本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及與甘藍(lán)葉片表皮毛有無緊密相關(guān)的分子標(biāo)記及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

植物表皮毛是從其各個(gè)器官表皮延伸出來的毛狀結(jié)構(gòu)，它們行使著多種功能，包括保護(hù)植物免受病原體、食草動(dòng)物、紫外線輻射、以及干旱和冰凍的侵害。表皮毛廣泛存在于蕓薹屬物種，如白菜、甘藍(lán)型油菜和芥菜中一些類型和品種。甘藍(lán)的某些野生類型(比如brassicaincana和b.villosa)長(zhǎng)期生在在嚴(yán)苛的自然環(huán)境中，也保留了植株表皮毛的特征，表明表皮毛對(duì)于其生存能力的積極作用。然而目前的所有栽培甘藍(lán)類型均表現(xiàn)為無表皮毛，比如結(jié)球甘藍(lán)、花椰菜、西蘭花、羽衣甘藍(lán)、芥藍(lán)、抱子甘藍(lán)等。利用野生甘藍(lán)資源培育具有表皮毛的栽培甘藍(lán)，對(duì)提高栽培甘藍(lán)的抗蟲、抗病、耐干旱及凍害能力，減少農(nóng)藥施用量與成本投入都有積極意義。

在模式之物擬南芥中，表皮毛的形成主要受到ttg1-gl1-gl3三聚體復(fù)合激活因子激活，但同時(shí)受到一些反向調(diào)節(jié)因子的調(diào)節(jié)，如try和cpc等。上述激活因子與反向調(diào)控因子共同作用并形成了一個(gè)反饋調(diào)節(jié)循環(huán)機(jī)制，在這個(gè)循環(huán)中，激活子相關(guān)基因的表達(dá)可激活抑制因子的表達(dá)，但激活子的表達(dá)同時(shí)又受到抑制因子的調(diào)控。此外，在蛋白水平，try或者cpc還可取代gl1蛋白與gl3結(jié)合，從而使這個(gè)復(fù)合三聚物失活。

目前通過圖位克隆技術(shù)已經(jīng)確認(rèn)白菜的ttg1是白菜表皮毛形成的調(diào)節(jié)因子(zhangetal.,2009)，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)gl1基因與白菜和油菜葉片的表皮毛有關(guān)(lietal.,2011；gruberetal.,2006)，但還沒有鑒定控制野生甘藍(lán)b.incana表皮毛的基因。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為甘藍(lán)品種選育提供一種新選擇。

本發(fā)明的技術(shù)方案是甘藍(lán)葉片表皮毛有無緊密相關(guān)的分子標(biāo)記boltrichome-caps01，具有如seqidno.1所示的核苷酸序列。

該分子標(biāo)記總長(zhǎng)659bp，snp出現(xiàn)在378bp，下劃線所示為snp，無毛甘藍(lán)為a，有毛甘藍(lán)為g。酶切位點(diǎn)在373-374bp之間。該分子標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物在酶切時(shí)所使用的限制性內(nèi)切酶為xagi(又叫econi)。

ttaaaatttggaagatggaggcaagaaatgtgtgttgtttctcatgatccaatatctctctatctccacagcttttcttcccggtactcttcctgctattatttcccacctggtattttgcaagaaaacatttttctctctaagaatggaaatacataagtaaataataaaatgtttgatacaagtgattagcttggatcccattctgcttattaagctaagaagtccctaagcgtagcaaaaagttaaaaaaaaaaacacctagacactaaaacttaggtctagtagttcctaattaatgaaactacgtacaaactataactaattagaacaagaacatgaagcagcaattgaaagatcaagtaggcctaagagagagcaaggacacttagaccagaaggcgatggtgattcaaaaggtcactctgaaacgacaagaacgattttcttcatcatcaggagatggttattttttttttttgtttgttcaacagatcatcaggcgatggtaagcgtaagaatataagtacattcctatgtcatatgttttgtggtaaagtcgttacatctaattttgggagagaaagaaattaaaagaagatacgtacctatcgcctacgagtctgtacattcttaagatgagatcttcctcctgttggc

