本發(fā)明涉及植物提取技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種清瀝草多糖及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
清瀝草為蕓香科植物，多分布于我國廣西及越南國境內(nèi)，性味苦寒，有清熱燥濕，瀉火除蒸，解毒療瘡之功效，全株入藥。據(jù)《廣西地方藥材志》記載，清瀝草具有“清熱燥濕，瀉火解毒，除骨蒸清虛熱”，用于濕熱瀉痢，黃疸，帶下，熱淋，濕疹瘙癢。民間利用清瀝草水煎劑治療小兒皮膚濕疹，有較好的療效。然而，迄今為止，對清瀝草的藥理研究仍較少，僅限于民間偏方使用，對其活性成分的研究與應(yīng)用僅處于初始階段。
多糖是一種廣泛存在于動物細胞膜和植物、微生物細胞壁中的天然大分子物質(zhì)，是一種重要的生物體能量資源和構(gòu)成材料，同時還參與細胞的多種活動。研究表明，許多植物多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、降血糖、抗輻射和延緩衰老等生物活性。但對于清瀝草中的多糖的功效，尚未有相關(guān)研究。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
針對現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，本發(fā)明目的在于提供一種清瀝草多糖及其制備方法與應(yīng)用，提供的制備方法具有多糖提取率高、提取得到的多糖穩(wěn)定性高等特點，制備得到的清瀝草多糖對腳癬主要致病菌有顯著的抑制作用。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：
第一方面，本發(fā)明提供了一種清瀝草多糖的制備方法，包括如下步驟：s1：將陰干的清瀝草粉碎，然后過篩，收集細粉；s2：將細粉采用提取液進行提取，然后過濾，收集濾液；s3：將濾液濃縮，得到濃縮液，然后加入乙醇水溶液，混合均勻，0～5℃靜置后離心，收集固體；s4：將固體采用無水乙醇和/或石油醚洗滌，然后減壓干燥，得到粗多糖；s5：將粗多糖溶解于水中，然后上樣于d-101型大孔樹脂柱，再用乙醇水溶液洗脫，收集洗脫液；s6：將洗脫液減壓濃縮至干，得到清瀝草多糖。需要說明的是，s6中，減壓濃縮至干，得到的類白色粉末，即為清瀝草多糖。
在本發(fā)明的進一步實施方式中，s2中，提取液是質(zhì)量分數(shù)為2％～5％的纖維素酶水溶液，提取液的質(zhì)量是細粉的質(zhì)量的10～30倍；提取的溫度為50～80℃，提取的時間為2～5h。
在本發(fā)明的進一步實施方式中，s3中，濃縮為減壓濃縮，濃縮液的液固比為(1.5～2.5):1，乙醇水溶液的體積分數(shù)為85％，乙醇水溶液的質(zhì)量為濃縮液的質(zhì)量的10～20倍，靜置的時間為5h。
在本發(fā)明的進一步實施方式中，s5中，粗多糖和水的質(zhì)量比為1:5，上柱速率為1.0～3.0bv·h-1，洗脫速率為2.0～3.0bv·h-1，乙醇水溶液的體積為2.0～10.0bv，乙醇水溶液的體積分數(shù)為50％。需要說明的是，bv是指大孔樹脂的體積。
在本發(fā)明的進一步實施方式中，s1中，細粉的粒徑小于或等于0.250mm。
第二方面，本發(fā)明保護根據(jù)上述制備方法制備得到的清瀝草多糖。
第三方面，本發(fā)明還保護上述清瀝草多糖在制備預(yù)防和/或治療腳癬藥物中的應(yīng)用。
