本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別是一種水稻紫葉基因PL1的分子標(biāo)記及其鑒定方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：水稻是人類最重要的糧食作物之一，更是我國的第一大糧食作物，因此如何提高水稻的產(chǎn)量是我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的關(guān)鍵問題。上世紀(jì)70年代，以袁隆平為代表的我國水稻育種家們成功地培育出的三系法雜交水稻極大地提高了水稻的單產(chǎn)，緩解了我國人口迅速增長與糧食短缺的矛盾。但在雜交水稻種子生產(chǎn)過程中，如何保證水稻雜交種和不育系的純度是一個困擾育種家們的難題。常規(guī)人工除雜技術(shù)費(fèi)用高，周期長，且許多性狀受栽培技術(shù)及環(huán)境因素的影響而不易辨別，影響除雜的效果。利用葉色標(biāo)記去雜具有成本低、效果好、不易受環(huán)境影響等特點(diǎn)，因此，開展葉色標(biāo)記研究對保證雜交稻制種和不育系繁殖純度具有重要的實(shí)際意義，不僅縮短鑒定周期，而且節(jié)省費(fèi)用，對雜交稻的生產(chǎn)有著極其重要的意義。水稻紫葉性狀是一個明顯的葉色標(biāo)記，越來越多的育種學(xué)家已將其運(yùn)用于不育系種子純度的鑒定。例如將隱性紫葉性狀導(dǎo)入水稻不育系，不育系在苗期表現(xiàn)紫色，而其配組的雜種FI為正常綠色，兩者很容易區(qū)別，這樣在育秧期間就可以根據(jù)葉色差于人工剔除混雜的不育系及三系雜交稻中的保持系秧苗，達(dá)到去雜保純的目的。而在不育系繁種時，如果隱性紫葉不育系與其它正常綠葉稻串粉結(jié)實(shí)，其長成的幼苗表現(xiàn)為綠色，在制種田里就可以去除，從而確保制種田里不育系的純度。以下為相關(guān)報(bào)道記載：曹立勇等，作物學(xué)報(bào)，1999(1):44-49；紫葉標(biāo)記秈型光—溫敏核不育系中紫S的選育及其配組的雜種優(yōu)勢：曹立勇等利用秈型紫葉稻CN-pl成功地選育出秈型紫葉不育系“中紫S”。楊騰幫等，福建農(nóng)業(yè)科技，2005(1):3-5，具有隱性紫葉標(biāo)記性狀的秈型光敏核不育系明紫02S的選育；楊騰幫等，福建農(nóng)業(yè)科技，2005(5):54-56；隱性紫葉光溫敏核不育水稻明紫03S的選育：楊騰幫等將紫葉性狀導(dǎo)入到不育系中，選育出明紫-2S和明紫-3S。余顯權(quán)等，貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2003，31(3):3-7，隱性紫葉水稻的改良及其應(yīng)用探討：余顯權(quán)等利用原始材料Parptecknck雜交轉(zhuǎn)育出99Hll4紫S。向關(guān)倫等，種子，2007，26(1):93-95，水稻不育系紫ⅡA的選育：向關(guān)倫等利用庚紫與珍汕97B和II-32B雜交選育出紫IIA。鄧國富等，中國稻米，2008(5):26-28，水稻紫紅葉標(biāo)記不育系先紅A的選育及應(yīng)用：鄧國富等將紫葉稻IR1552的紫色性狀導(dǎo)入到秈型三系不育系和兩系不育系中，成功地選育出秈型紫葉三系不育系先紅A。在水稻紫葉性狀基因的定位克隆研究方面，到目前為止，報(bào)道的定位基因有一個即PSH1，其被定位在1號染色體23.5kb的范圍內(nèi)，在此定位區(qū)間范圍內(nèi)，有6個候選基因(WangWY.etal.(2009)Genome,52:268-274)。被克隆的基因有兩個，其中紫葉基因PL(Purpleleaf)是一個與花青素合成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，它負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)CB基因和A基因產(chǎn)生的花色素，使水稻地上部分表現(xiàn)為紫色。