本發(fā)明涉及一種表達(dá)streptomycessp.fa1來(lái)源木聚糖酶的畢氏酵母重組菌，屬于基因工程領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

木聚糖酶屬于糖苷水解酶[ec3.2.1.x]，能應(yīng)用在多個(gè)領(lǐng)域中。木聚糖酶和其他半纖維素酶一起添加在飼料中利于增加飼料營(yíng)養(yǎng)分解；在制漿和造紙工業(yè)領(lǐng)域，木聚糖酶可作為預(yù)漂白劑處理紙漿，從而降低紙漿漂白過(guò)程中化學(xué)試劑使用量，減少對(duì)環(huán)境的污染；在食品領(lǐng)域可以用于面制品烘焙，能夠改善面制品的品質(zhì)；木聚糖酶還用于制備低聚木糖。麻類(lèi)植物的纖維素含量豐富，是紡織行業(yè)中纖維原材料，但是麻類(lèi)植物中含有半纖維素、木質(zhì)素、果膠等雜質(zhì)不利于紡織，木聚糖酶可以進(jìn)行脫膠以去除這些膠質(zhì)，因而在紡織工業(yè)中木聚糖酶也有相當(dāng)?shù)膽?yīng)用，可減少化學(xué)品對(duì)環(huán)境的污染。迄今為止，國(guó)內(nèi)外已報(bào)道了400多種木聚糖酶基因，大多數(shù)木聚糖酶在野生菌中表達(dá)量?jī)H在10-20iu·ml^-1。為了進(jìn)一步推動(dòng)木聚糖酶在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用，利用分子生物學(xué)方法將木聚糖酶基因進(jìn)行異源表達(dá)以提高木聚糖酶的表達(dá)水平，是目前普遍采用的木聚糖酶制備方式。

畢氏酵母表達(dá)系統(tǒng)主要包括誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)和組成型表達(dá)系統(tǒng)。誘導(dǎo)型表達(dá)系統(tǒng)中使用乙醇氧化酶為啟動(dòng)子(paox1)來(lái)誘導(dǎo)表達(dá)外源蛋白，期間需要進(jìn)行初始碳源和甲醇之間的轉(zhuǎn)換，導(dǎo)致存在發(fā)酵周期長(zhǎng)、操作不方便、需要掌握好碳源的轉(zhuǎn)換時(shí)間、甲醇含量難以監(jiān)測(cè)的缺點(diǎn)；此外甲醇屬于易揮發(fā)、易燃易爆物質(zhì)，具有一定的生產(chǎn)危險(xiǎn)性，不方便大量?jī)?chǔ)存；甲醇還屬于劇毒物質(zhì)，不適用于食品方面的應(yīng)用，因而制約了paox1表達(dá)載體在食品領(lǐng)域的大規(guī)模應(yīng)用。組成型表達(dá)系統(tǒng)是最近幾年廣泛使用的畢氏酵母表達(dá)系統(tǒng)，其中三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子(pgap)是較為常用的同生長(zhǎng)相偶聯(lián)的組成型表達(dá)系統(tǒng)啟動(dòng)子，可以利用甘油或者葡萄糖等碳源生長(zhǎng)并高效表達(dá)外源基因，具有不需要更換碳源、操作便捷的優(yōu)點(diǎn)。尤其是該啟動(dòng)子利用無(wú)毒害性碳源，使pgap質(zhì)粒構(gòu)建的組成型表達(dá)系統(tǒng)對(duì)于表達(dá)食品行業(yè)用酶制劑具有更重要意義。

外源基因可以整合進(jìn)宿主基因組進(jìn)行表達(dá)，也能以游離質(zhì)粒的形式進(jìn)行表達(dá)。整合型表達(dá)具有遺傳穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)，而游離型表達(dá)具有拷貝數(shù)高的優(yōu)點(diǎn)。目前在畢氏酵母表達(dá)系統(tǒng)中，木聚糖酶基因均是構(gòu)建整合型重組菌株進(jìn)行外源基因重組表達(dá)，尚未見(jiàn)到采用游離型表達(dá)質(zhì)粒來(lái)進(jìn)行表達(dá)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種穩(wěn)定的、可以大量分泌木聚糖酶的游離表達(dá)型畢氏酵母重組菌及其構(gòu)建方法，工業(yè)應(yīng)用前景廣闊。