第四方面，本發(fā)明提供了一種包括上述清瀝草多糖的軟膏劑，原料組分按重量百分比計，包括：清瀝草多糖1.0％～10.0％、16～18醇3.0％～6.0％、白油8.0％～10.0％、硬脂酸單甘油酯2.0％～3.0％、氮酮1.0％～2.5％、棕櫚酸異辛酯2.0％、氫化羊毛脂1.0％、尼泊金復(fù)合酯0.2％，余量為水。
第五方面，本發(fā)明提供了包括上述清瀝草多糖的軟膏劑的制備方法，包括如下步驟：s101：將16-18醇、白油、硬脂酸單甘油酯、氮酮、棕櫚酸異辛酯和氫化羊毛脂混合均勻，升溫至60℃，得到第一組合物；s102：將清瀝草多糖用水溶解，然后升溫至60℃，得到第二組合物；s103：將第一組合物加入第二組合物中，邊加邊攪拌，加完后維持攪拌預(yù)設(shè)時間，得到第三組合物；s104：將第三組合物冷卻，然后加入尼泊金復(fù)合酯，混合均勻，得到組合物。需要說明的是，本發(fā)明制備得到的包括清瀝草多糖的軟膏劑具有預(yù)防和/或治療腳癬的作用。
在本發(fā)明的進一步實施方式中，s103中，維持攪拌的時間為5～8min；s104中，將第三組合物冷卻至40℃以下。
本發(fā)明提供的技術(shù)方案，具有如下的有益效果：(1)本發(fā)明提供的清瀝草多糖的制備方法，不僅步驟簡單、操作方便，且具有多糖提取效率高、提取的多糖穩(wěn)定性高等特點；(2)本發(fā)明制備得到的清瀝草多糖對腳癬主要致病菌有顯著的抑制作用，可用于制備預(yù)防和/或治療腳癬藥物；(3)清瀝草多糖作為天然植物活性成分的原料，以其為輔助原料，配合乳化劑、保濕劑、滲透劑、防腐劑等現(xiàn)有技術(shù)中常用原料制成軟膏劑，且清瀝草多糖在軟膏劑中的重量百分比以1％～10％為宜，制備得到的軟膏劑具有預(yù)防和/或治療腳癬的功效，安全無毒副作用；(4)本發(fā)明提供的技術(shù)方案有利于提升清瀝草的開發(fā)價值，具有良好的經(jīng)濟和社會效益。
本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實踐了解到。
附圖說明
圖1為本發(fā)明實施例中的清瀝草多糖含量-時間變化曲線曲線圖。
附圖標(biāo)記：
1-實施例一制備得到的清瀝草多糖；2-實施例二制備得到的清瀝草多糖；3-實施例三制備得到的清瀝草多糖；4-實施例四制備得到的清瀝草多糖；5-實施例五制備得到的清瀝草多糖；6-實施例六制備得到的清瀝草多糖。
具體實施方式
下面將結(jié)合本發(fā)明實施例中的附圖，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述。以下實施例僅用于更加清楚地說明本發(fā)明的技術(shù)方案，因此只是作為示例，而不能以此來限制本發(fā)明的保護范圍。
下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，數(shù)據(jù)為三次重復(fù)實驗的平均值或平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。
實施例一
本實施例提供一種清瀝草多糖的制備方法，包括如下步驟：
s1：將陰干的清瀝草粉碎，然后過60目篩，收集粒徑小于或等于0.250mm的細粉；
s2：采用提取液，將細粉于50℃提取2h，然后過濾，收集濾液；其中，提取液是質(zhì)量分數(shù)為2％的纖維素酶水溶液，提取液的質(zhì)量是細粉的質(zhì)量的10倍；
s3：將濾液減壓濃縮，得到液固比為2:1的濃縮液，然后加入濃縮液10倍質(zhì)量的體積分數(shù)為85％的乙醇水溶液，混合均勻，0℃靜置5h后離心，收集固體；
s4：將固體采用無水乙醇洗滌，然后減壓干燥，得到粗多糖；