該位點(diǎn)有3個等位基因PLi、PLj和PLw，其中PLw由玉米的2個基因，即OsB1和OsB2基因構(gòu)成(Sakamoto,W.etal.Plantandcellphysiology,2001(42):982-991)。OsC1基因與玉米的C1基因同源，對50個水稻種質(zhì)資源的OsC1基因測序結(jié)果表明，OsC1在水稻馴化的過程中，似乎沒有遭受人工選擇(Chin,HS.etal.Rice,2016，DOI10.1186/s12284-016-0080-y)。水稻紫葉基因PL1的的分子標(biāo)記的獲得，可以加快紫葉基因PL1的克隆和功能分析。同時，所獲得的分子標(biāo)記還可以運(yùn)用于雜交種F1純度的鑒定和紫葉不育系的培育，提高育種效率。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明提供了一種水稻紫葉基因PL1分子標(biāo)記及其鑒定方法和應(yīng)用，通過檢測水稻紫葉基因PL1分子標(biāo)記，可以確定有無紫葉基因PL1導(dǎo)入到育種品系中，從而提高該性狀的選擇效率、加快育種進(jìn)度。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為：所述分子標(biāo)記分別是P1、P2、P3、P4、和P5，其對應(yīng)的引物分別是：P1：上游引物：5'—AAATTATTGTTCACACGAAC—3'；下游引物：5'—CTAAGAGAGGGTGTAATCCG—3'；P2：上游引物：5'—AAAACTGCATTCATCCTAAA—3'；下游引物：5'—TGTTTGTGGAGTGATTATCT—3'；P3：上游引物：5'—tcctcatcggcttcttcttc—3'；下游引物：5'—AGAACCCGTTCTACGTCACG—3；P4：上游引物：5'—GGCAATGTCAGTTCCTGATTT—3'；下游引物：5'—AGGACGAGCACAACATACCC—3'；P5：上游引物：5'—AGAGTGATGAGATGATGCTT—3'；下游引物：5'—TACGCACACTGTTTACACG—3'。以上所述的水稻紫葉基因PL1分子標(biāo)記的獲取方法，包括以下步驟：將一個紫葉品種“廣紫06”與綠葉品種Sasanishiki雜交，獲得F1，自交后獲得F2分離群體，選擇F2群體中隱性的紫葉單株用于紫葉基因PL1的連鎖分析和初步定位，獲得以上所述的水稻紫葉基因PL1分子標(biāo)記。本發(fā)明還提供了水稻紫葉基因PL1分子標(biāo)記在水稻紫葉基因PL1的定位與克隆中的應(yīng)用。以上所述的水稻紫葉基因PL1分子標(biāo)記鑒定方法，包括以下步驟：以待鑒定水稻材料全基因組DNA為模板，利用以上所述的分子標(biāo)記P1、P2、P3、P4和P5對應(yīng)引物中的一對或多對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測：（1）采用分子標(biāo)記P1引物進(jìn)行擴(kuò)增，若擴(kuò)增出130bp的擴(kuò)增片段，則表明有紫葉基因PL1的存在；（2）采用分子標(biāo)記P2引物進(jìn)行擴(kuò)增，若擴(kuò)增出197bp的擴(kuò)增片段，則表明有紫葉基因PL1的存在；（3）采用分子標(biāo)記P3引物進(jìn)行擴(kuò)增，若擴(kuò)增出83bp的擴(kuò)增片段，則表明有紫葉基因PL1的存在；（4）采用分子標(biāo)記P4引物進(jìn)行擴(kuò)增，若擴(kuò)增出182bp的擴(kuò)增片段，則表明有紫葉基因PL1的存在；（5）采用分子標(biāo)記P5引物進(jìn)行擴(kuò)增，若擴(kuò)增出107bp的擴(kuò)增片段，則表明有紫葉基因PL1的存在。其中，以上所述PCR的反應(yīng)體系如下：引物(4pmol/μL)2.5μLdNTP(2.5mmol/L)2.0μLDNA模板(25ng/μL)1.0μLTaqDNA聚合酶(5U/μL)0.2μL10×PCR緩沖液1.0μLddH2O3.3μL以上所述PCR的反應(yīng)條件為：94℃變性5min，94℃30s，56℃30s，72℃60s，擴(kuò)增35個循環(huán)，最后72℃終延伸10min。