本發(fā)明還提供了甘藍(lán)葉片表皮毛有無緊密相關(guān)的分子標(biāo)記boltrichome-caps01的正向引物，其正向引物序列具有如seqidno.2所示的核苷酸序列(5’-ttaaaatttggaagatggaggc-3’)，反向引物序列具有如seqidno.3所示的核苷酸序列(5’-gccaacaggaggaagatctca-3’)。

本發(fā)明還提供了甘藍(lán)品種的鑒定方法，包括如下步驟：以待鑒定品種的基因組dna為模板，擴(kuò)增分子標(biāo)記boltrichome-caps01，采用限制性內(nèi)切酶xagi酶切擴(kuò)增產(chǎn)物，酶切結(jié)果進(jìn)行電泳，電泳后出現(xiàn)659-bp的單一條帶的為無表皮毛的純合品種，出現(xiàn)276-bp和373-bp兩條帶為有表皮毛的純合品種，同時(shí)出現(xiàn)659-bp、276-bp和373-bp三種條帶的為無表皮毛的雜合品種；所述的擴(kuò)增分子標(biāo)記的引物對(duì)具有如seqidno.2和seqidno.3所示的核苷酸序列。

本發(fā)明還提供了所述的分子標(biāo)記在甘藍(lán)育種中的用途。

本發(fā)明還提供了所述的分子標(biāo)記在選育不同表皮毛性狀的甘藍(lán)品種中的用途。

本發(fā)明還提供了所述的分子標(biāo)記引物在甘藍(lán)育種中的用途。

本發(fā)明還提供了所述的分子標(biāo)記引物在選育不同表皮毛性狀的甘藍(lán)品種中的用途。

本發(fā)明還提供了所述甘藍(lán)品種的鑒定方法在甘藍(lán)育種中的用途。

本發(fā)明還提供了所述甘藍(lán)品種的鑒定方法在選育不同表皮毛性狀的甘藍(lán)品種中的用途。

本發(fā)明的有益效果：

該分子標(biāo)記可直接在甘藍(lán)表皮毛育種中應(yīng)用。通過表皮毛相關(guān)分子標(biāo)記的早期鑒定和輔助選擇，可盡早確認(rèn)純合的有毛個(gè)體，并選擇出雜合個(gè)體進(jìn)入下一輪選擇，減輕田間材料的種植規(guī)模和后期鑒定工作，有效提高選擇的效率和準(zhǔn)確性。

附圖說明

圖1為甘藍(lán)表皮毛性狀snp芯片分析結(jié)果及候選基因位置

上圖表示c01染色體的δ(snp-index)分布情況，紅色虛線表示p＝0.001顯著水平時(shí)的閾值；下圖展示表皮毛候選區(qū)間(灰色)及候選基因botry在c01染色體上的位置。

圖2為功能標(biāo)記所使用限制性內(nèi)切酶xagi的酶切位點(diǎn)示意圖；圖中序列是基因botry中含snp的那部分序列，這個(gè)snp的存在恰好使有毛的這段序列可以被酶切開，而無毛的不能被切開。

c01(有毛)aaagatcaagtaggcctaagagagggcaaggacacttagaccagaaggcgc41(無毛)aaagatcaagtaggcctaagagagagcaaggacacttagaccagaaggcg

c01為有毛甘藍(lán)親本，c41為無毛甘藍(lán)親本，序列中白色背景表示雙親snp位點(diǎn)，線條指示序列為xagi可識(shí)別的堿基序列，黑色倒三角代表酶切位點(diǎn)。

圖3為功能標(biāo)記在有毛和無毛甘藍(lán)中的檢測(cè)情況示意圖

m代表marker，c01代表有毛甘藍(lán)親本，c41代表無毛甘藍(lán)親本，f1代表雜種f1，undigested表示沒有被酶切。

具體實(shí)施方式

以下為本發(fā)明方法的一種具體實(shí)施方式，但并不是對(duì)本發(fā)明方法的限定，任何不超離本發(fā)明實(shí)質(zhì)內(nèi)容的變換，仍應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1分子標(biāo)記的獲得