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種表達(dá)木聚糖酶的畢氏酵母重組菌，所述畢氏酵母重組菌是將streptomycessp.fa1來(lái)源的木聚糖酶基因，連接到含有自主復(fù)制序列的游離表達(dá)質(zhì)粒上，轉(zhuǎn)化至畢氏酵母中得到的畢氏酵母重組菌。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述木聚糖酶基因氨基酸序列如seqidno:1所示。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述自主復(fù)制序列的核苷酸序列如seqidno:2所示。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述游離表達(dá)載體為通過(guò)將核苷酸序列如seqidno:2的pars復(fù)制子連接到pgapzαa質(zhì)粒上得到pgapzαa-pars游離表達(dá)載體。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述畢氏酵母為畢氏酵母km71、gs115或smd168。

本發(fā)明第二個(gè)目的是提供一種所述畢氏酵母重組菌的構(gòu)建方法，所述方法包括如下步驟：

(1)獲得氨基酸序列如seqidno:1所示的木聚糖酶基因；

(2)獲得序列如seqidno:2所示的自主復(fù)制序列pars基因；

(3)將步驟(2)所得pars基因與質(zhì)粒pgapzαa相連，得到表達(dá)載體pgapzαa-pars；

(4)將步驟(1)中的木聚糖酶基因與步驟(3)中的表達(dá)載體pgapzαa-pars相連，得到重組載體pgapzαa-pars-xyna；

(5)將重組載體pgapzαa-pars-xyna轉(zhuǎn)化到畢氏酵母中，得到所述畢氏酵母重組菌。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供所述的畢氏酵母重組菌生產(chǎn)木聚糖酶的方法，所述方法包括以下步驟：

(1)以權(quán)利要求1所述畢氏酵母重組菌為生產(chǎn)菌株，活化后，30℃、200rpm條件下培養(yǎng)24h，得一級(jí)種子發(fā)酵液；

(2)以2.5％接種量接種一級(jí)種子發(fā)酵液至種子培養(yǎng)基中，30℃、200rpm條件下培養(yǎng)24h，得二級(jí)種子發(fā)酵液；

(3)以10％的接種量將二級(jí)種子發(fā)酵液接種至發(fā)酵培養(yǎng)基中30℃、200rpm進(jìn)行發(fā)酵；

(4)待do值迅速上升時(shí)，進(jìn)行補(bǔ)料，od600＝100時(shí)停止補(bǔ)料，饑餓至第二次出現(xiàn)do值迅速上升時(shí)繼續(xù)補(bǔ)料。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述種子培養(yǎng)基為ypd培養(yǎng)基；所述發(fā)酵培養(yǎng)基為bsm培養(yǎng)基；其中bsm培養(yǎng)基包括如下成分：85％磷酸26.7ml/l，caso40.93g/l，k2so418.2g/l，mgso4·7h2o14.9g/l，koh4.13g/l，甘油40.0g/l，ptm14.35ml/l，上述成分均溶于水中形成所述bsm培養(yǎng)基。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述方法中補(bǔ)料配方為50％甘油、1.25％ptm1；甘油和ptm1溶于水中形成所述補(bǔ)料。

本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供所述畢氏酵母重組菌在飼料、食品、紡織或化工領(lǐng)域的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果

本發(fā)明所述重組畢氏酵母工程菌屬于帶自我復(fù)制的游離型載體重組畢氏酵母工程菌。此工程菌相對(duì)通用的整合型的重組畢氏酵母工程菌顯著提升了分泌生產(chǎn)木聚糖酶的能力。此外發(fā)酵原料來(lái)源廣泛，生產(chǎn)成本較低。

本發(fā)明將streptomycessp.fa1來(lái)源木聚糖酶(xyna)基因整合到游離含pgap啟動(dòng)子的質(zhì)粒中再轉(zhuǎn)入畢氏酵母，使其分泌木聚糖酶。同整合型表達(dá)菌株相比，采用游離載體表達(dá)木聚糖酶產(chǎn)量提高了50％，同時(shí)表達(dá)的酶的比活力提高了90％，從而顯著降低了工業(yè)化生產(chǎn)木聚糖酶的生產(chǎn)成本。