以上所述的分子標(biāo)記鑒定方法，DNA擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，并通過銀染顯色記錄擴(kuò)增的DNA條帶。本發(fā)明的目的還在于提供了以上所述的分子標(biāo)記方法在選育水稻紫葉品種中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果為：（1）本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種水稻紫葉基因PL1的分子標(biāo)記，該分子標(biāo)記為一單核隱性基因標(biāo)記，在生產(chǎn)上可以直接利用，利用該分子標(biāo)記可以有效地解決不育系繁制種或雜交種F1篩選時機(jī)械混雜或生物學(xué)混雜引起的種子純度問題。（2）本發(fā)明的分子標(biāo)記穩(wěn)定，不受栽培技術(shù)及環(huán)境因素的影響，因此可在苗期就能快速鑒定雜交稻種子或不育系的純度，提高選擇的效率或育種效率，加快育種進(jìn)程。（3）通過加快水稻紫葉基因PL1的克隆，能進(jìn)一步深化對紫葉基因PL1功能以及水稻馴化機(jī)制的理解。附圖說明圖1是水稻紫葉基因PL1在第4染色體上的初步定位示意圖。圖2是分子標(biāo)記引物（P3和P5）對F2代24個紫稻單株擴(kuò)增的結(jié)果。其中，圖2A：分子標(biāo)記引物P3對20個紫稻單株擴(kuò)增的帶型，第4株是交換單株；圖2B：分子標(biāo)記引物P5對20個紫稻單株擴(kuò)增的帶型，第10株是交換單株。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施實(shí)例，對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不局限于以下實(shí)施例。實(shí)施例1：紫葉性狀的遺傳分析和基因定位（1）廣紫06/Sasanishiki的F2分離群體的構(gòu)建與遺傳分析利用紫葉品種“廣紫06”與綠葉品種Sasanishiki雜交獲得F1雜交種，種植F1雜交種，自交獲得F2分離群體，用于遺傳分析。根據(jù)田間表型調(diào)查統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，在F2分離群體的542個單株中，綠葉單株有411株，紫葉單株有131株?？ǚ椒治霰砻?，綠葉單株和紫葉單株的比例符合3:1的分離比例(c2=0.199,R?0.05)，這表明“廣紫06”的紫葉性狀受一對隱性主效核基因控制。（2）PL1的分子標(biāo)記連鎖分析及初步定位從F2分離群體的542個單株中，選取131株紫葉表型的單株用于目標(biāo)基因的初步定位，利用初步定位篩選出來的多態(tài)性分子標(biāo)記對這131個隱性單株進(jìn)行連鎖分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PL1和4號染色體上的分子標(biāo)記P1和P2存在連鎖，兩標(biāo)記處各出現(xiàn)5和3個交換單株，且這些交換單株都不相同，表明目標(biāo)基因位于標(biāo)記P1和P2之間；為進(jìn)一步縮小并明確目標(biāo)基因的位置，繼續(xù)利用分子標(biāo)記P1和P2之間的三對分子標(biāo)記P3、P4和P5，對這131個隱性單株進(jìn)行連鎖分析，如圖1所示，結(jié)果表明，在分子標(biāo)記P3、P4和P5處，分別有1個、0個、1個交換單株，而且分子標(biāo)記P3上的1個交換單株包含在分子標(biāo)記P1的5個交換單株內(nèi)，分子標(biāo)記P5上的1個交換單株包含在分子標(biāo)記P2的3個交換單株內(nèi)，并且和分子標(biāo)記P1和P3上的交換單株不重復(fù)，證實(shí)了該基因位于第4染色體上，并且定位于分子標(biāo)記P3和P5之間。