantarum、短乳桿菌Lactobacillus brevis、副干酪乳桿菌Lactobacillus paracasei、戊糖乳桿菌Lactobacillus pentosus和粘膜乳桿菌Lactobacillus mucosae的活菌數(shù)之比為28～35：28～35：20～25：5～8：4～6：1～2.5，優(yōu)選為31.7：31.7：23.3：5.7：5：1.6。
優(yōu)選的，所述副布氏乳桿菌Lactobacillus parabuchneri具體可為副布氏乳桿菌Lactobacillus parabuchneri JCM 12493T；
所述短乳桿菌Lactobacillus brevis具體可為短乳桿菌Lactobacillus brevis JCM 1170；
所述植物乳桿菌Lactobacillus plantarum具體可為植物乳桿菌Lactobacillus plantarum JCM 1149T；
所述副干酪乳桿菌Lactobacillus paracasei具體可為副干酪乳桿菌Lactobacillus paracasei CGMCC No.1.3112；
所述戊糖乳桿菌Lactobacillus pentosus具體可為戊糖乳桿菌Lactobacillus pentosus JCM 1158T；
所述粘膜乳桿菌Lactobacillus mucosae具體可為粘膜乳桿菌Lactobacillus mucosae CGMCC No.6733。
本發(fā)明所述復(fù)合菌劑，其活性菌也可僅有上述副布氏乳桿菌Lactobacillus parabuchneri、短乳桿菌Lactobacillus brevis、植物乳桿菌Lactobacillus plantarum、副干酪乳桿菌Lactobacillus paracasei、戊糖乳桿菌Lactobacillus pentosus和粘膜乳桿菌Lactobacillus mucosae組成。
本發(fā)明所述復(fù)合菌劑為液體制劑。
所述液體制劑包括甘油和EDTA；優(yōu)選的，所述活性成分、甘油和EDTA的配比為1×1011CFU:1-5g甘油：1-2g EDTA，更優(yōu)選為1×1011CFU:4g甘油：1g EDTA。液體制劑可使活菌數(shù)量和活性長(zhǎng)期保持穩(wěn)定，運(yùn)輸和使用方便。
本發(fā)明還提供了所述復(fù)合菌劑在制備玉米青貯秸稈中的應(yīng)用。
本發(fā)明的上述技術(shù)方案具有以下有益效果：本發(fā)明的復(fù)合菌劑，具有組成穩(wěn)定，適應(yīng)性強(qiáng)，生長(zhǎng)迅速，成本低廉的優(yōu)點(diǎn)。其接種發(fā)酵效果非常明顯，可以有效的提高玉米秸稈青貯料的發(fā)酵品質(zhì)和乙酸產(chǎn)量，提高其有氧穩(wěn)定性，抑制其二次發(fā)酵，減少干物質(zhì)損失，在青貯領(lǐng)域具有廣闊的市場(chǎng)發(fā)展前景和應(yīng)用推廣價(jià)值。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)描述。以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不能用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1、玉米秸稈青貯用復(fù)合菌劑中活性菌的篩選
制備改良的SL培養(yǎng)液：將10g胰蛋白胨、10g酵母粉、10g葡萄糖、10g蔗糖、6g磷酸二氫鉀、2g檸檬酸銨、15g無(wú)水乙酸鈉、1ml吐溫80、0.58g七水合硫酸鎂、0.03g七水合硫酸亞鐵、0.11g四水合硫酸錳以及100ml煮玉米水進(jìn)行混合，加水至1000ml，用乙酸調(diào)節(jié)pH到5.3左右，即得。所述煮玉米水的制作：取4個(gè)帶皮的鮮玉米，約1.5kg重，加2.5L去離子水，煮至約800ml即得。