附圖說(shuō)明

圖1重組質(zhì)粒pgapzαa-pars-xyna的構(gòu)建過(guò)程圖；

圖2pgapzαa-pars-xyna重組質(zhì)粒的雙酶切驗(yàn)證圖；

圖3pgapzαa-pars-xyna重組菌3.6l發(fā)酵sds-page電泳圖；

圖4pgapzαa-pars-xyna重組菌3.6l發(fā)酵酶活對(duì)比圖。

具體實(shí)施方式

將0.5g的木聚糖溶于100ml，50mmol/l，ph5.5的磷酸緩沖液充分混勻，取1ml底物，在55℃預(yù)熱10min，加入1ml的酶液，反應(yīng)10min后加入3mldns，煮沸10min迅速冷卻，加蒸餾水定容至20ml，540nm下測(cè)吸光度(以滅活的酶液為催化劑同樣操作作為空白對(duì)照)。

在上述條件下，將每分鐘水解木聚糖糖生成1μmol的木糖所需酶量定義為木聚糖酶的一個(gè)單位的酶活力(u)。

實(shí)施例1：表達(dá)載體pgapzαa-pars的構(gòu)建

利用全基因合成技術(shù)合成核苷酸序列如seqidno.2所示的自主復(fù)制序列pars；將回收得到的pars基因片段，用infusion酶與質(zhì)粒pgapzαa相連，構(gòu)建得到表達(dá)載體pgapzαa-pars。

實(shí)施例2：游離型pgapzαa-pars-xyna重組菌的構(gòu)建

重組質(zhì)粒pgapzαa-pars-xyna的構(gòu)建：

以質(zhì)粒pmd18-t-xyna(axylanasefromstreptomycessp.fa1:heterologousexpression,characterization,anditsapplicationinchinesesteamedbread，yangxu，journalofindustrialmicrobiology&biotechnology，may2016，volume43，issue5，pp663–670)為模板，設(shè)計(jì)序列如seqidno.3所示的正向引物：ccggaattcatggccgagaacaccctt，序列如seqidno.4所示的反向引物：atttgcggccgctcaggtgcgggtccagcgtt。通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)獲得具有noti和ecori酶切位點(diǎn)的xyna片段。

pcr反應(yīng)體系(50μl)：

pcr程序：94℃，4min(預(yù)變性)；98℃，10s(變性)；60℃，5s(退火)；72℃，90s(延伸)；設(shè)置30個(gè)循環(huán)；72℃，10min(保溫)后設(shè)置保藏溫度為4℃。將pcr產(chǎn)物進(jìn)行膠回收、酶切回收目的基因?qū)⑵渑c表達(dá)載體pgapzαa-pars進(jìn)行雙酶切，并于16℃連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化e.colijm109，涂布含zecoin抗性的lb平板，37℃培養(yǎng)8-10h，挑取轉(zhuǎn)化子，提取重組質(zhì)粒并雙酶切驗(yàn)證，然后對(duì)驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒測(cè)定dna序列，陽(yáng)性克隆子即pgapzαa-pars-xyna。見(jiàn)圖1和圖2。

重組質(zhì)粒pgapzαa-pars-xyna的轉(zhuǎn)化：

(1)從乙醇中取出電轉(zhuǎn)杯，置于超凈臺(tái)中吹干，并置于冰中預(yù)冷備用；

(2)在冰上進(jìn)行以下操作：將重組游離質(zhì)粒pgapzαa-pars-xyna預(yù)冷，吸取5μl快速與80μl酵母感受態(tài)中混勻，轉(zhuǎn)移到0.2cm經(jīng)過(guò)紫外照射的的電轉(zhuǎn)杯，冰浴5min，電擊條件為：電壓1500v，時(shí)間控制4-10ms；

(3)迅速向電擊杯中加入1ml1mol·l^-1預(yù)冷的山梨醇，輕輕吹打均勻，然后將其轉(zhuǎn)移至冰冷的1.5ml無(wú)菌ep管中，30℃、50r·min^-1培養(yǎng)1-2h；

(4)離心菌體，重新懸浮均勻后吸取200μl-300μl涂布上還有zecoin抗性的ypd平板上，于30℃恒溫條件下培養(yǎng)，至長(zhǎng)出單菌落，即為含有游離質(zhì)粒的重組單菌落。

