本發(fā)明屬于生物防治技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株沙福芽孢桿菌YJC-4及其在防治煙草黑脛病和促生長(zhǎng)中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

煙草黑脛病菌(Phytophthora parasitica var.nicotianae)是一種兼性寄生菌，會(huì)誘發(fā)煙草黑脛病(Tobacco Black Shank)，對(duì)煙草具有毀滅性危害。黑脛病菌喜高溫高濕，溫度在28-30℃，濕度達(dá)到80％以上時(shí)，會(huì)給病菌孢子囊的釋放和游動(dòng)孢子的傳播創(chuàng)造有利條件，此時(shí)最易引起煙草黑脛病的流行與發(fā)生，引起煙株大面積死亡。煙草作為其寄主植物，在其團(tuán)棵期到旺長(zhǎng)期間發(fā)病達(dá)到高峰期，主要危害煙株根部和莖基部。另外，土地多年連作、與煙草青枯病、根結(jié)線蟲(chóng)病混合發(fā)生，將加重危害煙株健康，導(dǎo)致煙葉減產(chǎn)和煙葉質(zhì)量降低。

土壤中主要含有細(xì)菌、真菌和放線菌3類微生物，研究發(fā)現(xiàn)許多芽孢桿菌作為拮抗菌對(duì)煙草黑脛病具有良好的防治效果。國(guó)內(nèi)外眾多研究表明，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)和短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)等通過(guò)抗生、溶菌、競(jìng)爭(zhēng)、重寄生等作用機(jī)制對(duì)煙草黑脛病具有良好的防治效果。有些拮抗菌對(duì)煙株有促生作用，促進(jìn)煙苗氮、磷、鉀吸收，可有效降低帶病煙苗的發(fā)病率和病情指數(shù)。

目前也有商品化的枯草芽孢桿菌，但是在防治煙草黑脛病及促生長(zhǎng)方面仍有不足。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述問(wèn)題，本發(fā)明旨在提供一株沙福芽孢桿菌，能有效防治煙草的黑脛病，并能對(duì)煙草的生長(zhǎng)產(chǎn)生明顯的促進(jìn)作用。

一株沙福芽孢桿菌YJC-4，分類名為Bacillus safensis，已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏日期為2016年4月15日，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏編號(hào)為CGMCC No.12356。

進(jìn)一步地，沙福芽孢桿菌YJC-4的菌體呈桿狀，革蘭氏染色顯陽(yáng)性。

進(jìn)一步地，所述沙福芽孢桿菌YJC-4的培養(yǎng)基組份為：牛肉浸膏3.0g，蛋白胨5.0g，酵母粉1.0g，葡萄糖10.0g，瓊脂18.0g，蒸餾水1L。

進(jìn)一步地，所述沙福芽孢桿菌YJC-4的培養(yǎng)條件為：30-35℃、pH7-8恒溫震蕩培養(yǎng)24-72h。優(yōu)選35℃、pH7.5恒溫震蕩培養(yǎng)60h。

上述沙福芽孢桿菌YJC-4在防治煙草黑脛病中的應(yīng)用。

進(jìn)一步地，沙福芽孢桿菌YJC-4在防治煙草黑脛病中應(yīng)用的形式為菌液，應(yīng)用方式為灌根，每株煙苗灌根量共1×10⁷-9×10⁷cfu。

更進(jìn)一步地，灌根采用分三次灌根的形式，第一次在煙株生長(zhǎng)到5-6片真葉時(shí)，以后每隔7天灌根一次。更進(jìn)一步地，三次灌根量相同。

上述沙福芽孢桿菌YJC-4在促進(jìn)煙草生長(zhǎng)中的應(yīng)用。

進(jìn)一步地，沙福芽孢桿菌YJC-4在促進(jìn)煙草生長(zhǎng)中應(yīng)用的形式為菌液，應(yīng)用方式為灌根，每株煙苗灌根量共1×10⁷-9×10⁷cfu。

更進(jìn)一步地，為使拮抗菌更好地定植在煙株的根部，煙苗在移栽至生長(zhǎng)田中前在1×10⁶-9×10⁶cfu/mL的YJC-4菌液中浸根20-40min。

