技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于海洋生物領(lǐng)域，具體涉及一個環(huán)五肽化合物和一個線性肽化合物及其制備方法和在制備抗hsv-1病毒藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：
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海洋生物資源豐富，代謝產(chǎn)物類型多樣，結(jié)構(gòu)新穎，有較好的生物活性，是近年來研究學(xué)者的焦點。肽類化合物是海洋生物代謝產(chǎn)物中的一大類型，目前發(fā)現(xiàn)的海洋肽類具有細(xì)胞毒、抗菌、抗污損等活性，另一類具有神經(jīng)藥理活性，如芋螺的肽類毒素ziconotide具有鎮(zhèn)痛作用，是第一個海洋藥物(商品名為prialt)，被用作治療脊髓損傷引起的慢性疼痛。在海洋微生物的次級代謝產(chǎn)物中，肽類化合物也占有重要的比例，海洋細(xì)菌的代謝產(chǎn)物超過56％的是肽類化合物。

孢疹病毒屬于孢疹病毒家族的成員，具有α，β，γ三個類型，其中hsv-1s屬于α型。hsv的臨床表現(xiàn)是多樣性的，一般為輕癥或無癥狀感染，但新生兒和免疫低下者能引起嚴(yán)重的感染。hsv-1主要通過呼吸道、皮膚和粘膜密切接觸感染，引起口唇、咽、眼及皮膚感染，少數(shù)則引起生殖感染。當(dāng)原發(fā)型孢疹感染后，由于其殘存的病毒長期潛存與三叉神經(jīng)(hsv-1)，當(dāng)機(jī)體體抗力降低或某些激發(fā)因素如發(fā)熱、受涼、感染等會引起復(fù)發(fā)性感染。

目前臨床主要用核苷類藥物治療單純孢疹病毒感染，適用于hsv-的原發(fā)性和復(fù)發(fā)性感染，對潛伏期則難以奏效，常用的藥物主要是阿昔洛韋及其類似藥物，選擇性高，對正常細(xì)胞毒性小，但長期使用有一定的副作用，引起接觸性皮炎等，產(chǎn)生耐藥朱，因此，開發(fā)利用新的資源，尋求更好地抗hsv藥物已勢在必行。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的第一個目的是提供具有抗hsv-1病毒活性的一個新環(huán)五肽化合物aspergillpeptided和一個新線性肽化合物aspergillpeptidee。

本發(fā)明的一個新的環(huán)五肽化合物和一個新的線性肽化合物，其結(jié)構(gòu)式如式(ⅰ)所示，

其中化合物1：命名為aspergillpeptided；化合物2：命名為aspergillpeptidee。

本發(fā)明的環(huán)五肽化合物aspergillpeptided、線性肽化合物aspergillpeptidee是通過以下方法制備的，該方法包括以下步驟：

(a)制備曲霉菌aspergillussp.scsgaf0076cctccno：m2012397的發(fā)酵液；

(b)將步驟(a)得到的發(fā)酵液用大孔樹脂吸附，接著用水沖洗大孔樹脂去掉培養(yǎng)基成分，再用甲醇或乙醇沖洗大孔樹脂得到甲醇或乙醇提取物；也可將步驟(a)得到的發(fā)酵液用乙酸乙酯、二氯甲烷或氯仿溶劑萃取，濃縮得到乙酸乙酯提取物、二氯甲烷提取物或氯仿提取物；

(c)將步驟(b)所述甲醇提取物、乙醇提取物、乙酸乙酯提取物、二氯甲烷提取物或氯仿提取物經(jīng)過正相硅膠柱層析，依次用二氯甲烷與甲醇體積比例分別為100％、90％、80％、70％、60％和50％的二氯甲烷-甲醇系統(tǒng)梯度洗脫，分別收集用二氯甲烷體積分?jǐn)?shù)為90％和60％的二氯甲烷-甲醇為洗脫劑沖洗下來的組份a，b，這兩個組分分別經(jīng)過硅膠柱和凝膠柱層析得到粗品，經(jīng)hplc純化，分別得到化合物aspergillpeptided以及化合物aspergillpeptidee。

步驟(a)中所述的發(fā)酵液可通過以下方法制備：將曲霉菌aspergillussp.scsgaf0076cctccno：m2012397接種到曲霉屬真菌適用的培養(yǎng)基中，在通常的發(fā)酵條件下制得，優(yōu)選的制備方法是將曲霉菌aspergillussp.scsgaf0076cctccno：m2012397在曲霉屬真菌適用的平板培養(yǎng)基中生長，待真菌長出孢子后，用竹簽將真菌從平板上至盛有水的三角瓶中，用移液槍將真菌液接種到培養(yǎng)基中(1l三角瓶中盛有300ml培養(yǎng)基)，于室溫靜置培養(yǎng)30天，得到發(fā)酵液，所述的培養(yǎng)基為：每升含山梨醇20g，酵母膏3g，mgso4·7h2o0.3g，味精10g，色氨酸2g，kh2po40.5g，麥芽糖20g，海鹽30g，甲醇5ml，余量為水，ph6.5。

