本發(fā)明涉及微生物及生物降解領(lǐng)域，具體地，涉及一種赤紅球菌(rhodococcusruber)yc-yt1及其應用。

背景技術(shù)：

鄰苯二甲酸酯(phthalateacidesters，簡稱paes)，又稱酞酸酯，是鄰苯二甲酸形成的酯類統(tǒng)稱。鄰苯二甲酸酯是一類以人工合成為主要來源的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，主要用于制備聚氯乙烯材料，起到增塑劑的作用。作為增塑劑，paes在塑料制品中的含量占20％～30％左右，甚至高達50％。自上世紀50年代聚氯乙烯(pvc)面世以來，paes就得到大規(guī)模的生產(chǎn)。目前，它占據(jù)全球增塑劑市場80％份額以上。除了作為增塑劑外，paes還廣泛用于油漆、粘合劑、驅(qū)蟲劑、化妝品、香料和潤滑劑的生產(chǎn)原料。在德國，每年paes的消耗達到四十萬噸，全球每年paes的使用量在820萬噸以上，其中1％以上通過滲漏進入環(huán)境。目前，paes在全球主要工業(yè)國的生態(tài)環(huán)境中已普遍檢出。paes已成為全球最常見的污染物之一。因此，如何實現(xiàn)對環(huán)境中鄰苯二甲酸酯類污染物的高效降解，成為亟待解決的問題。

鄰苯二甲酸酯共有30多種，大多是無色透明的油狀液體,一般難溶于水,易溶于有機溶劑,屬中等極性物質(zhì),可通過呼吸、飲食和皮膚接觸進入人和動物體內(nèi)。鄰苯二甲酸酯對人體健康的影響是一個慢性的過程,需要較長的時間才會出現(xiàn),而且可能通過胎盤和授乳產(chǎn)生跨代影響,所以目前主要通過動物實驗對其毒性進行研究。動物實驗表明,鄰苯二甲酸酯急性毒性不大,對ames試驗(污染物致突變性檢測)呈陰性反應,但在大劑量情況下,對動物有致畸、致癌和致突變作用。其亞急性毒性主要表現(xiàn)為損害肝、腎、睪丸,抑制精子形成,影響生殖機能等。鄰苯二甲酸酯含有較弱的雌性荷爾蒙活性成分。近來的研究指出，paes主要的危害在于環(huán)境激素作用，可在極低的濃度下干擾人和動物的內(nèi)分泌系統(tǒng)。其對內(nèi)分泌系統(tǒng)的擾亂是通過雌激素受體(estrogenreceptor)介導的反應，通過與雌激素受體結(jié)合，作用于dna中雌激素反應元件(estrogenrespoponsiveelement)激活基因的轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生雌激素效應。動物實驗表明，作為內(nèi)分泌干擾物，paes的生化效應表現(xiàn)為過氧化酶體增生、足細胞毒性、肝臟促進作用、抗雄激素、體外雌激素活性等。對動物生殖方面的擾亂主要是使精囊萎縮、精子數(shù)量減少以至于精子形成中止、生殖能力下降、后代數(shù)量減少、體重下降、子宮粘膜組織增生等。具有環(huán)境激素作用的鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)有十幾種，其中鄰苯二甲酸二甲酯(dmp)、鄰苯二甲酸二乙酯(dep)、鄰苯二甲酸二丙酯(dipropylphtalate，dpp)、鄰苯二甲酸二正丁酯(dbp)、鄰苯二甲酸二辛酯(dioctylphthalate，dop)和鄰苯二甲酸二(2-乙基已基)酯(dehp)屬于美國環(huán)保局認定的優(yōu)先污染物。