本發(fā)明從煙草根際土壤中分離篩選到1株對(duì)煙草黑脛病菌具有較好拮抗活性，且對(duì)煙株具有良好促生作用的沙福芽孢桿菌YJC-4，具有以下優(yōu)勢(shì)：

(1)生防效果好：在盆栽試驗(yàn)中，用YJC-4菌液處理接種煙草黑脛病菌的煙草植株，防治效果達(dá)到81.59％，顯著優(yōu)于58％甲霜·錳鋅和生物制劑枯草芽孢桿菌的防治效果，在煙草黑脛病的生物防治方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，發(fā)展和應(yīng)用前景良好。生物防治對(duì)環(huán)境友好、不易產(chǎn)生抗藥性、對(duì)人畜安全，為煙草綠色防控發(fā)展創(chuàng)造條件。

(2)促生效果好：YJC-4菌液對(duì)煙株的生物量及農(nóng)藝性狀均具有顯著的促進(jìn)效果，與對(duì)照組差異顯著。

附圖說(shuō)明

圖1拮抗菌YJC-4對(duì)煙草黑脛病菌的抑制作用(A為對(duì)照、B為YJC-4菌株)；

圖2在掃描電子顯微鏡下，YJC-4拮抗菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)；

圖3溫度對(duì)YJC-4菌株生長(zhǎng)量的影響；

圖4 pH對(duì)YJC-4菌株生長(zhǎng)量的影響；

圖5培養(yǎng)時(shí)間對(duì)YJC-4菌株生長(zhǎng)量的影響；

圖6 YJC-4的16S rDNA擴(kuò)增條帶；

圖7拮抗菌YJC-4的16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)；

圖8幾種不同處理的煙株生長(zhǎng)情況。

沙福芽孢桿菌(Bacillus safensis)YJC-4，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏日期：2016年4月15日，保藏編號(hào)為CGMCC No.12356。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。

所有實(shí)施例中用到的材料如下：

主要試劑和材料如下：

DNA快速提取試劑盒Easy Pure Bacteria Genomic DNA Kit為全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品(貨號(hào)EE161-01)；

革蘭氏染色試劑盒為索萊寶產(chǎn)品(貨號(hào)G1060)；

58％甲霜·錳鋅可濕性粉劑為江蘇靈寶化學(xué)有限公司生產(chǎn)；

枯草芽孢桿菌可濕性粉劑由德強(qiáng)生物公司生產(chǎn)；

其他藥劑均為國(guó)藥分析純。

煙草品種：紅花大金元(易感品種)，由國(guó)家煙草改良中心提供。

煙草黑脛病菌(Phytophthora nicotianae)：由國(guó)家煙草改良中心提供。

拮抗菌分離、培養(yǎng)和測(cè)定所用的培養(yǎng)基如下：

拮抗菌的培養(yǎng)和分離選用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基NA(牛肉浸膏3.0g，蛋白胨5.0g，酵母粉1.0g，葡萄糖10.0g，瓊脂18.0g，蒸餾水1L，調(diào)節(jié)pH6.8)，和營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基NB(牛肉浸膏3.0g，蛋白胨5.0g，酵母粉1.0g，葡萄糖10.0g，蒸餾水1L)。

抑菌活性測(cè)定選用燕麥培養(yǎng)基OA(燕麥片18g，瓊脂18.0g，蒸餾水1L，調(diào)節(jié)pH6.8)。

生理生化性狀測(cè)定選用運(yùn)動(dòng)型培養(yǎng)基(明膠80g，牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，瓊脂4g，蒸餾水1L，調(diào)節(jié)pH6.8)。

檸檬酸鹽利用情況選用檸檬酸鹽瓊脂培養(yǎng)基(MgSO₄·7H₂O 0.2g，NH₄H₂PO₄ 1g，K₂HPO₄，檸檬酸鈉2g，溴麝香草酚藍(lán)80mg，瓊脂15g，蒸餾水1L，調(diào)節(jié)pH6.8)。

厭氧生長(zhǎng)情況選用葡萄糖肉湯培養(yǎng)基(營(yíng)養(yǎng)肉湯8g，20％葡萄糖貯液50mL，蒸餾水950mL，調(diào)節(jié)pH7.0)。

