本發(fā)明涉及一種馬鈴薯m病毒rt-lamp鑒定用的引物、試劑盒及檢測方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
馬鈴薯m病毒potatovirusm,pvm發(fā)現(xiàn)于美國、法國、英國、德國、荷蘭等國家,目前,pvm在世界各地均有發(fā)生[1]。pvm是香石竹潛隱病毒屬carlavirus成員。病毒粒體大小為650nmx12nm,有一個未完全封閉的病毒衣殼。致死溫度為65-71℃,體外保毒期為5-7d,稀釋限點為102-103。在寄主植物的任何部位都可檢測到病毒,病毒主要存在于細(xì)胞質(zhì)中。發(fā)現(xiàn)在感病植物細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中可出現(xiàn)呈無定形的x體狀的內(nèi)含體。該病毒基因組為單鏈正義rna,長8535bp,其3'端有個poly(a),5'端可能有一個甲基化的帽子結(jié)構(gòu),基因組rna含有6個orfs,編碼6個蛋白。pvm的rna的orfi編碼223kda的復(fù)制酶；orf2、orf3和orf4分別編碼一個25kda、12kda和7kda蛋自,組成了一個三基因盒,參與病毒的胞間運動；orf5編碼34kda外殼蛋白；重疊的orf6編碼11-16kda富含半胱氨酸的蛋白,該產(chǎn)物的功能還不清楚,但從結(jié)合核酸的能力看,可能有助于蚜蟲傳播或者涉及寄主基因轉(zhuǎn)錄及病毒rna的復(fù)制[1]。
pvm的自然寄主主要是茄科植物，包括馬鈴薯、番茄及人參果等，在實驗室中也可侵染覓色黎、昆諾黎、毛曼陀羅、千日紅、菜豆、番茄、豇豆等。該病毒可通過機(jī)械傳播、嫁接傳播也可通過節(jié)肢動物如蚜蟲的非持久性方式傳播,但不能通過種子和花粉傳播。侵染寄主后引起的典型癥狀為小葉皺縮扭曲斑駁和矮化。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足之處，提供一種快速、簡便、高效、準(zhǔn)確性高、特異性強(qiáng)、靈敏性高，馬鈴薯m病毒rt-lamp鑒定用的引物；
本發(fā)明另一個目的是提供一種包含上述引物的用于鑒定馬鈴薯m病毒的試劑盒；
本發(fā)明另一個目的是提供一種采用上述馬鈴薯m病毒rt-lamp鑒定方法。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下方案：
一種馬鈴薯m病毒rt-lamp鑒定用的引物，其特征在于包括：
pvm-f3:5’-ttcaggccgtgctgttct-3’
pvm-b3:5’-cagcatgtggttccaagtca-3’
pvm-fip:5’-gcacccctaggccactcaaa-ggatgcaagcagctcagt-3’
pvm-bip:5’-ggacgctgtgcttgctgtga-caggcgcatacaacctaca-3’。
一種馬鈴薯m病毒rt-lamp鑒定用的試劑盒，其特征在于該試劑盒包括有：
如上所述的試劑盒，其特征在于所述的2×反應(yīng)液緩沖液由以下組分組成：
如上所述的試劑盒，其特征在于所述的酶溶液為bstdna聚合酶和amv逆轉(zhuǎn)錄酶混合液。
如上所述的任一種試劑盒，其特征在于熒光目視檢測試劑中含有鈣黃綠素?zé)晒馊玖稀?/p>
6、一種馬鈴薯m病毒鑒定方法，其特征在于包括以下步驟：
a、植物組織總dna提取；
b、lamp檢測：
采用權(quán)利要求2所述的試劑盒配置預(yù)反應(yīng)溶液，在預(yù)反應(yīng)溶液中分別加入待檢測的樣品的dna5μl，使總量達(dá)到25μl；其中對照組在預(yù)反應(yīng)溶液加入去離子水5μl；陽性對照在預(yù)反應(yīng)溶液中加入帶病毒的dna5μl；用移液器吸排液法混合，或者合上蓋子輕擊使溶液充分混合后瞬時離心，混合時避免產(chǎn)生氣泡；將混合物置于反應(yīng)孔中，于65℃恒溫反應(yīng)90min，最后80℃下保溫5min以結(jié)束反應(yīng)；