步驟(b)所述的濃縮采用減壓濃縮。

本發(fā)明的環(huán)五肽化合物aspergillpeptided、線性肽化合物aspergillpeptidee經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn)，它們具有抗hsv-1病毒活性，其ic50值分別為9.5、19.8μm；且化合物aspergillpeptided在濃度12.5μm時也能抑制阿昔洛韋耐藥菌株hsv-1-106和hsv-1-153所致的細(xì)胞病變，抑制率約50％。

由此本發(fā)明的第三個目的是提供環(huán)物肽化合物aspergillpeptided或線性肽化合物aspergillpeptidee在制備抗病毒藥物中的應(yīng)用。

所述的抗病毒藥物優(yōu)選為抗hsv-1病毒藥物。

一種抗病毒藥物，其特征在于，含有化合物aspergillpeptided或化合物aspergillpeptidee作為活性成分。

本發(fā)明的第四個目的是提供曲霉菌aspergillussp.scsgaf0076cctccno：m2012397在制備環(huán)五肽化合物aspergillpeptided及一個線性肽化合物aspergillpeptidee中的應(yīng)用。

本發(fā)明從一株柳珊瑚共附生曲霉菌aspergillussp.scsgaf0076cctccno：m2012397的發(fā)酵液中分離得到兩個新的具有抗hsv-1病毒活性的環(huán)五肽化合物aspergillpeptided、線性肽化合物aspergillpeptidee，這些化合物具有抗hsv-1病毒活性，可以開發(fā)成具有抗hsv-1病毒的抗生素的先導(dǎo)化合物。

本發(fā)明的aspergillussp.scsgaf0076，于2012年10月11日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(cctcc)，地址：中國武漢武漢大學(xué)，其保藏編號為：cctccno：m2012397，該菌種公開于專利號：zl201210431886.6，發(fā)明名稱：一類環(huán)四肽化合物及其制備方法和在制備抗污損劑中的應(yīng)用的專利中。

具體實施方式：

以下實施例是對本發(fā)明的進(jìn)一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。

實施例1：

將山梨醇20g，酵母膏3g，mgso4·7h2o0.3g，味精10g，色氨酸2g，kh2po40.5g，麥芽糖20g，甲醇5ml，海鹽30g混合，用水定容到1l，調(diào)節(jié)ph至6.5，得到1l培養(yǎng)基，按照此方式配置培養(yǎng)基。將該培養(yǎng)基裝入約330個1000ml的三角燒瓶中，每瓶約300ml，在115℃高壓蒸汽滅菌25分鐘。

將曲霉菌aspergillussp.scsgaf0076cctccno：m2012397在曲霉屬真菌適用的平板培養(yǎng)基中生長，待真菌長出孢子后，用竹簽將真菌從平板上移至盛有水的三角瓶中，用移液槍將真菌接種到培養(yǎng)基中(1l三角瓶中盛有300ml培養(yǎng)基)，于室溫(26℃)靜置培養(yǎng)30天后，收取發(fā)酵液。