paes在環(huán)境中的水解、光解的速率十分緩慢，微生物降解是其礦化的主要途徑。近年來，paes的細菌降解已經(jīng)得到廣泛的研究，大量高效降解paes的菌株已經(jīng)從各類環(huán)境中分離得到。同時，細菌對paes的代謝途徑和鄰苯二甲酸降解的遺傳機制也得到深入的研究。但是對其降解的遺傳機制的研究主要集中在對參與從鄰苯二甲酸到原兒茶酚降解的酶基因進行克隆和鑒定，尚未深入到蛋白方面的研究；并且對于從鄰苯二甲酸酯到鄰苯二甲酸兩步脫酯過程中涉及到的酶基因研究較少。而且目前缺少在實際環(huán)境中應用的報道，例如工業(yè)廢水的環(huán)境條件比較苛刻，高鹽，極端ph，污染物種類豐富等，這些都對微生物的耐受性提出了更高的要求。因此，尋找在高鹽濃度下依然保持對多種鄰苯二甲酸酯類污染物的降解能力的菌株對于治理環(huán)境污染具有重要的經(jīng)濟價值和現(xiàn)實意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一株能夠降解鄰苯二甲酸酯的赤紅球菌yc-yt1及其在鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)降解中的應用。

本發(fā)明的菌株yc-yt1是從廣東省深圳市南山區(qū)西麗鎮(zhèn)新圍村旺棠工業(yè)區(qū)附近水渠中分離到一株能夠降解鄰苯二甲酸二(2-乙基已基)酯(dehp)、鄰苯二甲酸二環(huán)己酯(dchp)、鄰苯二甲酸二甲酯(dmp)、鄰苯二甲酸二正丁酯(dbp)、鄰苯二甲酸二乙酯(dep)等多種鄰苯二甲酸酯的細菌。

在電鏡下觀察(圖1)，該菌形態(tài)細胞多樣，從圓球狀萌芽成短桿狀，無鞭毛，無芽孢。菌落呈圓形，邊緣光滑，粘質(zhì)色素為橙黃色素(圖2)。菌株革蘭氏染色、過氧化氫酶活性及脲酶反應均為陽性；氧化酶活性和吲哚反應為陰性。基于形態(tài)特征、生理生化特征，將該菌株鑒定為赤紅球菌rhodococcusruber，命名為yc-yt1。該菌株于2017年3月31日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱cgmcc，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號為cgmccno.13959，分類名為赤紅球菌rhodococcusruber。

本發(fā)明提供了含有赤紅球菌yc-yt1的菌劑。

本發(fā)明提供了含有赤紅球菌yc-yt1的生物清潔劑。

本發(fā)明提供了赤紅球菌yc-yt1或含有其的菌劑或含有其的生物清潔劑在清潔環(huán)境中的應用。

進一步，本發(fā)明提供了赤紅球菌yc-yt1或含有其的菌劑或含有其的生物清潔劑在降解污染物中的應用。

其中，所述的有機污染物為鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)。所述鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)包括鄰苯二甲酸二(2-乙基已基)酯(dehp)、鄰苯二甲酸二環(huán)己酯(dchp)、鄰苯二甲酸二甲酯(dmp)、鄰苯二甲酸二乙酯(dep)、鄰苯二甲酸二丁酯(dbp)、鄰苯二甲酸二丙酯(dprp)、鄰苯二甲酸丁基芐基酯(bbp)、鄰苯二甲酸二戊酯(dap)、鄰苯二甲酸二已酯(dhp)、鄰苯二甲酸二庚酯(dhpp)、鄰苯二甲酸二辛酯(dop)、鄰苯二甲酸二壬酯(dnp)、鄰苯二甲酸二癸酯(ddp)。

本發(fā)明進一步提供所述赤紅球菌yc-yt1在制備鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)的生物降解劑中的應用。

本發(fā)明提供了赤紅球菌yc-yt1在制備生物清潔劑中的應用。

本發(fā)明的赤紅球菌yc-yt1在模擬廢水處理中，可將無機鹽離子培養(yǎng)基(含70g/lnacl)中同時含有的dehp、dchp、dmp、dbp和dep高效降解，7天內(nèi)降解率均在90％以上。