s5：將粗多糖溶解于5倍質(zhì)量的水中，然后上樣于d-101型大孔樹脂柱，上柱速率為1.0bv·h-1，再用2.0bv的體積分數(shù)為50％的乙醇水溶液洗脫，洗脫速率為2.0bv·h-1，收集洗脫液；
s6：將洗脫液減壓濃縮至干，得到清瀝草多糖。
以測定多糖含量常規(guī)技術(shù)：蒽酮-硫酸法測得提取物中，清瀝草多糖質(zhì)量分數(shù)為81.5％，提取率為8.5％(以葡萄糖為對照品)。
實施例二
本實施例提供一種清瀝草多糖的制備方法，包括如下步驟：
s1：將陰干的清瀝草粉碎，然后過60目篩，收集粒徑小于或等于0.250mm的細粉；
s2：采用提取液，將細粉于80℃水浴提取4h，然后過濾，收集濾液；其中，提取液是質(zhì)量分數(shù)為2％的纖維素酶水溶液，提取液的質(zhì)量是細粉的質(zhì)量的2倍；
s3：將濾液減壓濃縮，得到液固比為2:1的濃縮液，然后加入濃縮液10倍質(zhì)量的體積分數(shù)為85％的乙醇水溶液，混合均勻，0℃靜置5h后離心，收集固體；
s4：將固體采用無水乙醇洗滌，然后減壓干燥，得到粗多糖；
s5：將粗多糖溶解于5倍質(zhì)量的水中，然后上樣于d-101型大孔樹脂柱，上柱速率為2.0bv·h-1，再用10.0bv的體積分數(shù)為50％的乙醇水溶液洗脫，洗脫速率為2.0bv·h-1，收集洗脫液；
s6：將洗脫液減壓濃縮至干，得到清瀝草多糖。
以測定多糖含量常規(guī)技術(shù)：蒽酮-硫酸法測得提取物中，清瀝草多糖質(zhì)量分數(shù)為85.5％，提取率為7.9％(以葡萄糖為對照品)。
實施例三
本實施例提供一種清瀝草多糖的制備方法，包括如下步驟：
s1：將陰干的清瀝草粉碎，然后過60目篩，收集粒徑小于或等于0.250mm的細粉；
s2：采用提取液，將細粉于50℃水浴提取5h，然后過濾，收集濾液；其中，提取液是質(zhì)量分數(shù)為4％的纖維素酶水溶液，提取液的質(zhì)量是細粉的質(zhì)量的30倍；
s3：將濾液減壓濃縮，得到液固比為2:1的濃縮液，然后加入濃縮液20倍質(zhì)量的體積分數(shù)為85％的乙醇水溶液，混合均勻，2℃靜置5h后離心，收集固體；
s4：將固體采用無水乙醇洗滌，然后減壓干燥，得到粗多糖；
s5：將粗多糖溶解于5倍質(zhì)量的水中，然后上樣于d-101型大孔樹脂柱，上柱速率為3.0bv·h-1，再用7.0bv的體積分數(shù)為50％的乙醇水溶液洗脫，洗脫速率為2.0bv·h-1，收集洗脫液；
s6：將洗脫液減壓濃縮至干，得到清瀝草多糖。
以測定多糖含量常規(guī)技術(shù)：蒽酮-硫酸法測得提取物中，清瀝草多糖質(zhì)量分數(shù)為86.3％，提取率為7.6％(以葡萄糖為對照品)。
實施例四
本實施例提供一種清瀝草多糖的制備方法，包括如下步驟：
s1：將陰干的清瀝草粉碎，然后過60目篩，收集粒徑小于或等于0.250mm的細粉；
s2：采用提取液，將細粉于70℃水浴提取2h，然后過濾，收集濾液；其中，提取液是質(zhì)量分數(shù)為4％的纖維素酶水溶液，提取液的質(zhì)量是細粉的質(zhì)量的10倍；
s3：將濾液減壓濃縮，得到液固比為2:1的濃縮液，然后加入濃縮液10倍質(zhì)量的體積分數(shù)為85％的乙醇水溶液，混合均勻，5℃靜置5h后離心，收集固體；
s4：將固體采用無水乙醇洗滌，然后減壓干燥，得到粗多糖；
s5：將粗多糖溶解于5倍質(zhì)量的水中，然后上樣于d-101型大孔樹脂柱，上柱速率為1.0bv·h-1，再用2.0bv的體積分數(shù)為50％的乙醇水溶液洗脫，洗脫速率為2.0bv·h-1，收集洗脫液；
s6：將洗脫液減壓濃縮至干，得到清瀝草多糖。
以測定多糖含量常規(guī)技術(shù)：蒽酮-硫酸法測得提取物中，清瀝草多糖質(zhì)量分數(shù)為84.9％，提取率為8.7％(以葡萄糖為對照品)。