c、lamp結(jié)果判斷
擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，使用紫外線照射裝置，波長240-260nm，350-370nm，從反應(yīng)試管底部向上進(jìn)行紫外線照射，佩戴眼鏡等防護(hù)用具后從反應(yīng)試管側(cè)面進(jìn)行觀察，若與陽性對照一樣發(fā)出綠色熒光，則判定為陽性即樣品中帶有馬鈴薯m病毒；若與陰性對照一樣未發(fā)出綠色熒光，則判定樣品中沒有攜帶馬鈴薯m病毒。
如上所述的鑒定方法，其特征在于步驟a中植物組織總dna提取的具體步驟：
a制樣：取0.5g的帶毒組織加入1ml抽提緩沖液進(jìn)行研磨；
b清洗納米磁珠：取出免疫納米磁珠到pcr管中，用ddh2o反復(fù)清洗納米磁珠3次，在磁鐵的作用下吸去ddh2o；
c結(jié)合：加入100μl的樣品到pcr管中，用移液槍吸吐混勻樣品和納米磁珠，室溫下吸附；
d清洗：在磁鐵的作用下移去上清，納米磁珠清洗3次；
e裂解：加入50μlddh2o到pcr管中,用移液槍吸吐混勻納米磁珠后，95℃，10min；
f取樣：用磁鐵吸附納米磁珠，待pcr管內(nèi)溶液澄清后，上清即為病毒rna；
g核酸濃度的測定
取5μldna溶液加ddh2o梯度稀釋至1ml，使用核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計測260nm和280nm處的光密度值；rna的濃度按照以下公式計算獲得：
rnac＝40×n×a
式中：
c——rna濃度(ng/μl)
a——260nm處的吸光值
n——核酸稀釋倍數(shù)
1od260nm＝40μg/ml單鏈rna
當(dāng)od260/od280比值在1.7～1.9之間時，適宜于pcr擴(kuò)增和lamp檢測。
如上所述的鑒定方法，其特征在于所述納米磁珠通過以下方法制備：
1)fe3o4磁性納米粒子制備與氨基化修飾
分別取5.2gfecl3·6h2o、2.7gfeso4·7h2o、0.85ml12.1mol/l的濃鹽酸溶解于200ml水中，超聲脫氧，后將以上溶液滴入250ml、0.75mol/lnaoh溶液；所有反應(yīng)在80℃下攪拌，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，反應(yīng)液中出現(xiàn)黑色的沉淀，反應(yīng)結(jié)束后，利用磁分離器將所得沉淀從反應(yīng)介質(zhì)中分離出來，再用去離子水清洗3次，無水乙醇清洗2次，并配成5g/ml的fe3o4磁性納米粒子無水乙醇溶液，取25mlfe3o4磁性納米粒子無水乙醇溶液，再用無水乙醇稀釋到150ml，超聲振蕩30min，滴加0.4mlaptes，其中硅烷偶聯(lián)劑：3-氨基丙基三乙氧基硅烷，室溫下攪拌7h，反應(yīng)完畢，用磁分離器將aptes修飾的fe3o4磁性納米粒子從反應(yīng)介質(zhì)中分離，并用無水乙醇溶液清洗3次，最后配成10.5mg/ml的氨基化fe3o4納米磁珠無水乙醇溶液；
2)免疫磁珠的制備
取0.5ml氨基化fe3o4納米磁珠無水乙醇溶液，用1mlpbs清洗3次，磁分離器棄上清液，加入5％(v/v)戊二醛溶液2ml，室溫振蕩交聯(lián)2h，磁分離，棄上清液，用pbs洗滌3次并棄上清液后，分別采用0.5ml不同稀釋倍數(shù)的相應(yīng)病毒抗體包被氨基化fe3o4納米粒子，室溫下振蕩固定2h，磁分離，用pbs和超純水分別洗滌3次，再用pbs定容，4℃冰箱保存?zhèn)溆?，到具有最佳吸附量的一病毒抗體免疫磁珠。
