本發(fā)明屬于生物化工領(lǐng)域，具體涉及一種利用膜循環(huán)生物反應(yīng)器分階段制備l-鳥(niǎo)氨酸和丁二酸的方法。

背景技術(shù)：

l-鳥(niǎo)氨酸屬于堿性氨基酸，是活細(xì)胞中重要的代謝物，主要參與生物體內(nèi)的尿素循環(huán)，用于生物體內(nèi)瓜氨酸、精氨酸、脯氨酸、多胺的生物合成，具有保肝解毒和抗疲勞的功效。近年l-鳥(niǎo)氨酸在醫(yī)藥、保健領(lǐng)域的應(yīng)用日益廣泛，具有良好的市場(chǎng)前景。

微生物直接發(fā)酵法是生產(chǎn)l-鳥(niǎo)氨酸的重要來(lái)源，菌種主要為谷氨酸棒桿菌的精氨酸缺陷型菌株。專利zl201010286236.8公布了一種有氧發(fā)酵制備l-鳥(niǎo)氨酸的方法，以葡萄糖為碳源，l-鳥(niǎo)氨酸產(chǎn)量可達(dá)35～45g/l。專利zl201510024099.3公布了一種利用纖維床反應(yīng)器有氧發(fā)酵制備l-鳥(niǎo)氨酸的方法，可連續(xù)發(fā)酵多批，提高了發(fā)酵過(guò)程效率。發(fā)酵結(jié)束后衰老的谷氨酸棒桿菌均被作為固體廢渣處理，常被用于生產(chǎn)菌體蛋白飼料等附加值較低的產(chǎn)品，但是近年來(lái)的研究表明，谷氨酸棒桿菌在厭氧條件下可將大量葡萄糖轉(zhuǎn)化為丁二酸，這一發(fā)現(xiàn)使谷氨酸棒桿菌的應(yīng)用領(lǐng)域進(jìn)一步擴(kuò)大，因此通過(guò)有氧-厭氧發(fā)酵聯(lián)產(chǎn)l-鳥(niǎo)氨酸和丁二酸已被證明可行。目前一般采用離心或過(guò)濾的方式收集有氧發(fā)酵后的菌體，重新補(bǔ)充培養(yǎng)基后厭氧發(fā)酵制備丁二酸，但是這些處理方式對(duì)無(wú)菌潔凈環(huán)境的要求較高，在工業(yè)生產(chǎn)中極易感染雜菌和噬菌體，威脅生產(chǎn)。由此可見(jiàn)開(kāi)發(fā)一種工藝簡(jiǎn)單的l-鳥(niǎo)氨酸和丁二酸聯(lián)產(chǎn)的方法對(duì)將該技術(shù)應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)至關(guān)重要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種利用膜循環(huán)生物反應(yīng)器分階段制備l-鳥(niǎo)氨酸和丁二酸的方法，以解決現(xiàn)有技術(shù)存在的效率低下，溶液感染等問(wèn)題。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

所述的膜循環(huán)生物反應(yīng)器包括發(fā)酵罐、中空纖維膜組件和培養(yǎng)基儲(chǔ)罐；其中，發(fā)酵罐和中空纖維膜組件的進(jìn)料口連通，中空纖維膜組件的透過(guò)液出口通過(guò)透過(guò)液出口支路與培養(yǎng)基儲(chǔ)罐相連，中空纖維膜組件濃縮液出口通過(guò)管道與發(fā)酵罐連通；各相連管道上均設(shè)有閥門；

所述的方法它包括如下步驟：

(1)將培養(yǎng)后的谷氨酸棒桿菌種子液接入發(fā)酵罐中的有氧發(fā)酵培養(yǎng)基，進(jìn)行有氧發(fā)酵制備l-鳥(niǎo)氨酸；

(2)在步驟(1)中的有氧發(fā)酵完成后，將所得有氧發(fā)酵液經(jīng)中空纖維膜組件的進(jìn)料口泵入中空纖維膜組件中進(jìn)行循環(huán)分離，透過(guò)液經(jīng)中空纖維膜組件的透過(guò)液出口流出并收集，用于l-鳥(niǎo)氨酸的提?。粷饪s液經(jīng)中空纖維膜組件的濃縮液出口回流至發(fā)酵罐中；持續(xù)循環(huán)分離，直至發(fā)酵罐內(nèi)的有氧發(fā)酵液體積低于中空纖維膜組件膜分離的體積要求；