以發(fā)酵良好的白菜泡菜為篩選菌群來(lái)源。取45mL所述改良的SL培養(yǎng)液裝入50ml藍(lán)蓋瓶，加入5g泡菜，30℃條件下靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)72h后，按10％(體積分?jǐn)?shù)比)的接種量轉(zhuǎn)接培養(yǎng)物連續(xù)繼代培養(yǎng)，保留pH下降迅速、產(chǎn)乙酸量較多且對(duì)外界環(huán)境變化相對(duì)穩(wěn)定的培養(yǎng)物，淘汰與之相反的培養(yǎng)物，直到獲得性質(zhì)和菌種組成穩(wěn)定的乳酸菌復(fù)合系。
通過(guò)平板分離技術(shù)和克隆文庫(kù)技術(shù)對(duì)所述乳酸菌復(fù)合系進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其組成菌主要為副布氏乳桿菌Lactobacillus parabuchneri、短乳桿菌Lactobacillus brevis、植物乳桿菌Lactobacillus plantarum，其活菌數(shù)占總活菌數(shù)的比例分別為31.7％、31.7％和23.3％，另外還有少量的副干酪乳桿菌Lactobacillus paracasei、戊糖乳桿菌Lactobacillus pentosus和粘膜乳桿菌Lactobacillus mucosae，其活菌數(shù)占總活菌數(shù)的比例分別為6.7％、5％和1.6％。
實(shí)施例2、玉米秸稈青貯用復(fù)合菌劑的制備
本實(shí)施例中所用的菌種均為本領(lǐng)域常規(guī)的菌種。
將副布氏乳桿菌Lactobacillus parabuchneri、短乳桿菌Lactobacillus brevis、植物乳桿菌Lactobacillus plantaru、副干酪乳桿菌Lactobacillus paracasei、戊糖乳桿菌Lactobacillus pentosus和粘膜乳桿菌Lactobacillus mucosae分別接種到MRS培養(yǎng)基中，30℃靜置培養(yǎng)48h，將31.7ml上述副布氏乳桿菌的發(fā)酵液、23.3ml上述短乳桿菌的發(fā)酵液、31.7ml上述植物乳桿菌的發(fā)酵液混合6.7ml上述副干酪乳桿菌，5ml上述戊糖乳桿菌，1.6ml上述粘膜乳桿菌，使得所述混合發(fā)酵液中副布氏乳桿菌、短乳桿菌、植物乳桿菌、副干酪乳桿菌、戊糖乳桿菌和粘膜乳桿菌的活菌數(shù)量百分比分別為31.7％:31.7％:23.3％:6.7％:5％:1.6％，且使該混合液發(fā)酵液中總的活菌數(shù)為108CFU/ml。
將上述混合發(fā)酵液、甘油和EDTA按照1×103ml：4g：1g的配比混合，得到玉米秸稈青貯用復(fù)合菌劑的液體制劑。
實(shí)施例3、玉米秸稈青貯用復(fù)合菌劑的制備
本實(shí)施例中，副布氏乳桿菌Lactobacillus parabuchneri JCM 12493T、短乳桿菌Lactobacillus brevis JCM 1170、植物乳桿菌Lactobacillus plantarum JCM 1149T和戊糖乳桿菌Lactobacillus pentosus JCM 1158T均保藏于日本微生物保存中心，副干酪乳桿菌Lactobacillus paracasei CGMCC No.1.3112和粘膜乳桿菌Lactobacillus mucosae CGMCC No.6733均保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。
將副布氏乳桿菌Lactobacillus parabuchneri JCM 12493T、短乳桿菌Lactobacillus brevis JCM 1170、植物乳桿菌Lactobacillus plantaru JCM 1149T、副干酪乳桿菌Lactobacillus paracasei CGMCC No.1.3112、戊糖乳桿菌Lactobacillus pentosus JCM 1158T和粘膜乳桿菌Lactobacillus mucosae CGMCC No.6733分別接種到MRS培養(yǎng)基中，30℃靜置培養(yǎng)48h，將35ml上述副布氏乳桿菌的發(fā)酵液、20ml上述短乳桿菌的發(fā)酵液、30ml上述植物乳桿菌的發(fā)酵液混合6.7ml上述副干酪乳桿菌，5ml上述戊糖乳桿菌，2ml上述粘膜乳桿菌，使得所述混合發(fā)酵液中副布氏乳桿菌、短乳桿菌、植物乳桿菌、副干酪乳桿菌、戊糖乳桿菌和粘膜乳桿菌的活菌數(shù)量百分比分別為31％:35％:20％:6％:6％:2％，且使該混合液發(fā)酵液中總的活菌數(shù)為108CFU/ml。