本發(fā)明的赤紅球菌yc-yt1可將無機鹽離子培養(yǎng)基中各100mg/l的dehp、dprp和bbp完全降解，對菌株進行連續(xù)轉(zhuǎn)接測定降解能力，表明該菌降解能力穩(wěn)定。該菌對于鹽離子濃度、ph和溫度具有較寬的耐受范圍，能分別在nacl濃度為0-70g/l，80-120g/l的無機鹽離子培養(yǎng)基中含有的100mg/l的dehp在3天內(nèi)的降解率大于98％和85％；在ph4-10的范圍內(nèi)能夠高效降解dehp，當ph5.0-10.0時，對無機鹽離子培養(yǎng)基中100mg/l的dehp在3天內(nèi)的降解率為100％，能在10～50℃溫度范圍內(nèi)高效降解dehp，16℃和30℃條件下，60h內(nèi)可完全降解無機鹽離子培養(yǎng)基中100mg/l的dehp。當nacl濃度大于120g/l，或溫度高于50℃，或ph大于11或小于4時，dehp降解被顯著抑制。

本發(fā)明提供的赤紅球菌yc-yt1及其菌劑在使用過程中無污染，無公害，能夠應用于多種鄰苯二甲酸酯類環(huán)境污染的生物修復及具有較高濃度鄰苯二甲酸酯生產(chǎn)廢水的處理，降解譜廣，可在較低和較高溫度下進行生物修復，可廣泛應用于環(huán)境土壤清潔領(lǐng)域及工業(yè)廢水的清潔處理，具有較好的經(jīng)濟價值和應用前景。

附圖說明

圖1為本發(fā)明赤紅球菌yc-yt1在電鏡下的形態(tài)結(jié)構(gòu)圖。

圖2為本發(fā)明赤紅球菌yc-yt1在lb固體培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)。

圖3為本發(fā)明赤紅球菌yc-yt1的16srrna基因系統(tǒng)發(fā)育樹圖。

圖4為本發(fā)明赤紅球菌yc-yt1在含不同鄰苯二甲酸酯底物的無機鹽離子培養(yǎng)基中對100mg/ldehp的降解率。

圖5為本發(fā)明實例2中的gc法檢測赤紅球菌yc-yt1對濃度分別100mg/l的ddp、dnp、dop、dchp、dehp、bbp、dhpp、dhp、dap、dbp、dprp、dep、dmp的降解能力。

圖6a為本發(fā)明實施例2中的ddp、dop、dbp、dpep和dhp濃度與302nm處吸收峰面積關(guān)系標準曲線圖；圖6b為本發(fā)明實施例2中的dmp、dep、dprp和dnp濃度與302nm處吸收峰面積關(guān)系標準曲線圖；圖6c為本發(fā)明實施例2中的bbp、dehp、dchp和dhpp濃度與302nm處吸收峰面積關(guān)系標準曲線圖。

圖7為本發(fā)明赤紅球菌yc-yt1在不同ph的無機鹽離子培養(yǎng)基中對100mg/ldehp的降解率。

圖8a和圖8b為本發(fā)明實施例2中赤紅球菌yc-yt1在不同氯化鈉濃度的無機鹽離子培養(yǎng)基中對100mg/ldehp的降解率。

圖9為本發(fā)明實施例2中赤紅球菌yc-yt1在不同溫度濃度的無機鹽離子培養(yǎng)基中對100mg/ldehp的降解率。

具體實施方式

以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。

若未特別指明，實施例中所用的化學試劑均為常規(guī)市售試劑，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。

本申請使用的無機鹽培養(yǎng)基具有以下組成：1.0g/lnh4no3,0.5g/lnacl,0.5g/l(nh4)2so4,0.5g/lkh2po4,1.5g/lk2hpo4和0.005g/l酵母提取物，ph＝7.0±0.2。