將經(jīng)上述培養(yǎng)基培養(yǎng)得到的發(fā)酵液100l用大孔樹脂吸附，接著用水沖洗大孔樹脂去掉培養(yǎng)基成分，再用乙醇(也可用甲醇)沖洗大孔樹脂得到乙醇提取物，(發(fā)酵液也可用乙酸乙酯、二氯甲烷或氯仿萃取)，減壓濃縮得到乙醇粗提物85g。乙醇粗提物用正相硅膠(100-200目)干法拌樣后，裝入玻璃層析柱(h細(xì)硅膠)，常溫減壓柱層析，依次用二氯甲烷體積分?jǐn)?shù)為100％、90％、80％、70％、60％、50％的二氯甲烷-甲醇系統(tǒng)梯度洗脫(甲醇比例不斷加大)，根據(jù)薄層層析情況合并各個流分，回收洗脫溶劑，蒸干流分用甲醇轉(zhuǎn)移。分別收集用甲醇體積分?jǐn)?shù)為90％和60％的二氯甲烷-甲醇為洗脫劑沖洗下來的組份a，b。組分a經(jīng)常壓硅膠柱層析分離(直徑3cm，柱長60cm，含h細(xì)硅膠填料)，用氯仿/甲醇(v/v100:0-50:50)為洗脫溶劑系統(tǒng)，梯度洗脫得到5個小組分，其中用氯仿/甲醇(v/v90:10)洗脫得到的組分經(jīng)反相硅膠干法拌樣后，裝入玻璃層析柱(直徑5cm，柱長50cm，含反相rp-18填料)，常溫減壓柱層析，依次用甲醇體積分?jǐn)?shù)為10％、30％、40％、50％、60％、70％、85％和100％的水-甲醇系統(tǒng)梯度洗脫(甲醇比例不斷加大)，收集甲醇體積分?jǐn)?shù)為60％的組分，經(jīng)過凝膠(直徑10mm，柱長1600mm，凝膠為sephedexlh-20，流動相為體積比1:1的甲醇-氯仿)，得粗品，粗品采用高效液相制備分離，檢測波長為280nm，流速為5ml/min，流動相為甲醇-水(v/v47:53)，色譜柱為phenomenexgemini10mm×250mm，得到化合物1(tr＝27.0min)。組分b經(jīng)正相硅膠柱層析依次用二氯甲烷體積分?jǐn)?shù)為100％、90％、80％、70％、60％、50％的二氯甲烷-甲醇系統(tǒng)梯度洗脫，收集二氯甲烷體積分?jǐn)?shù)為80％洗脫的組分，再采用反相層析柱層析依次用甲醇體積分?jǐn)?shù)為10％、30％、40％、50％、60％、70％、85％和100％的水-甲醇系統(tǒng)梯度洗脫(甲醇比例不斷加大)，收集甲醇體積分?jǐn)?shù)為45％洗脫的組分，采用高效液相制備分離，檢測波長為280nm，流速為5ml/min，流動相為乙腈-水(v/v72:28)，色譜柱為phenomenexgemini10mm×250mm，得到化合物2(tr＝30.0min)

結(jié)構(gòu)推定：

化合物1，¹h和¹³cnmr譜數(shù)據(jù)如表1所示，通過高分辨質(zhì)譜(hresims)在m/z處給出準(zhǔn)分子離子峰728.3680[m+h]⁺，結(jié)合nmr波譜數(shù)據(jù)，得知化合物的分子式為c40h49n5o8。¹³cnmr譜顯示在低場區(qū)有5個酰胺或酯羰基的碳信號(δc168.4，169.0，169.6，170.2，170.5)，在高場區(qū)有5個氨基酸的α-c信號(δc49.2，55.4，55.4，60.7，62.0)，¹hnmr譜顯示出3個酰胺質(zhì)子信號(δh8.63，6.99，6.63)，這說明該化合物是一個環(huán)肽類化合物。通過hsqc、hmbc以及h-hcosy信號，可知該化合物含有2個氧甲基酪氨酸(o-me-tyr)，氮甲基酪氨酸(n-me-tyr)，脯氨酸(pro)，纈氨酸(val)，進(jìn)一步通過hsqc、hmbc以及h-hcosy，我們推測出該化合物氨基酸片段的連接方式為val-(n-me-)tyr-(o-me-)tyr-(o-me-)tyr-pro，確定該化合物的平面結(jié)構(gòu)如式(ⅰ)示。

化合物1的絕對構(gòu)型通過marfey反應(yīng)得以確定?；痉椒ǎ孩倩衔锼?。稱取該化合物0.5mg溶于1ml的6nhcl中，115℃條件下17小時，冷卻蒸干后溶于100ul水中；②marfey反應(yīng)。100ul水樣樣品中，加1m的nahco320ul，fdaa(1％，丙酮溶解)100ul，40℃條件下1小時，冷卻后，加入20ul2mhcl，蒸干后溶于甲醇；③hplc分析。用15％-45％的乙腈/水進(jìn)行梯度洗脫，其中水相中含有0.04％tfa，流速1.0ml/min，檢測波長340nm，分析用色譜柱為ymc-packods-acolumn(250×10mm)。標(biāo)準(zhǔn)品d-ala,l-ala,d-pro,l-pro,n-me-d-tyr,n-me-l-tyr,o-me-d-tyr,o-me-l-tyr,用同樣的方法進(jìn)行上述②，③處理。最終通過比較反應(yīng)物的fdaa衍生物和標(biāo)準(zhǔn)品fdaa衍生物在hplc分析的保留時間確定為l-val,n-me-d-tyr,o-me-l-tyr,andl-pro(如式ⅰ示)，由此確定化合物1的結(jié)構(gòu)式如式(ⅰ)中的1所示，化合物1命名為aspergillpeptided。