本發(fā)明中所用到的材料：
1.1毒株
pvm購買于美國agdia公司。
1.2主要試劑和耗材
(1)pcr反應(yīng)試劑：10×pcrbμffer、dntps、mgcl2、taqdna聚合酶以及反轉(zhuǎn)錄酶(reversetranscriptasem-mlv)均購自寶生物工程(大連)有限公司；
(2)dnamarkerdl1000、6×loadingbμffer，寶生物工程(大連)有限公司；
(3)rna擴(kuò)增反應(yīng)試劑盒l(wèi)oopamprnaamplificationkit,
(4)bstdnapolymeraselargefragment:購自newenglandbiolabs公司；
(5)甜菜堿(betaine)：購自廣州威佳生物有限公司；dntps、mgcl2，寶生物工程(大連)有限公司；
(6)lamp引物(正向外引物f3、正向內(nèi)引物fip、反向內(nèi)引物bip、反向外引物b3)由寶生物工程(大連)有限公司合成；
(7)納米磁珠(magneticnanoparticles，mnp)試劑盒購自北京金納科技有限公司；
1.3主要儀器設(shè)備
(1)－80℃冷凍冰箱；
(2)labofμge400r高速冷凍臺式離心機(jī)；
(3)微量移液器，1000μl、200μl、100μl、10μl，2.5μl，；
(4)分析天平，梅特勒－托利多儀器有限公司；
(5)高溫高壓滅菌鍋；
(6)超純水系統(tǒng)，milli－qacademic，millipore公司；
(7)日本shimadzμ公司μv-120-02型可見－紫外分光光度計；
(8)超凈工作臺；
(9)漩渦混合器；
(10)lamp實時濁度儀，la－320c，日本榮研生物公司。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，有益效果是：
一、本發(fā)明針對侵染馬鈴薯的pvm的外殼蛋白基因設(shè)計了一組特異性的引物，成功建立了針對這種病毒的lamp檢測方法；
二、本發(fā)明檢測體系中的鎂離子濃度、dntp濃度、甜菜堿添加量、反應(yīng)溫度、內(nèi)外引物間比例合適，從而使得
三、本發(fā)明中引物特異性較好，靈敏度高；
四、本發(fā)明利用lamp法檢測這兩種病毒檢測約耗時約2小時，比普通elisa和rt-pcr方法更加快速；
五、本發(fā)明lamp法不需要pcr儀等昂貴、操作復(fù)雜的儀器，水浴鍋或恒溫裝置即可完成反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，通過觀察是否產(chǎn)生了白色沉淀或加入sybr顯色劑觀察顏色變化就可判定反應(yīng)是否發(fā)生，操作簡便，適于檢驗檢疫局一線檢測實驗室推廣，具有很好的應(yīng)用前景。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明做進(jìn)一步描述：
實施例1
一種馬鈴薯m病毒rt-lamp鑒定用的試劑盒，該試劑盒包括有：
其中引物序列：
pvm-f3:5’-ttcaggccgtgctgttct-3’
pvm-b3:5’-cagcatgtggttccaagtca-3’
pvm-fip:5’-gcacccctaggccactcaaa-ggatgcaagcagctcagt-3’
pvm-bip:5’-ggacgctgtgcttgctgtga-caggcgcatacaacctaca-3’。
實施例2
一種馬鈴薯m病毒rt-lamp鑒定用的試劑盒，該試劑盒包括有：
其中引物序列：
pvm-f3:5’-ttcaggccgtgctgttct-3’
pvm-b3:5’-cagcatgtggttccaagtca-3’
pvm-fip:5’-gcacccctaggccactcaaa-ggatgcaagcagctcagt-3’