斜面培養(yǎng)基：10.0g/l蛋白胨，5.0g/lnacl，10.0g/l酵母提取物，ph＝7.0±0.2。

平板培養(yǎng)基為相應的培養(yǎng)基中加入1.5％的瓊脂。

實施例1赤紅球菌yc-yt1的分離和鑒定

1、菌株的分離

活性污泥樣品采集于廣東省深圳市南山區(qū)西麗鎮(zhèn)新圍村旺棠工業(yè)區(qū)附近水渠。在無菌操作條件下，將10g活性污泥樣品接種到用100ml含100mg/ldehp的無機鹽離子培養(yǎng)基中，在30℃，180rpm條件下培養(yǎng)。每培養(yǎng)7天后，取培養(yǎng)體積的5％轉(zhuǎn)接至新鮮無機鹽培養(yǎng)基中，且每次將dehp的濃度提高100mg/l，連續(xù)轉(zhuǎn)接3次，直至無機鹽培養(yǎng)基中dehp濃度提高到300mg/l。

將馴化后的菌液劃線到含有100mg/ldehp的無機鹽培養(yǎng)基平板上，30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天。挑取在平板上的單菌落進行劃線后培養(yǎng)，重復三次，直至分離獲得純化的菌株。挑取純化后的單菌落轉(zhuǎn)接到含濃度為100mg/ldehp的無機鹽液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天，將生長好、傳代穩(wěn)定且降解能力較好的菌株進行斜面保存。菌株命名為yc-yt1。

2、菌株的形態(tài)學特征

該菌為革蘭氏染色陽性，圓形萌芽成短桿菌，形態(tài)多樣，無鞭毛，無芽孢(見圖1)；在lb培養(yǎng)基上菌落為橙黃色，濕軟，圓形凸起，邊緣規(guī)整，不透明，表面光滑(見圖2)。

3、16srdna鑒定

將菌株yc-yt1接種到lb培養(yǎng)基中，30℃、180rpm條件下過夜培養(yǎng)，取3ml菌液，離心收集菌體，用細菌基因組提取試劑盒提取基因組dna，得到的基因dna用0.8％瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

設計用于擴增16srdna序列的一對通用引物：27f5'-agagtttgatcctggctcag-3'和1492r5'-ggttaccttgttacgactt-3'，用基因組dna作為模板，加入premixtaq^tm，進行pcr擴增，pcr產(chǎn)物用0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用dna純化回收試劑盒純化，連接到pgm-t載體上，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌dh5α感受態(tài)細胞中，涂布到含有氨芐青霉素的lb固體培養(yǎng)基平板上，在37℃下培養(yǎng)12h，挑取白色菌落至液體lb培養(yǎng)基中，37℃、180rpm振蕩培養(yǎng)過夜，用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，送上海生工生物公司進行測序。將該序列在ncbi網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上進行blast比對分析，并利用mega6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)可知，菌株yc-yt1為紅球菌，與目前已發(fā)表的赤紅球菌序列具有較高相似性。

4、biolog鑒定

將菌株yc-yt1接種到lb培養(yǎng)基平板中，30℃條件下倒置培養(yǎng)5天，挑單菌落到biologa液和b液中，分別使液體的透光率由100％降至98％和95％，然后按照每孔100μl將a液、b液分別加入biolog培養(yǎng)板中，30℃培養(yǎng)33h，用biolog微生物鑒定儀進行檢測分析，結(jié)果顯示yc-yt1為赤紅球菌(rhodococcusruber)。

綜合菌體形態(tài)、16srdna基因序列以及biolog結(jié)果，菌株yc-yt1被鑒定赤紅球菌(rhodococcusruber)。

綜合菌體形態(tài)、生理生化特性和16srdna基因序列，菌株yc-yt1被鑒定為赤紅球菌(rhodococcusruber)。該菌株yc-yt1于2017年03月31日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱cgmcc，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號為cgmccno.13959，分類名為赤紅球菌rhodococcusruber。