實施例五
本實施例提供一種清瀝草多糖的制備方法，包括如下步驟：
s1：將陰干的清瀝草粉碎，然后過60目篩，收集粒徑小于或等于0.250mm的細粉；
s2：采用提取液，將細粉于80℃水浴提取4h，然后過濾，收集濾液；其中，提取液是質(zhì)量分數(shù)為5％的纖維素酶水溶液，提取液的質(zhì)量是細粉的質(zhì)量的20倍；
s3：將濾液減壓濃縮，得到液固比為2:1的濃縮液，然后加入濃縮液10倍質(zhì)量的體積分數(shù)為85％的乙醇水溶液，混合均勻，0℃靜置5h后離心，收集固體；
s4：將固體采用無水乙醇洗滌，然后減壓干燥，得到粗多糖；
s5：將粗多糖溶解于5倍質(zhì)量的水中，然后上樣于d-101型大孔樹脂柱，上柱速率為1.0～3.0bv·h-1，再用4.0bv的體積分數(shù)為50％的乙醇水溶液洗脫，洗脫速率為2.0bv·h-1，收集洗脫液；
s6：將洗脫液減壓濃縮至干，得到清瀝草多糖。
以測定多糖含量常規(guī)技術(shù)：蒽酮-硫酸法測得提取物中，清瀝草多糖質(zhì)量分數(shù)為88.1％，提取率為8.1％(以葡萄糖為對照品)。
實施例六
本實施例提供一種清瀝草多糖的制備方法，包括如下步驟：
s1：將陰干的清瀝草粉碎，然后過60目篩，收集粒徑小于或等于0.250mm的細粉；
s2：采用提取液，將細粉于80℃水浴提取5h，然后過濾，收集濾液；其中，提取液是質(zhì)量分數(shù)為5％的纖維素酶水溶液，提取液的質(zhì)量是細粉的質(zhì)量的30倍；
s3：將濾液減壓濃縮，得到液固比為2:1的濃縮液，然后加入濃縮液20倍質(zhì)量的體積分數(shù)為85％的乙醇水溶液，混合均勻，0℃靜置5h后離心，收集固體；
s4：將固體采用無水乙醇洗滌，然后減壓干燥，得到粗多糖；
s5：將粗多糖溶解于5倍質(zhì)量的水中，然后上樣于d-101型大孔樹脂柱，上柱速率為3.0bv·h-1，再用5.0bv的體積分數(shù)為50％的乙醇水溶液洗脫，洗脫速率為3.0bv·h-1，收集洗脫液；
s6：將洗脫液減壓濃縮至干，得到清瀝草多糖。
以測定多糖含量常規(guī)技術(shù)：蒽酮-硫酸法測得提取物中，清瀝草多糖質(zhì)量分數(shù)為89.7％，提取率為7.2％(以葡萄糖為對照品)。
實施例七
本實施例提供一種包括實施例六制備得到的清瀝草多糖的軟膏劑，原料組分按重量百分比計，包括：
清瀝草多糖1.0％、16～18醇6.0％、白油10.0％、硬脂酸單甘油酯2.0％、氮酮1.0％、棕櫚酸異辛酯2.0％、氫化羊毛脂1.0％、尼泊金復(fù)合酯0.2％，余量為去離子水。
制備方法包括如下步驟：
s101：將16-18醇、白油、硬脂酸單甘油酯、氮酮、棕櫚酸異辛酯和氫化羊毛脂混合均勻，升溫至60℃，得到第一組合物；
s102：將清瀝草多糖用水溶解，然后升溫至60℃，得到第二組合物；
s103：將所述第一組合物加入第二組合物中，邊加邊攪拌，加完后維持攪拌5min，得到第三組合物；
s104：將所述第三組合物冷卻至40℃以下，然后加入尼泊金復(fù)合酯，混合均勻，得到所述組合物。
實施例八
本實施例提供一種包括實施例六制備得到的清瀝草多糖的軟膏劑，原料組分按重量百分比計，包括：
清瀝草多糖2.0％、16～18醇5.0％、白油8.0％、硬脂酸單甘油酯3.0％、氮酮1.5％、棕櫚酸異辛酯2.0％、氫化羊毛脂1.0％、尼泊金復(fù)合酯0.2％，余量為去離子水。
制備方法同實施例七。
實施例九
本實施例提供一種包括實施例六制備得到的清瀝草多糖的軟膏劑，原料組分按重量百分比計，包括：