實(shí)施例1沙福芽孢桿菌YJC-4的篩選及其對(duì)黑脛病菌的拮抗作用

1.1拮抗菌的分離和篩選：

從貴州開(kāi)陽(yáng)、清鎮(zhèn)，四川攀枝花、西昌，山東諸城、沂水、即墨等地共采集土壤87份，為獲得高效拮抗菌，選取5-10cm深處的黑脛病株根部土壤及相鄰健康植株根部土壤，做好標(biāo)記后，保存于-20℃的冰箱中待用。

對(duì)采集的87份土壤分別進(jìn)行以下處理：首先將土壤中的根、莖、葉等雜物除去，進(jìn)行壓碎過(guò)20目篩。用電子天平稱取5g處理后的土壤，放進(jìn)100mL錐形瓶中，并加水定容至50mL，震蕩均勻，取上清液1mL梯度稀釋至10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6倍。用移液槍分別吸取各稀釋溶液200μL，并分別用涂布器均勻涂布在NA固體培養(yǎng)基上，封口后，倒置放于37℃培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)48h。無(wú)菌水作為空白對(duì)照，3次重復(fù)。挑取生長(zhǎng)性狀不同的單菌落324株，作為拮抗菌的候選菌，進(jìn)行純化培養(yǎng)(用接種環(huán)挑取單菌落，在NA固體培養(yǎng)基上劃線，封口后，放于37℃培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)48h，按照上述步驟重復(fù)1-2次，獲得純化的單菌落)。

1.2拮抗菌候選菌對(duì)黑脛病菌的拮抗作用：

運(yùn)用對(duì)峙培養(yǎng)法，用滅菌的打孔器(直徑10mm)將煙草黑脛病菌接種到OA平板培養(yǎng)基的中心處，在煙草黑脛病菌塊平行兩側(cè)離中心點(diǎn)25mm處平行兩側(cè)劃兩條短線(用接種環(huán)沾取少量菌液后，在培養(yǎng)基上劃兩道，長(zhǎng)度約0.5cm)，此為處理組，對(duì)照組采用不含候選菌的空白OA培養(yǎng)液。然后倒置放在28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天，觀察黑脛病菌周圍有無(wú)抑制帶，并利用十字交叉法測(cè)量其抑菌直徑大小d(mm)。對(duì)照不接種候選菌，其他均相同。

抑菌率計(jì)算公式如下：

抑菌率(％)＝(對(duì)照組菌落直徑－處理組菌落直徑)/處理組菌落直徑]×100％。

在324株候選菌中，有12株的抑菌直徑達(dá)到39.90-58.20mm，相對(duì)抑制率在46％-73％之間，見(jiàn)表1。其中YJC-4菌株對(duì)煙草黑脛病抑菌效果最好，其抑菌直徑達(dá)到58.20mm，相對(duì)抑制率達(dá)到72.30％，具有較好的抑菌效果，見(jiàn)圖1。

表1拮抗細(xì)菌對(duì)煙草黑脛病的平板拮抗效果

注:數(shù)字后不同的小寫(xiě)英文字母表示差異顯著(P＜0.05),下同。

1.3菌株YJC-4的形態(tài)學(xué)鑒定

在NA培養(yǎng)基上，YJC-4菌落均呈乳白色，表面光滑，不透明。

通過(guò)電子掃描顯微鏡觀察YJC-4菌株的形態(tài)、結(jié)構(gòu)，步驟如下：(1)取樣：將YJC-4菌株接種到NB培養(yǎng)基中進(jìn)行震蕩恒溫培養(yǎng)48h，取其菌液樣品進(jìn)行離心(3000rpm)，去除上清液后，加入pH為7.0，0.01mol/L的PBS緩沖液充分清洗。(2)固定：用2.5％的戊二醛和2％鋨酸進(jìn)行固定，PBS清洗。(3)脫水處理：用乙醇的PBS溶液按30％，50％，70％，90％濃度梯度進(jìn)行樣品處理，后經(jīng)過(guò)100％乙醇充分脫水，再經(jīng)乙醇和叔丁醇混合液脫水10min，最后放置叔丁醇中脫水處理。(4)冷凍干燥。(5)噴施Pt粉后，在電子掃描顯微鏡上觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)。圖2顯示，菌株YJC-4的菌體為桿狀，內(nèi)生芽孢，大小為0.2-0.4×1.0-2.0μm。