(3)將厭氧發(fā)酵培養(yǎng)基通過(guò)透過(guò)液出口支路泵入中空纖維膜組件中，經(jīng)濃縮液出口進(jìn)入發(fā)酵罐中，再通過(guò)透過(guò)液出口支路泵入去離子水將中空纖維膜組件內(nèi)殘留的厭氧發(fā)酵培養(yǎng)基和菌體壓入發(fā)酵罐中；厭氧發(fā)酵培養(yǎng)基和水都泵入完成后，在發(fā)酵罐中進(jìn)行厭氧發(fā)酵制備丁二酸；厭氧發(fā)酵完成后，將所得厭氧發(fā)酵液經(jīng)中空纖維膜組件的進(jìn)料口泵入中空纖維膜組件中，透過(guò)液從中空纖維膜組件的透過(guò)液出口流出并收集，用于丁二酸的提??；濃縮液由中空纖維膜組件的濃縮液出口回流至發(fā)酵罐中；持續(xù)循環(huán)分離，直至發(fā)酵罐內(nèi)的厭氧發(fā)酵液體積低于中空纖維膜組件膜分離的體積要求；

(4)完成步驟(3)中操作后，分別對(duì)發(fā)酵罐和膜組件進(jìn)行蒸汽和化學(xué)消毒處理，為下一批次的分階段發(fā)酵做準(zhǔn)備。

在有氧發(fā)酵和厭氧發(fā)酵完成前，所有連接管道上的閥門都處于關(guān)閉狀態(tài)。

步驟(1)中，所述的培養(yǎng)后的谷氨酸棒桿菌種子液由谷氨酸棒桿菌接種于種子培養(yǎng)基上培養(yǎng)得到；

其中，

培養(yǎng)基配方為：葡萄糖20g/l，k2hpo4·3h2o1.5g/l，kh2po40.5g/l，mgso4·7h2o0.4g/l，feso4·7h2o20mg/l，mnso4·h2o20mg/l，尿素2.5g/l，生物素100μg/l，精氨酸200mg/l，維生素b1200μg/l，ph7.0；110℃下滅菌10min；

培養(yǎng)條件為：搖瓶裝液量10％，接種量2％，30℃下200rpm震蕩培養(yǎng)10h。

其中，所述的谷氨酸棒桿菌已在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏編號(hào)為cgmccno.3991。該菌株已經(jīng)在專利“一種高產(chǎn)琥珀酸的谷氨酸棒桿菌”(申請(qǐng)?zhí)枺?01010578530.6)中公開(kāi)。

步驟(1)中，接入培養(yǎng)后的種子液前，先對(duì)發(fā)酵罐和有氧發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行蒸汽滅菌；蒸汽滅菌的條件為110℃，20min。

步驟(1)中，所述的有氧發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為：葡萄糖60～90g/l，k2hpo4·3h2o1.0g/l，kh2po41.0g/l，mgso4·7h2o0.25g/l，feso4·7h2o20mg/l，mnso4·h2o20mg/l，(nh4)2so440g/l，zncl21mg/l，cuso40.2mg/l，生物素100μg/l，精氨酸200mg/l，維生素b1200μg/l，ph7.0。

步驟(1)中，所述的有氧發(fā)酵的條件為：接種量為3～5％，發(fā)酵溫度為29～32℃，攪拌速度為300～500rpm；發(fā)酵過(guò)程中用氨水控制ph為6.7～7.0，并通入無(wú)菌空氣，通氣量為0.5～1.5vvm；發(fā)酵至殘留葡萄糖低于1g/l時(shí)，終止發(fā)酵。

步驟(2)中，在有氧發(fā)酵完畢前2小時(shí)，對(duì)中空纖維膜組件進(jìn)行化學(xué)消毒，具體操作如下：

用無(wú)菌水配制的4g/lnaoh經(jīng)透過(guò)液出口支路泵入中空纖維膜，循環(huán)清洗20min，清洗廢水經(jīng)進(jìn)料口支路和濃縮液出口支路排出，膜組件隨后用無(wú)菌水經(jīng)透過(guò)液出口支路泵入將其洗至出水為ph9以下；接著再將無(wú)菌水配制的5g/l檸檬酸經(jīng)透過(guò)液出口支路泵入中空纖維膜，循環(huán)清洗20min，隨后用無(wú)菌水將其洗至出水為ph6以上，即完成中空纖維膜的化學(xué)消毒。

步驟(2)中，所述的中空纖維膜組件中，中空纖維膜為微濾膜，膜孔徑為0.1～0.22μm。

步驟(3)中，所述的厭氧發(fā)酵基的配方為：葡萄糖40～80g/l，k2hpo4·3h2o0.5g/l，kh2po40.5g/l，mgso4·7h2o0.5g/l，feso4·7h2o6mg/l，mnso4·h2o6mg/l，生物素200μg/l，維生素b1200μg/l，ph7.0。