化合物2，¹h和¹³cnmr譜數(shù)據(jù)如表2所示，通過高分辨質(zhì)譜(hresims)在m/z處給出準(zhǔn)分子離子峰467.2296[m+h]⁺，結(jié)合nmr波譜數(shù)據(jù)，確定化合物的分子式為c25h30n4o5。¹³cnmr譜顯示在低場區(qū)有3個酰胺或酯羰基的碳信號(δc161.9，171.9，173.5)，¹hnmr譜顯示出3個酰胺質(zhì)子信號(δh8.78，8.63，10.85)，這說明該化合物是一個肽類化合物，通過hsqc、hmbc以及h-hcosy信號，推測該化合物包含3個氨基酸片段，分別為纈氨酸(val)，酪氨酸(tyr)和色氨酸(trp)。進(jìn)一步通過hmbc相關(guān)信號，nh-val(δh8.63)與c＝o-trp(δc171.9)相關(guān)，nh-trp(δh8.78)與c＝o-tyr(δc161.9)相關(guān)，從而確定該化合物氨基酸的排列方式為tyr-trp-val，確定該化合物的平面結(jié)構(gòu)如式(ⅰ)示。

化合物2的絕對構(gòu)型通過上述相同的marfey反應(yīng)得以確定?；衔锼夂?，標(biāo)準(zhǔn)品d-val，l-val，d-tyr，l-tyr，d-trp，l-trp用相同的方法進(jìn)行處理，最終通過比較反應(yīng)物的fdaa衍生物和標(biāo)準(zhǔn)品fdaa衍生物在hplc分析的保留時間確定為d-val，d-tyr?；衔镏械纳彼峤?jīng)過水解后，hplc沒有檢測到色氨酸，由于l型色氨酸作為前體物質(zhì)加入到培養(yǎng)基中，所以我們推測該化合物中的色氨酸的構(gòu)型為l-trp，化合物2的結(jié)構(gòu)式如式(ⅰ)中的2所示，化合物2命名為aspergillpeptidee。

表1：化合物1的¹h和¹³c數(shù)據(jù)(500,125mhz,dmso-d6,δppm)

表2：化合物2的¹h和¹³c數(shù)據(jù)(500,125mhz,dmso-d6,δppm)

實施例2：環(huán)五肽類化合物aspergillpeptided、線性肽化合物aspergillpeptidee的抗hsv-1病毒活性測試

通過采用mtt法觀察樣品對vero細(xì)胞的細(xì)胞毒性、以及細(xì)胞病變效應(yīng)法(cpe法)測試樣品對單純皰疹病毒(hsv-115577)菌株、阿昔洛韋耐藥菌株hsv-1-106、以及阿昔洛韋耐藥菌株hsv-1-153所致細(xì)胞病變的抑制作用，了解aspergillpeptided和aspergillpeptidee的抗單純皰疹病毒ⅰ型(hsv-ⅰ)作用。細(xì)胞病變效應(yīng)法簡述如下：(1)vero細(xì)胞以1.5*10⁵個/ml接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，100ug/孔，置37度，5％co2，培養(yǎng)24h長成單層。(2)棄生長培養(yǎng)液，將不同濃度的環(huán)五肽類化合物aspergillpeptided、線性肽化合物aspergillpeptidee與hsv-1病毒稀釋液(100tcid50)等體積混合后加至單層細(xì)胞，每個濃度設(shè)4個復(fù)孔，同時設(shè)陽性藥物阿昔洛韋(acv)對照組、正常細(xì)胞對照組及病毒對照組。(3)37℃，5％co2繼續(xù)培養(yǎng)48h。(4)48h后，光鏡下觀察，記錄細(xì)胞病變效應(yīng)(cpe)。細(xì)胞病變程度評價：0～25％為+，26％～50％為++，51％～75％為+++，76％～100％為++++。詳細(xì)實驗方法參考文獻(xiàn)(j.ethnopharm.2002,79,205–211)所述。

實驗結(jié)果顯示，細(xì)胞毒活性測試表明化合物aspergillpeptided和aspergillpeptidee抑制宿主vero細(xì)胞生長的最大無毒濃度tc0分別為81.9,153.2μm；在它們的最大無毒濃度下，化合物aspergillpeptided和aspergillpeptidee抗hsv-1病毒的ic50值分別為9.5、19.8μm；此外，化合物aspergillpeptided在濃度12.5μm時也能抑制阿昔洛韋耐藥菌株hsv-1-106和hsv-1-153所致的細(xì)胞病變，抑制率約50％。陽性對照阿昔洛韋抗hsv-1病毒的ic50值為3.0μm，抑制宿主vero細(xì)胞生長的最大無毒濃度tc0為>1000μm。雖然aspergillpeptided和aspergillpeptidee的抗hsv-1病毒活性不如阿昔洛韋，但它們不屬于阿昔洛韋系列的核苷類化合物，作用機(jī)制將與阿昔洛韋不同，且化合物aspergillpeptided對阿昔洛韋耐藥菌株hsv-1-106和hsv-1-153也有較好抑制作用。由此可見aspergillpeptided、aspergillpeptidee具有較好抗hsv-1病毒活性。