1.4生理生化性狀鑒定

參考《植病研究方法》(方中達(dá)編著，中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社出版)，鑒定YJC-4菌株的革蘭氏染色陽(yáng)性/陰性，運(yùn)動(dòng)性，氧化酶，在葡萄糖培養(yǎng)基中厭氧生長(zhǎng)狀況，是否水解淀粉，檸檬酸鹽利用情況，V.P.測(cè)驗(yàn)，7％氯化鈉生長(zhǎng)狀況等鑒定。

結(jié)果顯示，YJC-4菌株在顯微鏡中觀察革蘭氏染色顯紫色，為革蘭氏陽(yáng)性菌，具有一定的運(yùn)動(dòng)性，氧化酶顯陰性，V.P.測(cè)驗(yàn)顯陽(yáng)性，可以利用檸檬酸鹽，不能水解淀粉，在葡萄糖培養(yǎng)基中厭氧條件下不能生長(zhǎng)，在7％氯化鈉中生長(zhǎng)。

1.5菌株YJC-4的最適培養(yǎng)條件

1.5.1溫度對(duì)菌株YJC-4生長(zhǎng)量的影響：以5％接種量將YJC-4菌株接種到pH7.0的液體NB培養(yǎng)基中，震蕩均勻，分別放在20℃、25℃、27.5℃、30℃、32.5℃、35℃、40℃、45℃的恒溫培養(yǎng)箱中120r/min培養(yǎng)2d，通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)定拮抗菌的濃度，來(lái)反映其生長(zhǎng)量的大小。

如圖3所示：隨著溫度的增加，YJC-4拮抗菌的生長(zhǎng)量總體呈“先迅速增加后迅速減少”的趨勢(shì)，最適溫度為35℃，其次為32.5℃。在高溫低溫條件下，生長(zhǎng)均受到嚴(yán)重抑制。

1.5.2pH對(duì)菌株YJC-4生長(zhǎng)量的影響：以5％接種量將YJC-4菌株接種到液體NB培養(yǎng)基中，初始pH分別為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，震蕩均勻，在30℃培養(yǎng)箱中120r/min發(fā)酵2d，測(cè)定拮抗菌的濃度。

如圖4所示：隨著pH的增加，YJC-4拮抗菌的生長(zhǎng)量總體呈“先迅速增加后迅速減少”的趨勢(shì)，最適pH為7.5，其次為7.0，當(dāng)pH<5.5時(shí)，菌落幾乎不生長(zhǎng)；在pH>9.0時(shí)，菌落生長(zhǎng)量減少嚴(yán)重，表明YJC-4拮抗菌不耐強(qiáng)酸強(qiáng)堿。處理間不同pH對(duì)YJC-4拮抗菌的生長(zhǎng)量存在顯著性差異，表明pH是YJC-4拮抗菌生長(zhǎng)的重要因素。

1.5.3發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株YJC-4生長(zhǎng)量的影響：以5％接種量將YJC-4菌株接種到液體NB培養(yǎng)基中，在30℃培養(yǎng)箱中120r/min震蕩培養(yǎng)，分別于0h、12h、24h、36h、48h、60h、72h取樣拮抗菌的濃度。

如圖5所示：隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，YJC-4拮抗菌的生長(zhǎng)量總體呈“先迅速增加后基本保持不變”的趨勢(shì)，60h表現(xiàn)生長(zhǎng)量最高，其次為48h。