一份無毛甘藍(lán)c41(b.oleraceavar.alboglabra，從荷蘭種質(zhì)資源庫(kù)征集，征集編號(hào)cgn17275)與一份有毛野生甘藍(lán)b.incana(從德國(guó)植物遺傳與作物研究所征集，征集編號(hào)bra1166)發(fā)展的f2分離群體為例，詳細(xì)說明獲得與表皮毛有無精密相關(guān)分子標(biāo)記的方法，具體如下：

(一)群體構(gòu)建及表型鑒定：

以一份無毛甘藍(lán)與一份有毛野生甘藍(lán)b.incana雜交產(chǎn)生f1代，f1代再自交，種植于大田，獲得f2代植株。植株的10葉期通過肉眼觀察第一葉上表皮毛的有無。

(二)snp芯片分析

隨機(jī)選擇94份f2植株，于苗期采集幼嫩葉片，采用ctab法提取dna(doyle,1991)，純化后進(jìn)行油菜60ksnp芯片分析(illuminainc.,ca,usa)，將獲得的snp對(duì)應(yīng)到甘藍(lán)參考基因組(http://brassicadb.org/brad/index.php)，并依照takagi方法進(jìn)行的(takagietal.，2013)將snp結(jié)果與表皮毛表型進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，從c01號(hào)染色體上檢測(cè)到一個(gè)顯著的關(guān)聯(lián)區(qū)間，該區(qū)間跨度1.04mb(如圖1)。

(三)候選基因分析：

從公共數(shù)據(jù)庫(kù)(http://brassicadb.org/brad/index.php)查詢上述1.04-mb區(qū)間內(nèi)的所有甘藍(lán)基因，根據(jù)對(duì)應(yīng)功能注釋和與植物表皮毛有關(guān)的現(xiàn)有文獻(xiàn)，篩選到一個(gè)與表皮毛發(fā)育有關(guān)的基因botry(如圖1)。

(四)功能標(biāo)記轉(zhuǎn)化與檢測(cè)：

對(duì)無毛甘藍(lán)親本和有毛甘藍(lán)親本提取dna，利用illuminahiseq2500測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行重測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)兩者的botry基因在編碼區(qū)存在snp。根據(jù)甘藍(lán)botry基因序列，設(shè)計(jì)可擴(kuò)增出上述snp位點(diǎn)的引物，其正向引物序列為5’-ttaaaatttggaagatggaggc-3’，反向引物序列為5’-gccaacaggaggaagatctca-3’。根據(jù)上述snp類型及附近序列，確定能辨別其堿基類型的限制性內(nèi)切酶為xagi(如圖2)。

在無毛和有毛親本、f1植株以及19個(gè)f2材料中進(jìn)行pcr擴(kuò)增和xagi酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳分離后，發(fā)現(xiàn)無毛親本及7份無毛f2僅出現(xiàn)659-bp的單一條帶(不可酶切型)；有毛親本及7份有毛f2植株出現(xiàn)276-bp和373-bp兩種特異條帶(可酶切型)；f1及5份無毛f2植株同時(shí)出現(xiàn)659-bp、276-bp和373-bp三種條帶(雜合型)，確定其為雜合基因型植株(如圖3)。

實(shí)施例2所述分子標(biāo)記的應(yīng)用

一種與甘藍(lán)葉片表皮毛有無緊密相關(guān)的分子標(biāo)記在甘藍(lán)育種中的應(yīng)用，其步驟是：

以無毛甘藍(lán)c41和有毛甘藍(lán)c01(材料來源同實(shí)施例1)雜交發(fā)展的50份f2植株(非實(shí)施例1中用于snp芯片分析的材料)為研究材料，該部分植株中有17份表現(xiàn)有毛，33份表現(xiàn)無毛。利用實(shí)施例1中所發(fā)展的標(biāo)記進(jìn)行鑒定，步驟如下：

1)以甘藍(lán)單株dna為模板；

2)利用下述引物進(jìn)行pcr過程：

引物的正向序列為：5’-ttaaaatttggaagatggaggc-3’

引物反向序列為：5’-gccaacaggaggaagatctca-3’；

3)pcr反應(yīng)體系：總體積為10μl，具體成分如下表：

表1擴(kuò)增體系

4)pcr擴(kuò)增程序：94℃5min，[94℃45s，55℃45s，72℃1min]×35循環(huán)，72℃10min。運(yùn)行完畢后4℃條件下保存。