步驟(3)中，所述的厭氧發(fā)酵的條件為：發(fā)酵溫度為29～32℃，攪拌速度為150～200rpm；發(fā)酵過(guò)程中用20％的na2co3控制ph為6.5～6.8，并通入無(wú)菌co2氣體發(fā)酵，通氣量為0.1～0.2vvm；發(fā)酵至殘留葡萄糖低于1g/l時(shí)，終止發(fā)酵。

步驟(3)中，厭氧發(fā)酵培養(yǎng)基泵入發(fā)酵罐時(shí)，會(huì)經(jīng)過(guò)中空纖維膜過(guò)濾除菌，因此只需要泵入未消毒的厭氧發(fā)酵培養(yǎng)基即可。

步驟(3)中，當(dāng)厭氧發(fā)酵培養(yǎng)基泵入發(fā)酵罐后，繼續(xù)泵入少量去離子水將膜組件內(nèi)少量殘留的培養(yǎng)基壓入發(fā)酵罐中。

步驟(2)和(3)中，中空纖維膜組件分離發(fā)酵液時(shí)，每小時(shí)的循環(huán)體積流速為2～3.0vvh。

步驟(4)中，對(duì)發(fā)酵罐進(jìn)行蒸汽滅菌處理和對(duì)中空纖維膜組件進(jìn)行化學(xué)消毒的操作與步驟(1)和(2)中相同。

有益效果：

與現(xiàn)有l(wèi)-鳥(niǎo)氨酸發(fā)酵后通過(guò)離心回收菌體細(xì)胞用于厭氧發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸相比，本發(fā)明可避免菌體細(xì)胞暴露在外界空氣中，不但大幅降低了染菌幾率，還同時(shí)完成了對(duì)發(fā)酵液的除菌預(yù)處理，便于后期提取產(chǎn)品；通過(guò)膜組件對(duì)厭氧發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行過(guò)濾除菌可替代傳統(tǒng)的蒸汽殺菌，減少了能耗?？梢?jiàn)，本發(fā)明可降低同一菌株分階段制備l-鳥(niǎo)氨酸與丁二酸的操作難度，縮短了操作周期，適合規(guī)模化生產(chǎn)控制。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明所用膜循環(huán)生物反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2為膜循環(huán)生物反應(yīng)器化學(xué)消毒清洗中空纖維膜組件的示意圖；

圖3為膜循環(huán)生物反應(yīng)器分離發(fā)酵液的示意圖；

圖4為膜循環(huán)生物反應(yīng)器補(bǔ)充厭氧發(fā)酵培養(yǎng)基的示意圖。

具體實(shí)施方式

根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的內(nèi)容僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。

以下實(shí)施例采用的是5l發(fā)酵罐，蠕動(dòng)泵泵入速度1vvh＝5l/h，通氣速度1vvm＝5l/min。

實(shí)施例1

本發(fā)明及其它實(shí)施例中所述的膜循環(huán)生物反應(yīng)器如圖1所示，它包括反應(yīng)罐1、中空纖維膜組件2和培養(yǎng)基儲(chǔ)罐3；反應(yīng)罐1和中空纖維膜組件2的進(jìn)料口4以及濃縮液出口8相連；中空纖維膜組件2下方設(shè)有透過(guò)液出口6，并通過(guò)透過(guò)液出口支路7和培養(yǎng)基儲(chǔ)罐3相連；其中，濃縮液出口8處和進(jìn)料口4處分別設(shè)有濃縮液出口支路9和進(jìn)料口支路5，用于排出廢水。所有進(jìn)出口處和支路上均設(shè)有閥門。

如圖2所示，此時(shí)膜循環(huán)生物反應(yīng)器中正對(duì)中空纖維膜組件2進(jìn)行化學(xué)清洗消毒。此時(shí)，除進(jìn)料口支路5和濃縮液出口支路9上的閥門外，所有閥門均關(guān)閉。

如圖3所示，此時(shí)膜循環(huán)生物反應(yīng)器正在分離發(fā)酵液。此時(shí)，發(fā)酵罐中的發(fā)酵液從進(jìn)料口進(jìn)入中空纖維膜組件中，分離得到的透過(guò)液通過(guò)透過(guò)液出口流出，分離得到的濃縮液通過(guò)濃縮液出口回流至發(fā)酵罐中。此時(shí)，進(jìn)料口支路、濃縮液出口支路和透過(guò)液出口支路上的閥門關(guān)閉。