1.6菌株YJC-4的16S rDNA鑒定

(1)根據(jù)DNA快速提取試劑盒的要求與步驟，取過(guò)夜培養(yǎng)的YJC-4菌液1mL，通過(guò)Resuspension Buffer11、Lysis Buffer將細(xì)胞裂解，再經(jīng)過(guò)RNase A、Binding Buffer11、Clean Buffer、Wash Buffer去除雜質(zhì)，最后通過(guò)Elution Buffer洗脫，得到菌株YJC-4的基因組DNA，-20℃保存。(2)以菌株YJC-4的基因組DNA為模板，以799F(5'-AACAGGATTAGATACCCTG-3')和R1492(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')作為引物擴(kuò)增其16S rDNA序列；50μL擴(kuò)增體系：模板1μL，正反向引物各1μL，2×EasyPCR Super Mix 25μL，超純水22μL；PCR反應(yīng)程序：94℃5min，94℃30s，55℃30s，72℃1min，35個(gè)循環(huán)，72℃10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)1.5％的TAE瓊脂糖凝膠電泳并EB染色，得到明亮的條帶，右側(cè)為YJC-4的16S rDNA條帶，條帶顯示分子大小為750bp，如圖6所示。(3)PCR產(chǎn)物委托青島擎科生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，測(cè)得該菌的16S rDNA核苷酸序列長(zhǎng)度為670bp，序列信息見(jiàn)序列表中SEQ ID No.3，GenBank登錄號(hào)為KX663830；(4)測(cè)序結(jié)果利用BLAST軟件進(jìn)行同源性比較，用MEGA5.1的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。由圖7可知，YJC-4與沙福芽孢桿菌Bacillus safensis(JF411315.1)進(jìn)化關(guān)系最近，同源性達(dá)到99％。根據(jù)平板抑菌效果、形態(tài)學(xué)鑒定、生理生化性狀分析、最適生長(zhǎng)條件探究和16S rDNA序列同源性分析，由此推斷，YJC-4鑒定為沙福芽孢桿菌(Bacillus safensis)。

實(shí)施例2沙福芽孢桿菌YJC-4防治煙草黑脛病的盆栽試驗(yàn)

取三株生長(zhǎng)到5-6片真葉的紅花大金元煙草植株盆栽，分別在相同條件下接種黑脛病菌：用小刀輕輕劃傷煙株的根基部，將培養(yǎng)好的黑脛病菌接種到傷口處。

圖8所示的為三種不同處理的煙株生長(zhǎng)情況：1號(hào)為接種黑脛病菌后，立即灌根20mL(2±0.5)×10⁶cfu/mL YJC-4拮抗菌液后7天的生長(zhǎng)狀況；2號(hào)為黑脛病菌接種后3天，未使用YJC-4拮抗菌，煙株發(fā)病狀況；3號(hào)為黑脛病菌接種后7天，未使用YJC-4拮抗菌，煙株發(fā)病狀況。表明拮抗菌液對(duì)黑脛病具有較好的防治效果，有利于進(jìn)行下一步深入研究。

實(shí)施例3沙福芽孢桿菌YJC-4防治煙草黑脛病防效的盆栽試驗(yàn)

將搖培好的YJC-4菌液，菌液濃度約(2±0.5)×10⁸cfu/mL，稀釋100倍后，對(duì)盆栽生長(zhǎng)到5-6片真葉的紅花大金元煙草植株進(jìn)行灌根處理，同時(shí)將煙株在相同條件下接種黑脛病菌：用小刀輕輕劃傷煙株的根基部，將培養(yǎng)好的黑脛病菌接種到傷口處。每隔7天施一次藥劑，共施3次。對(duì)照藥劑用58％甲霜·錳鋅可濕性粉劑和1000億/g枯草芽孢桿菌粉劑分別500倍液噴霧接種黑脛病菌的煙株，空白對(duì)照用等量的無(wú)菌水處理，其他均相同，具體操作見(jiàn)表2。每個(gè)處理20株，3次重復(fù)。于第三次施藥處理后7天調(diào)查發(fā)病率(％)、病情指數(shù)和相對(duì)防治效果(％)。分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)按照中華人民共和國(guó)煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(YC/T39—1996)規(guī)定執(zhí)行。