如圖2A所示，分子標(biāo)記引物P3對紫稻單株的擴(kuò)增帶型，第4株是交換單株；如圖2B所示，分子標(biāo)記引物P5對紫稻單株的擴(kuò)增帶型，第10株是交換單株；結(jié)合圖1所示，物理距離約為1.3Mb。上述連鎖分析和初步定位過程，所采用的DNA提取方法和PCR反應(yīng)條件分別為：A.用常規(guī)的CTAB法提取紫葉品種“廣紫06”親本、綠葉品種Sasanishiki親本和F2分離群體各單株的DNA；B.PCR的反應(yīng)體系如下：引物(4pmol/μL)2.5μLdNTP(2.5mmol/L)2.0μLDNA模板(25ng/μL)1.0μLTaqDNA聚合酶(5U/μL)0.2μL10×PCR緩沖液1.0μLddH2O3.3μLPCR反應(yīng)條件為：94℃變性5min，94℃30s，56℃30s，72℃60s，擴(kuò)增35個循環(huán)，最后72℃終延伸10min。DNA擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，通過銀染顯色記錄擴(kuò)增的DNA條帶。由上述過程可以看出利用這些與水稻紫葉基因PL1連鎖的分子標(biāo)記可以有效地開展水稻紫葉基因PL1的分子標(biāo)記輔助選擇育種、雜交種F1和不育系純度的鑒定；同時可以利用大的分離群體，加快對水稻紫葉基因PL1的精細(xì)定位與圖位克隆。（3）F2株系后代篩選分析利用獲得的分子標(biāo)記P3和P5，在F2株系后代中篩選了53個雜合單株構(gòu)建F3定位群體，雜合單株分單株收獲種植，每個株系均出現(xiàn)了綠葉與紫葉表型的分離，且綠葉單株和紫葉單株的分離比符合3:1的比例，其篩選準(zhǔn)確率達(dá)到100%。說明利用PL1基因的分子標(biāo)記P3和P5進(jìn)行水稻紫葉性狀的標(biāo)記輔助選擇是有效的。（4）結(jié)果分析上述結(jié)果表明，利用P1、P2、P3、P4和P5可對水稻紫葉基因PL1進(jìn)行分子標(biāo)記，其對應(yīng)的引物如表1：表1定位的引物及其序列引物名稱上游引物序列（5’-3’）下游引物序列（5’-3’）擴(kuò)增產(chǎn)物大?。╞p）P1AAATTATTGTTCACACGAACCTAAGAGAGGGTGTAATCCG廣紫06：130Sasanishiki：192P2AAAACTGCATTCATCCTAAATGTTTGTGGAGTGATTATCT廣紫06：197Sasanishiki：128P3tcctcatcggcttcttcttcAGAACCCGTTCTACGTCACG廣紫06：83Sasanishiki：121P4GGCAATGTCAGTTCCTGATTTAGGACGAGCACAACATACCC廣紫06：182Sasanishiki：156P5AGAGTGATGAGATGATGCTTTACGCACACTGTTTACACG廣紫06：107Sasanishiki：128實(shí)施例2分子標(biāo)記方法以待鑒定水稻材料全基因組DNA為模板，利用以上所述的分子標(biāo)記P1、P2、P3、P4和P5對應(yīng)引物中的一對或多對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測。（一）用常規(guī)的CTAB法提取供體親本、受體親本和F2分離群體各單株的DNA；（二）PCR的反應(yīng)體系如下：引物(4pmol/μL)2.5μLdNTP(2.5mmol/L)2.0μLDNA模板(25ng/μL)1.0μLTaqDNA聚合酶(5U/μL)0.2μL10×PCR緩沖液1.0μLddH2O3.3μLPCR反應(yīng)條件為：94℃變性5min，94℃30s，56℃30s，72℃60s，擴(kuò)增35個循環(huán)，最后72℃終延伸10min。DNA擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，通過銀染顯色記錄擴(kuò)增的DNA條帶。