將上述混合發(fā)酵液、甘油和EDTA按照1×103ml：5g：2g的配比混合，得到玉米秸稈青貯用復(fù)合菌劑的液體制劑。
試驗(yàn)例1、玉米秸稈青貯用復(fù)合菌劑的接種發(fā)酵效果
將剛收獲的新鮮玉米秸稈粉碎成粒徑為1～2cm的秸稈顆粒，將實(shí)施例2制備的液體乳酸菌復(fù)合菌劑按照24ml:1000g所述玉米秸稈顆粒均勻混合，進(jìn)行密封青貯。進(jìn)行密封青貯。室溫發(fā)酵50天后，所得青貯料的乳酸產(chǎn)量分別為22.60g/kg，乙酸產(chǎn)量14.11g/kg，pH值為3.7。
另作對(duì)照組1，即：取所述玉米秸稈顆粒進(jìn)行密封青貯，不接種所述乳酸菌復(fù)合菌劑，室溫發(fā)酵50天后，所得青貯料的乳酸和乙酸產(chǎn)量分別為18.53g/kg和4.33g/kg，pH值為4.0。
結(jié)果表明該乳酸菌復(fù)合系能夠提高乳酸和乙酸產(chǎn)量，改善發(fā)酵效果。
試驗(yàn)例2、有氧穩(wěn)定性的測(cè)定
上述試驗(yàn)例1的青貯結(jié)束后，立即取1000g青貯料松散地置于聚乙烯泡沫盒中，不壓實(shí)、不密封，蓋上蓋子以減少水分蒸發(fā)。置于20℃恒溫培養(yǎng)箱中，用YOKOGAWA DX1006無(wú)紙記錄儀記錄溫度變化。將各熱電偶探頭置于秸稈中心位置，設(shè)定儀器每30s記錄一次。青貯料在空氣中暴露后其核心溫度高出外界溫度2℃所需要的小時(shí)數(shù)即為有氧穩(wěn)定性。
觀察發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)例1的未接種處理(即對(duì)照組1)的有氧穩(wěn)定性為185h，接種處理的有氧穩(wěn)定性為1682h，證明該乳酸菌復(fù)合菌劑大大提高了青貯玉米秸稈的有氧穩(wěn)定性。青貯料在有氧暴露5天后，接種所述乳酸菌復(fù)合菌劑的青貯料相比于對(duì)照組1，其干物質(zhì)損失降低10.9％；有氧暴露12天后，接種所述乳酸菌復(fù)合菌劑的青貯料相比于對(duì)照組1，其干物質(zhì)損失降低了31％；可見(jiàn)接種乳酸菌復(fù)合菌劑有效提高了有氧穩(wěn)定性并降低了干物質(zhì)損失。
另作對(duì)照組2，即：取副布氏乳桿菌Lactobacillus parabuchneri按照實(shí)施例2所述方法制備具有單一菌種的液體乳酸菌復(fù)合菌劑，并進(jìn)行如下試驗(yàn)：
(1)按照試驗(yàn)例1進(jìn)行接種發(fā)酵效果試驗(yàn)，觀察發(fā)現(xiàn)，所得青貯料的乳酸和乙酸產(chǎn)量分別為16.26g/kg和10.95g/kg，pH值為4.1；
(2)接著按照試驗(yàn)例2進(jìn)行有氧穩(wěn)定性的測(cè)定試驗(yàn)，觀察發(fā)現(xiàn)，所得青貯料的有氧穩(wěn)定性為268h；青貯料在有氧暴露5天后，相比于對(duì)照組1，其干物質(zhì)損失降低8.5％；有氧暴露12天后，相比于對(duì)照組1，其干物質(zhì)損失降低了26.4％。
結(jié)果表明，該乳酸菌復(fù)合系在提高乙酸產(chǎn)量，提高有氧穩(wěn)定性和降低干物質(zhì)損失方面的效果均優(yōu)于單獨(dú)接種副布氏乳桿菌Lactobacillus parabuchneri。
本發(fā)明的實(shí)施例是為了示例和描述起見(jiàn)而給出的，而并不是無(wú)遺漏的或者將本發(fā)明限于所公開(kāi)的形式。很多修改和變化對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。選擇和描述實(shí)施例是為了更好說(shuō)明本發(fā)明的原理和實(shí)際應(yīng)用，并且使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能夠理解本發(fā)明從而設(shè)計(jì)適于特定用途的帶有各種修改的各種實(shí)施例。