發(fā)病率＝病株數(shù)/煙株總數(shù)×100％。

病情指數(shù)＝100×∑(各級(jí)病株數(shù)×各級(jí)代表值)/(調(diào)查總株數(shù)×最高級(jí)代表值)。

以株為單位分級(jí)調(diào)查。

0級(jí)：全株無(wú)病。

1級(jí)：莖部病斑不超過(guò)莖圍的1/3，或1/3以下葉片凋萎。

3級(jí)：莖部病斑環(huán)繞莖圍1/3～1/2，或1/3～1/2葉片輕度凋萎，或下部少數(shù)葉片出現(xiàn)病斑。

5級(jí)：莖部病斑超過(guò)莖圍的1/2，但未全部環(huán)繞莖圍，或1/2～2/3葉片凋萎。

7級(jí)：莖部病斑全部環(huán)繞莖圍，或2/3以上葉片凋萎。

9級(jí)：病株基本枯死。

相對(duì)防治效果(％)＝(對(duì)照組病情指數(shù)—處理組病情指數(shù))/對(duì)照組病情指數(shù)×100％。

以上數(shù)據(jù)采用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行方差分析計(jì)算。

表2藥劑試驗(yàn)具體操作表

表3的盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，在第三次施藥處理7天后，YJC-4拮抗菌具有較好的防治效果，YJC-4拮抗菌處理的煙株，發(fā)病率為11.13％，病情指數(shù)為5.32，防治效果達(dá)到81.59％；與58％甲霜·錳鋅相比，YJC-4處理的菌株發(fā)病率略高，但差異不顯著，處在同一水平上；YJC-4處理的煙株病情指數(shù)最小，防治效果最高，與58％甲霜·錳鋅和1000億/g枯草芽孢桿菌處理的煙株差異不顯著。說(shuō)明YJC-4拮抗菌對(duì)黑脛病的防治效果最好，與58％甲霜·錳鋅可濕性粉劑和1000億/g枯草芽孢桿菌防治效果相當(dāng)，表明YJC-4拮抗菌具有較好的推廣價(jià)值。

表3菌株YJC-4對(duì)煙草黑脛病的溫室防治效果

標(biāo)注：數(shù)據(jù)表示平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，數(shù)據(jù)采用Duncan氏新復(fù)極差法，不同小寫(xiě)字母和大寫(xiě)字母分別表示在P<0.05和P<0.01水平上差異顯著。

實(shí)施例4沙福芽孢桿菌YJC-4的促生試驗(yàn)

為驗(yàn)證YJC-4拮抗菌對(duì)煙株的促進(jìn)生長(zhǎng)作用，首先，將生長(zhǎng)到5-6片真葉的煙苗從假植盤(pán)中移出，在預(yù)先配制好的供試拮抗菌液(1×10⁶cfu/mL)中浸根，30min后取出并移栽于裝有滅菌土的花盆中。移栽緩苗3d后，用拮抗菌液分別對(duì)煙株灌根處理，10mL/株，每次重復(fù)10株，3次重復(fù)，空白對(duì)照用等量的清水進(jìn)行處理。在溫度為28℃，濕度約為80％的溫室條件下培養(yǎng)觀察。分別于移栽后15d、30d、45d，從30棵中隨機(jī)選取10株煙草并記錄促生指標(biāo)，測(cè)量整株鮮質(zhì)量、整株干質(zhì)量、根部鮮重、根部干重，分析拮抗菌對(duì)煙株生物量的促生效果；測(cè)量其平均株高、平均根長(zhǎng)、最大葉長(zhǎng)、最大葉寬，分析拮抗菌對(duì)煙株農(nóng)藝性狀的促進(jìn)效果。

YJC-4拮抗菌對(duì)煙株生物量的促生作用：

如表4所示，隨著煙株的生長(zhǎng)發(fā)育，探究拮抗菌對(duì)其生物量的促生作用，分別于移栽后15、30、45天調(diào)查了拮抗菌對(duì)整株鮮質(zhì)量、整株干質(zhì)量、根鮮重、根干重的影響。研究表明，拮抗菌對(duì)煙株生物量的促進(jìn)作用顯著。

9月24日(移栽后15天)調(diào)查，YJC-4拮抗菌能促進(jìn)煙株生物量的生長(zhǎng)，其中對(duì)根干重的促進(jìn)作用最為明顯，YJC-4與CK相比差異性極顯著，增長(zhǎng)率達(dá)到38.46％。其他指標(biāo)促生作用差異性不顯著，表明移栽后15天，拮抗菌對(duì)煙株生物量的促進(jìn)作用不明顯。

10月09日(移栽后30天)調(diào)查，與對(duì)照相比，YJC-4拮抗菌對(duì)煙株的整株鮮質(zhì)量、整株干質(zhì)量、根鮮重、根干重的促進(jìn)作用明顯，均達(dá)到極顯著性差異。YJC-4拮抗菌對(duì)根干重的促進(jìn)作用明顯，增長(zhǎng)率為38.46％。