pvm-bip:5’-ggacgctgtgcttgctgtga-caggcgcatacaacctaca-3’。
本發(fā)明中所述的2×反應(yīng)液緩沖液由以下組分組成：
所述的酶溶液為bstdna聚合酶和amv逆轉(zhuǎn)錄酶混合液。
熒光目視檢測試劑中含有鈣黃綠素?zé)晒馊玖稀?/p>
實施例3
一種馬鈴薯m病毒rt-lamp鑒定用的試劑盒，該試劑盒包括有：
其中引物序列：
pvm-f3:5’-ttcaggccgtgctgttct-3’
pvm-b3:5’-cagcatgtggttccaagtca-3’
pvm-fip:5’-gcacccctaggccactcaaa-ggatgcaagcagctcagt-3’
pvm-bip:5’-ggacgctgtgcttgctgtga-caggcgcatacaacctaca-3’。
本發(fā)明中所述的2×反應(yīng)液緩沖液由以下組分組成：
所述的酶溶液為bstdna聚合酶和amv逆轉(zhuǎn)錄酶混合液。
熒光目視檢測試劑中含有鈣黃綠素?zé)晒馊玖稀?/p>
實施例4
一種馬鈴薯m病毒鑒定方法，包括以下步驟：
a、植物組織總dna提??；
b、lamp檢測：
采用實施例2所述的試劑盒配置預(yù)反應(yīng)溶液，在預(yù)反應(yīng)溶液中分別加入待檢測的樣品的dna5μl，使總量達(dá)到25μl；其中對照組在預(yù)反應(yīng)溶液加入去離子水5μl；陽性對照在預(yù)反應(yīng)溶液中加入帶病毒的dna5μl；用移液器吸排液法混合，或者合上蓋子輕擊使溶液充分混合后瞬時離心，混合時避免產(chǎn)生氣泡；將混合物置于反應(yīng)孔中，于65℃恒溫反應(yīng)90min，最后80℃下保溫5min以結(jié)束反應(yīng)；
c、lamp結(jié)果判斷
擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，使用紫外線照射裝置，波長240-260nm，350-370nm，從反應(yīng)試管底部向上進(jìn)行紫外線照射，佩戴眼鏡等防護(hù)用具后從反應(yīng)試管側(cè)面進(jìn)行觀察，若與陽性對照一樣發(fā)出綠色熒光，則判定為陽性即樣品中帶有馬鈴薯m病毒；若與陰性對照一樣未發(fā)出綠色熒光，則判定樣品中沒有攜帶馬鈴薯m病毒。
實施例5
一種馬鈴薯m病毒鑒定方法，包括以下步驟：
a、植物組織總dna提?。?/p>
步驟a中植物組織總dna提取的具體步驟：
a制樣：取0.5g的帶毒組織加入1ml抽提緩沖液進(jìn)行研磨；
b清洗納米磁珠：取出免疫納米磁珠到pcr管中，用ddh2o反復(fù)清洗納米磁珠3次，在磁鐵的作用下吸去ddh2o；
c結(jié)合：加入100μl的樣品到pcr管中，用移液槍吸吐混勻樣品和納米磁珠，室溫下吸附；
d清洗：在磁鐵的作用下移去上清，納米磁珠清洗3次；
e裂解：加入50μlddh2o到pcr管中,用移液槍吸吐混勻納米磁珠后，95℃，10min；
f取樣：用磁鐵吸附納米磁珠，待pcr管內(nèi)溶液澄清后，上清即為病毒rna；
g核酸濃度的測定
取5μldna溶液加ddh2o梯度稀釋至1ml，使用核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計測260nm和280nm處的光密度值；rna的濃度按照以下公式計算獲得：
rnac＝40×n×a
式中：
c——rna濃度(ng/μl)
a——260nm處的吸光值
n——核酸稀釋倍數(shù)
1od260nm＝40μg/ml單鏈rna
當(dāng)od260/od280比值在1.7～1.9之間時，適宜于pcr擴(kuò)增和lamp檢測。
其中所述納米磁珠通過以下方法制備：
1)fe3o4磁性納米粒子制備與氨基化修飾