如圖4所示，此時(shí)膜循環(huán)生物反應(yīng)器中正在為發(fā)酵罐中補(bǔ)充厭氧發(fā)酵培養(yǎng)基。此時(shí)，厭氧發(fā)酵培養(yǎng)基從發(fā)酵培養(yǎng)基儲(chǔ)罐中由透過(guò)液出口支路經(jīng)透過(guò)液出口泵入中空纖維膜組件中，再經(jīng)濃縮液出口進(jìn)入發(fā)酵罐中。

實(shí)施例2

將5l發(fā)酵罐與孔徑為0.1μm的中空纖維膜組件串聯(lián)形成膜循環(huán)生物反應(yīng)器。將培養(yǎng)好的種子液接入已經(jīng)經(jīng)過(guò)蒸汽滅菌處理的發(fā)酵罐(裝液量為3l)中進(jìn)行有氧發(fā)酵，有氧發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖濃度為60g/l，接種量為3％，發(fā)酵溫度29℃，發(fā)酵過(guò)程中控制ph為6.7，無(wú)菌空氣的通氣量為0.5vvm，攪拌速度300rpm，發(fā)酵至40h，殘留葡萄糖低于1g/l時(shí)，終止發(fā)酵。發(fā)酵液中產(chǎn)l-鳥(niǎo)氨酸18.8g/l。打開(kāi)發(fā)酵罐與膜組件相連的閥門，使發(fā)酵罐與膜組件相連，發(fā)酵液通過(guò)蠕動(dòng)泵進(jìn)入膜組件進(jìn)行循環(huán)分離，循環(huán)流速體積流速為2vvh，分離出2.9l發(fā)酵液用于l-鳥(niǎo)氨酸的提取，細(xì)胞截留率為99％。

將通入的無(wú)菌空氣切換為無(wú)菌co2氣體，體積為3l的葡萄糖濃度為40g/l的厭氧發(fā)酵培養(yǎng)基由膜組件的濾出液出口泵入膜組件，同時(shí)打開(kāi)由膜組件返回發(fā)酵罐的閥門，泵入時(shí)的體積流速為3vvh，經(jīng)過(guò)中空纖維膜過(guò)濾的厭氧培養(yǎng)基將被攔截在膜組件內(nèi)的細(xì)胞反沖入發(fā)酵罐中，當(dāng)培養(yǎng)基輸送完畢后，繼續(xù)泵入200ml去離子水將膜組件內(nèi)少量殘留的培養(yǎng)基和細(xì)胞壓入發(fā)酵罐中，隨后關(guān)閉膜組件與發(fā)酵罐相連的所有閥門，并對(duì)膜組件進(jìn)行化學(xué)消毒清洗。厭氧發(fā)酵溫度29℃，發(fā)酵過(guò)程中控制ph為6.5，無(wú)菌co2氣體的通氣量為0.1vvm，攪拌速度150rpm，發(fā)酵28h至殘留葡萄糖低于1g/l時(shí)，丁二酸產(chǎn)量為28.4g/l，再次打開(kāi)相連的閥門，使發(fā)酵罐與膜組件相連，發(fā)酵液通過(guò)蠕動(dòng)泵進(jìn)入膜組件進(jìn)行循環(huán)分離，泵入時(shí)的體積流速為3vvh，分離出3.1l發(fā)酵液用于丁二酸的提取，細(xì)胞截留率為99％。

實(shí)施例3

將5l發(fā)酵罐與孔徑為0.22μm的中空纖維膜組件串聯(lián)形成膜循環(huán)生物反應(yīng)器。將培養(yǎng)好的種子液接入已經(jīng)經(jīng)過(guò)蒸汽滅菌處理的發(fā)酵罐(裝液量為3l)中進(jìn)行有氧發(fā)酵，有氧發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖濃度為80g/l，接種量為5％，發(fā)酵溫度30℃，發(fā)酵過(guò)程中控制ph為6.8，無(wú)菌空氣的通氣量為1.0vvm，攪拌速度500rpm，發(fā)酵至48h，殘留葡萄糖低于1g/l時(shí)，終止發(fā)酵。發(fā)酵液中產(chǎn)l-鳥(niǎo)氨酸26.8g/l。打開(kāi)發(fā)酵罐與膜組件相連的閥門，使發(fā)酵罐與膜組件相連，發(fā)酵液通過(guò)蠕動(dòng)泵進(jìn)入膜組件進(jìn)行循環(huán)分離，循環(huán)流速體積流速為2.5vvh，分離出2.85l發(fā)酵液用于l-鳥(niǎo)氨酸的提取，細(xì)胞截留率為98％。