實施例2赤紅球菌yc-yt1的降解性能試驗

1、赤紅球菌yc-yt1對濃度為100mg/l的鄰苯二甲酸二(2-乙基已基)酯(dehp)、鄰苯二甲酸二丙酯(dprp)、鄰苯二甲酸丁基芐基酯(bbp)、鄰苯二甲酸二甲酯(dmp)、鄰苯二甲酸二乙酯(dep)、鄰苯二甲酸二丁酯(dbp)、鄰苯二甲酸二戊酯(dap)、鄰苯二甲酸二已酯(dhp)、鄰苯二甲酸二庚酯(dhpp)、鄰苯二甲酸二環(huán)已酯(dchp)、鄰苯二甲酸二辛酯(dop)、鄰苯二甲酸二壬酯(dnp)、鄰苯二甲酸二癸酯(ddp)的降解能力見圖4。

高效氣相色譜法檢測赤紅球菌yc-yt1對無機鹽培養(yǎng)基中鄰苯二甲酸二(2-乙基已基)酯(dehp)、鄰苯二甲酸二丙酯(dprp)、鄰苯二甲酸丁基芐基酯(bbp)、鄰苯二甲酸二甲酯(dmp)、鄰苯二甲酸二乙酯(dep)、鄰苯二甲酸二丁酯(dbp)、鄰苯二甲酸二戊酯(dap)、鄰苯二甲酸二已酯(dhp)、鄰苯二甲酸二庚酯(dhpp)、鄰苯二甲酸二環(huán)已酯(dchp)、鄰苯二甲酸二辛酯(dop)、鄰苯二甲酸二壬酯(dnp)、鄰苯二甲酸二癸酯(ddp)具有同時降解作用。

將菌株yc-yt1接種到液體lb培養(yǎng)基中活化，培養(yǎng)到對數(shù)生長期od600＝0.8，按照體積比5％的接種量接種到同時含鄰苯二甲酸二(2-乙基已基)酯(dehp)、鄰苯二甲酸二丙酯(dprp)、鄰苯二甲酸丁基芐基酯(bbp)鄰苯二甲酸二甲酯(dmp)、鄰苯二甲酸二乙酯(dep)、鄰苯二甲酸二丁酯(dbp)、鄰苯二甲酸二戊酯(dap)、鄰苯二甲酸二已酯(dhp)、鄰苯二甲酸二庚酯(dhpp)、、鄰苯二甲酸二環(huán)已酯(dchp)、鄰苯二甲酸二辛酯(dop)、鄰苯二甲酸二壬酯(dnp)、鄰苯二甲酸二癸酯(ddp)各100mg/l混合物的無機鹽培養(yǎng)基中，作為處理組，以未接種菌株的含鄰苯二甲酸二(2-乙基已基)酯(dehp)、鄰苯二甲酸二丙酯(dprp)、鄰苯二甲酸丁基芐基酯(bbp)、鄰苯二甲酸二甲酯(dmp)、鄰苯二甲酸二乙酯(dep)、鄰苯二甲酸二丁酯(dbp)、鄰苯二甲酸二戊酯(dap)、鄰苯二甲酸二已酯(dhp)、鄰苯二甲酸二庚酯(dhpp)、鄰苯二甲酸二環(huán)已酯(dchp)、鄰苯二甲酸二辛酯(dop)、鄰苯二甲酸二壬酯(dnp)、鄰苯二甲酸二癸酯(ddp)各100mg/l混合物的無機鹽培養(yǎng)基作為對照組，對照組與處理組各設三個重復。將對照組與處理組在30℃條件下，180rpm搖床振蕩避光培養(yǎng)，在培養(yǎng)的第7天停止培養(yǎng)并測定每種物質(zhì)的濃度。