5)pcr擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切：每10μl用2.5u的限制性酶xagi在37℃條件下處理1h；

4)酶切產(chǎn)物經(jīng)1.5％瓊脂糖凝膠電泳分離后，僅出現(xiàn)659-bp單一條帶(不可酶切型)的有14份材料，其表現(xiàn)均為無毛；僅出現(xiàn)276-bp和373-bp兩種特異條帶(可酶切型)的有17個(gè)，均為有毛個(gè)體；同時(shí)出現(xiàn)659-bp、276-bp和373-bp三種條帶(雜合型)的有19份材料，均表現(xiàn)為無毛，推測(cè)其為雜合基因型植株。

5)選擇上述“4)”中出現(xiàn)659-bp單一條帶的材料3份(無毛)，僅出現(xiàn)276-bp和373-bp兩種特異條帶的材料3份(有毛)，同時(shí)出現(xiàn)659-bp、276-bp和373-bp三種條帶的雜合材料3份(無毛)，分別自交產(chǎn)生f2：3家系，種植于大田后調(diào)查苗期表皮毛表型。發(fā)現(xiàn)前2類材料的表型不發(fā)生分離，且均與上代表型一致；上代表現(xiàn)為三種條帶的3份無毛材料，其f2:3家系均出現(xiàn)表皮毛性狀的分離現(xiàn)象。該具體結(jié)果見附表1。

表1酶切結(jié)果

6)對(duì)表1中的258份f2:3植株進(jìn)行分子標(biāo)記鑒定，上一世代為可酶切型和不可酶切型的植株，其f2:3植株的酶切結(jié)果與上一世代完全相同；上一世代為雜合型的植株，其產(chǎn)生的97份f2:3植株的酶切結(jié)果出現(xiàn)分離，其中19份有毛個(gè)體均被酶切(即為可酶切型)，其余78份無毛個(gè)體中，有23份不能被酶切(即為不可酶切型)，55份表現(xiàn)為雜合型。

上述鑒定結(jié)果表明，在育種中通過功能分子標(biāo)記鑒定與篩選，保留僅出現(xiàn)276-bp和373-bp兩種特異條帶的材料即為純合有毛材料；保留同時(shí)出現(xiàn)659-bp、276-bp和373-bp三種條帶的材料，可提高下一輪選擇的效率和準(zhǔn)確性，減輕后期篩選鑒定的工作量(理論上可減少33％)，加速育種進(jìn)程。

sequencelisting

<110>西南大學(xué)

<120>與甘藍(lán)葉片表皮毛有無緊密相關(guān)的分子標(biāo)記及其應(yīng)用

<130>2017

<160>3

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>659

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>分子標(biāo)記boltrichome-caps01

<220>

<221>snp位點(diǎn)

<222>(378)..(378)

<223>n為a或g

<400>1

ttaaaatttggaagatggaggcaagaaatgtgtgttgtttctcatgatccaatatctctc60

tatctccacagcttttcttcccggtactcttcctgctattatttcccacctggtattttg120

caagaaaacatttttctctctaagaatggaaatacataagtaaataataaaatgtttgat180

acaagtgattagcttggatcccattctgcttattaagctaagaagtccctaagcgtagca240

aaaagttaaaaaaaaaaacacctagacactaaaacttaggtctagtagttcctaattaat300

gaaactacgtacaaactataactaattagaacaagaacatgaagcagcaattgaaagatc360

aagtaggcctaagagagngcaaggacacttagaccagaaggcgatggtgattcaaaaggt420

cactctgaaacgacaagaacgattttcttcatcatcaggagatggttatttttttttttt480

gtttgttcaacagatcatcaggcgatggtaagcgtaagaatataagtacattcctatgtc540

atatgttttgtggtaaagtcgttacatctaattttgggagagaaagaaattaaaagaaga600

tacgtacctatcgcctacgagtctgtacattcttaagatgagatcttcctcctgttggc659

<210>2

<211>22

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>正向引物

<400>2

ttaaaatttggaagatggaggc22

<210>3

<211>21

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>反向引物

<400>3

gccaacaggaggaagatctca21