將通入的無(wú)菌空氣切換為無(wú)菌co2氣體，體積為2.5l的葡萄糖濃度為60g/l的厭氧發(fā)酵培養(yǎng)基由膜組件的濾出液出口泵入膜組件，同時(shí)打開(kāi)由膜組件返回發(fā)酵罐的閥門，泵入時(shí)的體積流速為2vvh，經(jīng)過(guò)中空纖維膜過(guò)濾的厭氧培養(yǎng)基將被攔截在膜組件內(nèi)的細(xì)胞反沖入發(fā)酵罐中，當(dāng)培養(yǎng)基輸送完畢后，繼續(xù)泵入300ml去離子水將膜組件內(nèi)少量殘留的培養(yǎng)基和細(xì)胞壓入發(fā)酵罐中，隨后關(guān)閉膜組件與發(fā)酵罐相連的所有閥門，并對(duì)膜組件進(jìn)行化學(xué)消毒清洗。厭氧發(fā)酵溫度30℃，發(fā)酵過(guò)程中控制ph為6.8，無(wú)菌co2氣體的通氣量為0.2vvm，攪拌速度200rpm，發(fā)酵36h至殘留葡萄糖低于1g/l時(shí)，丁二酸產(chǎn)量為42.1g/l，再次打開(kāi)相連的閥門，使發(fā)酵罐與膜組件相連，發(fā)酵液通過(guò)蠕動(dòng)泵進(jìn)入膜組件進(jìn)行循環(huán)分離，泵入時(shí)的體積流速為3vvh，分離出2.7l發(fā)酵液用于丁二酸的提取，細(xì)胞截留率為98％。

實(shí)施例4

將5l發(fā)酵罐與孔徑為0.15μm的中空纖維膜組件串聯(lián)形成膜循環(huán)生物反應(yīng)器。將培養(yǎng)好的種子液接入已經(jīng)經(jīng)過(guò)蒸汽滅菌處理的發(fā)酵罐(裝液量為3l)中進(jìn)行有氧發(fā)酵，有氧發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖濃度為90g/l，接種量為4％，發(fā)酵溫度32℃，發(fā)酵過(guò)程中控制ph為7.0，無(wú)菌空氣的通氣量為1.5vvm，攪拌速度300rpm，發(fā)酵至58h，殘留葡萄糖低于1g/l時(shí)，終止發(fā)酵。發(fā)酵液中產(chǎn)l-鳥(niǎo)氨酸34.5g/l。打開(kāi)發(fā)酵罐與膜組件相連的閥門，使發(fā)酵罐與膜組件相連，發(fā)酵液通過(guò)蠕動(dòng)泵進(jìn)入膜組件進(jìn)行循環(huán)分離，循環(huán)流速體積流速為3vvh，分離出2.9l發(fā)酵液用于l-鳥(niǎo)氨酸的提取，細(xì)胞截留率為99％。將通入的無(wú)菌空氣切換為無(wú)菌co2氣體，體積為2.0l的葡萄糖濃度為80g/l的厭氧發(fā)酵培養(yǎng)基由膜組件的濾出液出口泵入膜組件，同時(shí)打開(kāi)由膜組件返回發(fā)酵罐的閥門，泵入時(shí)的體積流速為3vvh，經(jīng)過(guò)中空纖維膜過(guò)濾的厭氧培養(yǎng)基將被攔截在膜組件內(nèi)的細(xì)胞反沖入發(fā)酵罐中，當(dāng)培養(yǎng)基輸送完畢后，繼續(xù)泵入200ml去離子水將膜組件內(nèi)少量殘留的培養(yǎng)基和細(xì)胞壓入發(fā)酵罐中，隨后關(guān)閉膜組件與發(fā)酵罐相連的所有閥門，并對(duì)膜組件進(jìn)行化學(xué)消毒清洗。厭氧發(fā)酵溫度32℃，發(fā)酵過(guò)程中控制ph為7.0，無(wú)菌co2氣體的通氣量為0.1vvm，攪拌速度150rpm，發(fā)酵48h至殘留葡萄糖低于1g/l時(shí)，丁二酸產(chǎn)量為53.3g/l，再次打開(kāi)相連的閥門，使發(fā)酵罐與膜組件相連，發(fā)酵液通過(guò)蠕動(dòng)泵進(jìn)入膜組件進(jìn)行循環(huán)分離，泵入時(shí)的體積流速為2vvh，分離出2.2l發(fā)酵液用于丁二酸的提取，細(xì)胞截留率為99％。