向取得的樣品中加入等體積的正已烷超聲波充分振蕩抽提10分鐘，靜置1小時，取上層有機溶劑，將有機溶劑揮發(fā)干后，用等體積的甲醇重溶，然后用0.22μm的有機系濾膜過濾，進行g(shù)c分析。

gc分析條件為：shimadzugc-2010高效氣相色譜儀，儀器配置為：rtx-1301毛細管柱(30.0m×0.25mm×0.25μm)與離子捕獲檢測器(ecd)，檢測條件：樣品進口溫度300℃，檢測器溫度300℃，柱箱溫度280℃，載氣為氮氣(純度≥99.999％，流速為30ml/min)，＝進樣體積1.0μl，使用軟件gcsolution(v2.32.00,shimadzu)對結(jié)果進行分析，確定ddp、dnp、dop、dchp、dehp、bbp、dhpp、dhp、dap、dbp、dprp、dep、dmp的保留時間分別為：16.358min、14.173min、12.296min、9.995min、9.608min、8.161min、7.732min、6.393min、5.377min、4.575min、3.970min、3.624min、3.515min；(圖5)；鄰苯二甲酸酯標準品繪制濃度與302nm處吸收峰面積之間的標準曲線(圖6a-圖6c)。

降解率的計算：根據(jù)不同底物的標準曲線計算每種底物在無機鹽培養(yǎng)基中每天的殘留濃度，再根據(jù)降解率計算公式得到菌株yc-yt1對底物的降解率(表1)。

降解率％＝(對照組中底物的終濃度-處理組中底物的終濃度)/對照組中底物的終濃度×100％

自然降解率％＝(底物初始濃度-對照組中底物濃度)/底物初始濃度×100％

表1各菌株yc-yt1對種底物的降解率與底物的自然降解率

2、赤紅球菌yc-yt1對ph的耐受

分別配制不同ph值(4、5、6、7、8、9、10)的無機鹽離子培養(yǎng)基，滅菌備用。向配制的無機鹽離子培養(yǎng)基中分別加入dehp至底物濃度100mg/l。將菌株yc-yt1接種到液體lb培養(yǎng)基中活化，培養(yǎng)到對數(shù)生長期od600＝0.8，按照體積比5％的接種量接種到上述培養(yǎng)基中，作為處理組，30℃，180rpm搖床振蕩避光培養(yǎng)。

以未接種菌株不同ph的同時加入dehp至濃度為100mg/l的相同培養(yǎng)基作為對照組，同樣在30℃，180rpm搖床振蕩避光培養(yǎng)，培養(yǎng)3天后測定溶液中dehp濃度并計算降解率。

圖7為3天內(nèi)不同ph條件下赤紅球菌yc-yt1對dehp降解率。當ph值從4.0增加到5.0，dehp的降解率逐漸由40％增加到99％以上。當ph值由7.0升高到8.0時，yc-yt1對dehp的降解效率由100％逐漸降低至90％。當ph值大于8，ph＝9或10.0時，yc-yt1對dehp的降解率又回升至最高值100％。

3、赤紅球菌yc-yt1對鹽濃度耐受能力

分別配制不同nacl濃度(1、3、5、7、10、15、20、25、40、50、60、70、80、90、100、110和120g/l)的無機鹽離子培養(yǎng)基，滅菌備用。向配制的無機鹽離子培養(yǎng)基分別加入dehp至底物濃度100mg/l。將菌株yc-yt1接種到液體lb培養(yǎng)基中活化，培養(yǎng)到對數(shù)生長期od600＝0.8，按照體積比5％的接種量接種到上述培養(yǎng)基中，作為處理組，30℃，180rpm搖床振蕩避光培養(yǎng)。

以未接種菌株的含有不同nacl濃度同時加入dehp至濃度為100mg/l的相同無機鹽離子培養(yǎng)基作為對照組，同樣在30℃下，180rpm搖床振蕩避光培養(yǎng)。培養(yǎng)60小時后測定溶液中dehp濃度，并計算降解率。