（三）結(jié)果分析（1）采用分子標(biāo)記P1引物進(jìn)行擴(kuò)增，若擴(kuò)增出130bp的擴(kuò)增片段，則表明有紫葉基因PL1的存在；若能擴(kuò)增出192bp的擴(kuò)增片段，則表明有綠葉親本Sasanishiki的擴(kuò)增片段；（2）采用分子標(biāo)記P2引物進(jìn)行擴(kuò)增，若擴(kuò)增出197bp的擴(kuò)增片段，則表明有紫葉基因PL1的存在；若能擴(kuò)增出128bp的擴(kuò)增片段，則表明有綠葉親本Sasanishiki的擴(kuò)增片段；（3）采用分子標(biāo)記P3引物進(jìn)行擴(kuò)增，若擴(kuò)增出83bp的擴(kuò)增片段，則表明有紫葉基因PL1的存在；若能擴(kuò)增出121bp的擴(kuò)增片段，則表明有綠葉親本Sasanishiki的擴(kuò)增片段；（4）采用分子標(biāo)記P4引物進(jìn)行擴(kuò)增，若擴(kuò)增出182bp的擴(kuò)增片段，則表明有紫葉基因PL1的存在；若能擴(kuò)增出156bp的擴(kuò)增片段，則表明有綠葉親本Sasanishiki的擴(kuò)增片段；（5）采用分子標(biāo)記P5引物進(jìn)行擴(kuò)增，若擴(kuò)增出107bp的擴(kuò)增片段，則表明有紫葉基因PL1的存在；若能擴(kuò)增出128bp的擴(kuò)增片段，則表明有綠葉親本Sasanishiki的擴(kuò)增片段；基于上述5個分子標(biāo)記來檢測水稻不育系，可驗(yàn)證是否含有紫葉基因PL1的存在，可進(jìn)行紫葉水稻不育系的選育，從而加快不育系的育種進(jìn)度；同時可利用上述5個分子標(biāo)記來檢測雜種F1，快速區(qū)分真假雜種，提高雜種F1種子的純度。序列表<110>廣西大學(xué)<120>水稻紫葉基因PL1的分子標(biāo)記及其鑒定方法和應(yīng)用<160>10<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<221>分子標(biāo)記P1上游引物<400>1AAATTATTGTTCACACGAAC20<210>2<211>26<212>DNA<213>人工序列<221>分子標(biāo)記P1下游引物<400>2CTAAGAGAGGGTGTAATCCG20<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<221>分子標(biāo)記P2上游引物<400>3AAAACTGCATTCATCCTAAA20<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<221>分子標(biāo)記P2下游引物<400>4TGTTTGTGGAGTGATTATCT20<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<221>分子標(biāo)記P3上游引物<400>5TCCTCATCGGCTTCTTCTTC20<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<221>分子標(biāo)記P3下游引物<400>6AGAACCCGTTCTACGTCACG20<210>7<211>21<212>DNA<213>人工序列<221>分子標(biāo)記P4上游引物<400>7GGCAATGTCAGTTCCTGATTT21<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<221>分子標(biāo)記P4下游引物<400>8AGGACGAGCACAACATACCC20<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<221>分子標(biāo)記P5上游引物<400>9AGAGTGATGAGATGATGCTT20<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列<221>分子標(biāo)記P5下游引物<400>10TACGCACACTGTTTACACG20當(dāng)前第1頁1 2 3