(5)使用無(wú)菌牙簽挑取ypd平板上的菌落，接種到y(tǒng)pd培養(yǎng)基中。

(6)從平板上挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子單酵母菌落轉(zhuǎn)接于裝有10mlypd培養(yǎng)基的50ml三角瓶中培養(yǎng)24h后轉(zhuǎn)入裝有50mlypd培養(yǎng)基的500ml三角瓶培養(yǎng)表達(dá)3～4天，培養(yǎng)物經(jīng)離心后得到含重木聚糖酶的上清，利用dns法對(duì)其進(jìn)行酶活檢測(cè)。

實(shí)施例3：整合型pgapzαa-xyna重組菌的構(gòu)建

重組質(zhì)粒pgapzαa-xyna構(gòu)建：

以質(zhì)粒pmd18-t-xyna為模板，設(shè)計(jì)序列如seqidno.3所示的正向引物：ccggaattcatggccgagaacaccctt，序列如seqidno.4所示的反向引物：atttgcggccgctcaggtgcgggtccagcgtt。通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)獲得具有noti和ecori酶切位點(diǎn)的xyna片段。

pcr反應(yīng)體系(50μl)：

pcr程序：94℃，4min(預(yù)變性)；98℃，10s(變性)；60℃，5s(退火)；72℃，90s(延伸)；設(shè)置30個(gè)循環(huán)；72℃，10min(保溫)后設(shè)置保藏溫度為4℃。將pcr產(chǎn)物進(jìn)行膠回收、酶切回收目的基因?qū)⑵渑c表達(dá)載體pgapzαa進(jìn)行雙酶切，并于16℃連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化e.colijm109，涂布含zecoin抗性的lb平板，37℃培養(yǎng)8-10h，挑取轉(zhuǎn)化子，提取重組質(zhì)粒并雙酶切驗(yàn)證，然后對(duì)驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒測(cè)定dna序列，陽(yáng)性克隆子即pgapzαa-xyna。

重組質(zhì)粒pgapzαa-xyna的轉(zhuǎn)化：

重組質(zhì)粒經(jīng)saci內(nèi)切酶線性化，酶切體系如下：

混勻上述溶液，37℃酶切2h，采用瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證酶切得到產(chǎn)物。

(1)從乙醇中取出電轉(zhuǎn)杯，置于超凈臺(tái)中吹干，并置于冰中預(yù)冷備用

(2)在冰上進(jìn)行以下操作：將線性化后回收的pgapzαa-xyna預(yù)冷，吸取5μl快速與80μl酵母感受態(tài)中混勻，轉(zhuǎn)移到0.2cm經(jīng)過(guò)紫外照射的的電轉(zhuǎn)杯，冰浴5min，電擊條件為：電壓1500v，時(shí)間控制4-10ms；

(3)迅速向電擊杯中加入1ml1mol·l-1預(yù)冷的山梨醇，輕輕吹打均勻，然后將其轉(zhuǎn)移至冰冷的1.5ml無(wú)菌ep管中，30℃、50r·min-1培養(yǎng)1-2h；

(4)離心菌體，重新懸浮均勻后吸取200μl-300μl涂布上還有zecoin抗性的ypd平板上，于30℃恒溫條件下培養(yǎng)，至長(zhǎng)出單菌落，即為整合到基因組的重組單菌落。

(5)使用無(wú)菌牙簽挑取ypd平板上的菌落，接種到y(tǒng)pd培養(yǎng)基中。

(6)從平板上挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子單酵母菌落轉(zhuǎn)接于裝有10mlypd培養(yǎng)基的50ml三角瓶中培養(yǎng)24h后轉(zhuǎn)入裝有50mlypd培養(yǎng)基的500ml三角瓶培養(yǎng)表達(dá)3～4天，培養(yǎng)物經(jīng)離心后得到含重木聚糖酶的上清，利用dns法對(duì)其進(jìn)行酶活檢測(cè)。

實(shí)施例4：pgapzαa-pars-xyna重組菌與pgapzαa-xyna重組菌3.6l發(fā)酵罐發(fā)酵

重組畢氏酵母工程菌發(fā)酵罐發(fā)酵生產(chǎn)木聚糖酶的方法在3.6linfors罐進(jìn)行，過(guò)程分為三階段進(jìn)行：

第一階段：接種實(shí)施例3或?qū)嵤├?中的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子單菌落至裝有10mlypd培養(yǎng)基的50ml三角瓶中，200rpm，30℃振蕩培養(yǎng)24h，作為一級(jí)種子發(fā)酵液；