圖8a和圖8b為60小時內(nèi)不同鹽濃度條件下，赤紅球菌yc-yt1對dehp的降解率。結(jié)果顯示，當nacl濃度在1～100g/l之間時，60小時內(nèi)菌株對dehp的降解率在90-98％，當nacl濃度為110g/l時，底物降解率下降至60％；當nacl濃度提高至120g/l時，底物降解率又回升至85％以上。由此說明，菌株yc-yt1具有較好的耐鹽能力，能在較高鹽濃度(≤100g/l)條件下高效降解dehp。當nacl濃度達到一定濃度時，菌株自身代謝調(diào)控系統(tǒng)做出一定的調(diào)整，以便適應更極端的環(huán)境條件。

4、赤紅球菌yc-yt1對溫度耐受能力

將菌株yc-yt1接種到液體lb培養(yǎng)基中活化，培養(yǎng)到對數(shù)生長期od600＝0.8，按照體積比5％的接種量接種無機鹽離子培養(yǎng)基(dehp濃度為100mg/l)中，分別在10℃、16℃、30℃、40℃、50℃條件下，180rpm搖床振蕩避光培養(yǎng)。

以未接種菌株的含100mg/ldehp的相同無機鹽離子培養(yǎng)基作為對照組，同樣在10℃、16℃、30℃、40℃、50℃條件下，180rpm搖床振蕩避光培養(yǎng)60小時后測定溶液中dehp濃度并計算降解率。

圖9為60小時內(nèi)赤紅球菌yc-yt1在不同溫度條件下對dehp的降解率。10℃時，降解率可達為90％以上，說明菌株可耐受較低的溫度條件，菌株所分泌的降解酶或許是低溫啟動溫；隨著溫度升高至30℃，dehp降解率能達到最大值100％；當溫度升高到40-50℃時，降解率有所下降，但降解率仍可達到90％以上，由此說明，菌株yc-yt1對溫度的耐受范圍很廣，低溫和高溫條件均有較高降解率。

實施例3赤紅球菌yc-yt1對含多種鄰苯二甲酸酯廢水處理中的應用

本實施例中使用含70g/lnacl的無機鹽離子培養(yǎng)基(未滅菌)作為模擬廢水(以下簡稱“廢水”)，利用5.0l的發(fā)酵罐(bioflo115，newbrunswickscientificco.,nj,usa)進行模擬廢水處理。將赤紅球菌yc-yt1在lb液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期(od600＝0.8，菌體濃度約為1.6×10⁸cfu/ml)，向廢水中加入制備的菌液至終濃度分別為8×10⁷cfu/l、1.6×10⁸cfu/l、3.2×10⁸cfu/l、4.8×10⁸cfu/l、6.4×10⁸cfu/l和8.0×10⁸cfu/l廢水(每個處理為2l廢水)，并向廢水中同時加入dehp、dprp、dbp、dop和bbp至各濃度為100mg/l，作為處理組；同時，以相同條件下加入相同濃度污染物底物且不接菌的廢水作為對照組。攪拌轉(zhuǎn)速為150rpm，通氣比為0.8(空氣)，培養(yǎng)溫度為30℃。反應液ph值和溶氧量(do)通過反應器的操作系統(tǒng)監(jiān)測。在處理的第7天取樣測定各種底物濃度。對照組與處理組均進行3次重復。

取樣方法：每次處理結(jié)束后，向發(fā)酵罐中加入2l正己烷，利用發(fā)酵罐的馬達進行攪拌，1小時后靜置30分鐘(整個過程中關(guān)閉發(fā)酵罐所有管路)，取20ml上層有機相用于各底物濃度檢測。根據(jù)最終測定處理組與對照組中底物的濃度計算菌株yc-yt1對廢水中各底物的降解率。

赤紅球菌yc-yt1對廢水中各底物的降解率如表2所示，隨著加入菌體量的增加各種底物的降解率逐漸提高，當接菌量達到4.8×10⁸cfu/l廢水時，各底物的降解率基本達到最大值。

表2赤紅球菌yc-yt1對廢水中各底物的降解率

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。

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<110>中國農(nóng)業(yè)科學院研究生院

<120>一種能夠降解鄰苯二甲酸酯的赤紅球菌及其應用

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