分別取5.2gfecl3·6h2o、2.7gfeso4·7h2o、0.85ml12.1mol/l的濃鹽酸溶解于200ml水中，超聲脫氧，后將以上溶液滴入250ml、0.75mol/lnaoh溶液；所有反應(yīng)在80℃下攪拌，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，反應(yīng)液中出現(xiàn)黑色的沉淀，反應(yīng)結(jié)束后，利用磁分離器將所得沉淀從反應(yīng)介質(zhì)中分離出來，再用去離子水清洗3次，無水乙醇清洗2次，并配成5g/ml的fe3o4磁性納米粒子無水乙醇溶液，取25mlfe3o4磁性納米粒子無水乙醇溶液，再用無水乙醇稀釋到150ml，超聲振蕩30min，滴加0.4mlaptes，其中硅烷偶聯(lián)劑：3-氨基丙基三乙氧基硅烷，室溫下攪拌7h，反應(yīng)完畢，用磁分離器將aptes修飾的fe3o4磁性納米粒子從反應(yīng)介質(zhì)中分離，并用無水乙醇溶液清洗3次，最后配成10.5mg/ml的氨基化fe3o4納米磁珠無水乙醇溶液；
2)免疫磁珠的制備
取0.5ml氨基化fe3o4納米磁珠無水乙醇溶液，用1mlpbs清洗3次，磁分離器棄上清液，加入5％(v/v)戊二醛溶液2ml，室溫振蕩交聯(lián)2h，磁分離，棄上清液，用pbs洗滌3次并棄上清液后，分別采用0.5ml不同稀釋倍數(shù)的相應(yīng)病毒抗體包被氨基化fe3o4納米粒子，室溫下振蕩固定2h，磁分離，用pbs和超純水分別洗滌3次，再用pbs定容，4℃冰箱保存?zhèn)溆茫骄哂凶罴盐搅康囊徊《究贵w免疫磁珠。
b、lamp檢測：
采用實施例2所述的試劑盒配置預(yù)反應(yīng)溶液，在預(yù)反應(yīng)溶液中分別加入待檢測的樣品的dna5μl，使總量達(dá)到25μl；其中對照組在預(yù)反應(yīng)溶液加入去離子水5μl；陽性對照在預(yù)反應(yīng)溶液中加入帶病毒的dna5μl；用移液器吸排液法混合，或者合上蓋子輕擊使溶液充分混合后瞬時離心，混合時避免產(chǎn)生氣泡；將混合物置于反應(yīng)孔中，于65℃恒溫反應(yīng)90min，最后80℃下保溫5min以結(jié)束反應(yīng)；
c、lamp結(jié)果判斷
擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，使用紫外線照射裝置，波長240-260nm，350-370nm，從反應(yīng)試管底部向上進(jìn)行紫外線照射，佩戴眼鏡等防護(hù)用具后從反應(yīng)試管側(cè)面進(jìn)行觀察，若與陽性對照一樣發(fā)出綠色熒光，則判定為陽性即樣品中帶有馬鈴薯m病毒；若與陰性對照一樣未發(fā)出綠色熒光，則判定樣品中沒有攜帶馬鈴薯m病毒。
sequencelisting
<110>陳,定虎
<120>馬鈴薯m病毒鑒定用的引物、試劑盒及鑒定方法
<130>馬鈴薯m病毒鑒定用的引物、試劑盒及鑒定方法
<160>4
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>18
<212>dna
<213>potatovirusm
<400>1
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<213>potatovirusm
<400>2
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<212>dna
<213>potatovirusm
<400>3
gcacccctaggccactcaaaggatgcaagcagctcagt38
<210>4
<211>39
<212>dna
<213>potatovirusm
<400>4
ggacgctgtgcttgctgtgacaggcgcatacaacctaca39