第二階段：取所述一級(jí)種子發(fā)酵液2.5ml接種于裝有100ml發(fā)酵培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，200rpm，30℃振蕩培養(yǎng)24h，作為二級(jí)種子發(fā)酵液；

第三階段：將100ml的種子發(fā)酵液接種到裝有900mlbsm培養(yǎng)基中的3.6l發(fā)酵罐中，200rpm，30℃的條件下培養(yǎng)，全程用25％氨水進(jìn)行ph值的調(diào)節(jié)，保持在5.0；所述bsm培養(yǎng)基包括如下成分：85％磷酸26.7ml/l，caso40.93g/l，k2so418.2g/l，mgso4·7h2o14.9g/l，koh4.13g/l，甘油40.0g/l，ptm14.35ml/l上述成分均溶于水中形成所述bsm培養(yǎng)基；

待碳源耗盡，即do值迅速上升時(shí)，進(jìn)行補(bǔ)料，待od600＝100時(shí)，停止補(bǔ)料，饑餓至第二次出現(xiàn)do值迅速上升時(shí)，繼續(xù)補(bǔ)料，補(bǔ)料配方為50％甘油；1.25％ptm1；甘油和ptm1溶于水中形成所述補(bǔ)料。不同時(shí)間段取樣。

實(shí)施例5：木聚糖酶酶活測(cè)定

分別取實(shí)施例6中pgapzαa-pars-xyna重組菌與pgapzαa-xyna重組菌產(chǎn)的酶進(jìn)行酶活測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4。結(jié)果表明，整合型pgapzαa-xyna重組菌獲得的木聚糖酶的最大酶活力235u/ml，蛋白含量2.7mg/ml。游離型pgapzαa-pars-xyna重組菌獲得的木聚糖酶的最大酶活力為350u/ml，蛋白含量2.1mg/ml，同整合型pgapzαa-xyna重組菌相比，采用游離載體表達(dá)木聚糖酶產(chǎn)量提高了50％，同時(shí)表達(dá)的酶的比活力提高了90％，從而顯著降低了工業(yè)化生產(chǎn)木聚糖酶的生產(chǎn)成本。此外，pgapzαa-pars-xyna重組菌所產(chǎn)酶的蛋白電泳結(jié)果顯示在43kda處有一條與理論分子量一致的條帶(結(jié)果如圖3所示)。

雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開(kāi)如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)和修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書(shū)所界定的為準(zhǔn)。

序列表

<110>江南大學(xué)

<120>一種表達(dá)streptomycessp.fa1來(lái)源木聚糖酶的畢氏酵母重組菌

<160>4

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>436

<212>prt

<213>streptomycessp.fa1

<400>1

metalagluasnthrleuglyalaalaalaalaglnserglyargtyr

151015

pheglyvalalailealaserglylysleuglyaspserthrtyrthr

202530

serilealaasnargglupheasnservalthralagluasnglumet

354045

lysileaspalathrgluproasnargglyglnpheasnpheserser

505560

alaaspargvaltyrasntrpalavalglnasnglylysglnvalarg

65707580

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100105110

valmetalahistyrlysglylysilealaglntrpaspvalvalasn

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glualaphealagluglyserserglyalaargargaspserasnleu

130135140

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alaalaaspproseralalysleucystyrasnasptyrasnvalglu

165170175

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180185190

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195200205

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210215220

asnphealaalaleuglyvalaspvalalavalthrgluleuaspile

225230235240

glnglyalaserserserthrtyralaalavalvalasnaspcysleu

245250255

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260265270

aspsertrpargalaseraspthrproleuleupheasnasnaspgly

275280285

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290295300

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305310315320

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325330335

thrglnileglnleutyraspcyshisserasnserasnglnglntrp

340345350

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355360365

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370375380

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385390395400

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405410415

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420425430

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435

<210>2

<211>164

<212>dna

<213>人工合成

<400>2

tcgagataagctgggggaacattcgcgaaaatgaaacaagtcggctgttatagtatattt60

attataatattgaaagatctcaaaagactacttatttttgaatgaaccaagtatgaaatc120

aacctatttggggttgaccaaaataagtaaatattaattgtcga164

<210>3

<211>27

<212>dna

<213>人工合成

<400>3

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<210>4

<211>32

<212>dna

<213>人工合成

<400>4

atttgcggccgctcaggtgcgggtccagcgtt32