清瀝草多糖5.0％、16～18醇4.0％、白油8.0％、硬脂酸單甘油酯2.0％、氮酮2.0％、棕櫚酸異辛酯2.0％、氫化羊毛脂1.0％、尼泊金復(fù)合酯0.2％，余量為去離子水。
制備方法同實施例七。
實施例十
本實施例提供一種包括實施例六制備得到的清瀝草多糖的軟膏劑，原料組分按重量百分比計，包括：
清瀝草多糖10.0％、16～18醇3.0％、白油10.0％、硬脂酸單甘油酯3.0％、氮酮2.5％、棕櫚酸異辛酯2.0％、氫化羊毛脂1.0％、尼泊金復(fù)合酯0.2％，余量為去離子水。
制備方法同實施例七。
實施例十一
本實施例提供一種包括實施例六制備得到的清瀝草多糖的軟膏劑，原料組分按重量百分比計，包括：
清瀝草多糖5.0％、16～18醇4.0％、白油8.0％、硬脂酸單甘油酯2.0％、氮酮2.0％、棕櫚酸異辛酯2.0％、氫化羊毛脂1.0％、尼泊金復(fù)合酯0.2％，余量為去離子水。
制備方法同實施例七。
將本發(fā)明實施例一至實施例六制備得到的清瀝草多糖，在溫度40±2℃、相對濕度75％±5％的條件下，放置6個月，每隔1個月取樣檢測多糖含量一次，多糖含量變化如圖1所示。從圖中可以看出，經(jīng)高溫穩(wěn)定性考察，多糖含量下降均在5％以內(nèi)，屬于可控范圍，說明制備的多糖穩(wěn)定性良好，制備方法可行。
將本發(fā)明實施例一至實施例六制備得到的清瀝草多糖、實施例七至實施例十一制備得到的包括清瀝草多糖的軟膏劑進行抑菌實驗。
實驗方法：選擇引起腳癬常見致病菌t.rubrum(紅色毛癬菌)、t.mentagrophytes(須毛癬菌)和e.floccosum(絮狀表皮癬菌)，通過對倍稀釋法測定抑制的最低濃度(mic值)。
實驗結(jié)果：測定得到的結(jié)果如下表1所示。從表中可以看出，制備的清瀝草多糖及包括清瀝草多糖的軟膏劑對引起腳癬常見致病菌紅色毛癬菌、須毛癬菌和絮狀表皮癬菌均有顯著的抑制作用，可用于腳癬的治療。
表1對典型致病菌的最低抑制濃度(mg.ml-1)
需要注意的是，除非另有說明，本申請使用的技術(shù)術(shù)語或者科學(xué)術(shù)語應(yīng)當(dāng)為本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的通常意義。除非另外具體說明，否則在這些實施例中闡述的部件和步驟的相對步驟、數(shù)字表達式和數(shù)值并不限制本發(fā)明的范圍。在這里示出和描述的所有示例中，除非另有規(guī)定，任何具體值應(yīng)被解釋為僅僅是示例性的，而不是作為限制，因此，示例性實施例的其他示例可以具有不同的值。
在本發(fā)明的描述中，需要理解的是，術(shù)語“第一”、“第二”僅用于描述目的，而不能理解為指示或暗示相對重要性或者隱含指明所指示的技術(shù)特征的數(shù)量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隱含地包括一個或者更多個該特征。在本發(fā)明的描述中，“多個”的含義是兩個以上，除非另有明確具體的限定。
最后應(yīng)說明的是：以上各實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其限制；盡管參照前述各實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：其依然可以對前述各實施例所記載的技術(shù)方案進行修改，或者對其中部分或者全部技術(shù)特征進行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實施例技術(shù)方案的范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護范圍當(dāng)中。