10月24日(移栽后45天)調(diào)查，與對(duì)照相比，YJC-4拮抗菌對(duì)煙株的整株鮮質(zhì)量，整株干質(zhì)量、根鮮重、根干重的促進(jìn)作用明顯，均達(dá)到極顯著性差異，YJC-4拮抗菌對(duì)整株干質(zhì)量、根干重的促進(jìn)作用最明顯，增長(zhǎng)率分別為50.00％、62.09％，拮抗菌對(duì)煙株生物量的促生作用明顯，可以有效促進(jìn)煙株的物質(zhì)積累。

表4拮抗菌對(duì)煙株生物量的促生作用

注:同列數(shù)據(jù)上標(biāo)不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P＜0.05)，大寫(xiě)字母表示差異極顯著(P＜0.01)，下同。

YJC-4拮抗菌對(duì)煙株農(nóng)藝性狀的促生作用：

如表5所示，探究拮抗菌對(duì)其農(nóng)藝性狀的促生作用，分別于移栽后15、30、45天調(diào)查了拮抗菌對(duì)株高，根長(zhǎng)、最大葉長(zhǎng)、最大葉寬的影響。研究表明，拮抗菌對(duì)煙株農(nóng)藝性狀的促進(jìn)作用顯著。

9月24日(移栽后15天)調(diào)查，YJC-4拮抗菌能明顯促進(jìn)煙株的農(nóng)藝性狀，其中對(duì)根長(zhǎng)、最大葉長(zhǎng)和最大葉寬的促進(jìn)作用最為明顯，與CK相比差異性極顯著，株高與CK相比差異性顯著。

10月09日(移栽后30天)調(diào)查，YJC-4拮抗菌對(duì)煙株的株高、根長(zhǎng)、最大葉長(zhǎng)和最大葉寬的促進(jìn)作用明顯，均達(dá)到極顯著性差異，其中YJC-4拮抗菌對(duì)株高和最大葉長(zhǎng)的促進(jìn)作用最明顯，對(duì)株高的增長(zhǎng)率為17.03％，對(duì)最大葉長(zhǎng)的增長(zhǎng)率為17.88％。

10月24日(移栽后45天)調(diào)查，YJC-4拮抗菌對(duì)煙株的株高、根長(zhǎng)、最大葉長(zhǎng)和最大葉寬的促進(jìn)作用明顯，均達(dá)到極顯著性差異，且YJC-4拮抗菌對(duì)根長(zhǎng)的促進(jìn)作用明顯，增長(zhǎng)率為25.59％。表明YJC-4拮抗菌對(duì)煙株的生物性狀有明顯促生作用。

表5拮抗菌對(duì)煙株農(nóng)藝性狀的促生作用

SEQUENCE LISTING

<110> 湖北省煙草科學(xué)研究院；中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所；貴州省煙草公司貴陽(yáng)市公司

<120> 沙福芽孢桿菌YJC-4及其在防治煙草黑脛病和促生長(zhǎng)中的應(yīng)用

<130> 2017

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 799F

<400> 1

aacaggatta gataccctg 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R1492

<400> 2

ggttaccttg ttacgactt 19

<210> 3

<211> 670

<212> DNA

<213> Bacillus safensis

<400> 3

cgtaaacgat gagtgctaag tgttaggggg tttccgcccc ttagtgctgc agctaacgca 60

ttaagcactc cgcctgggga gtacggtcgc aagactgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg 120

cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt 180

cttgacatcc tctgacaacc ctagagatag ggctttccct tcggggacag agtgacaggt 240

ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc 300

aacccttgat cttagttgcc agcattcagt tgggcactct aaggtgactg ccggtgacaa 360

accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac 420

gtgctacaat ggacagaaca aagggctgca agaccgcaag gtttagccaa tcccataaat 480

ctgttctcag ttcggatcgc agtctgcaac tcgactgcgt gaagctggaa tcgctagtaa 540

tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca 600

ccacgagagt ttgcaacacc cgaagtcggt gaggtaacct ttatggaccc cccccccaaa 660

gggggggcaa 670