本發(fā)明涉及一種生物物種鑒定方法，根據(jù)pcr和dna酶的特性，設(shè)計了一種基于dna酶顯色技術(shù)的產(chǎn)物識別技術(shù)，并依此建立一種快速靈敏的核酸篩查生物傳感器。

背景技術(shù)：

隨著生命科學(xué)與分析技術(shù)的發(fā)展，核酸固有的局限性使其檢測面臨著新的挑戰(zhàn)。在生物醫(yī)學(xué)分析及研究中會遇到靈敏度低和特異性差、待檢測核酸片段較短或者不能直接擴增等問題，因此，發(fā)展核酸探針信號放大檢測技術(shù)，實現(xiàn)高靈敏、高特異性檢測顯得尤為重要。下面重點介紹核酸探針與信號放大技術(shù)相結(jié)合的方法，包括聚合酶鏈?zhǔn)?pcr)放大技術(shù)、滾環(huán)(rca)放大技術(shù)、鏈置換(sda)放大技術(shù)、雜交鏈反應(yīng)(hcr)放大技術(shù)及dnazyme信號放大等。pcr是近年來應(yīng)用最廣的分子生物學(xué)技術(shù)，被廣泛用于分子診斷，靶標(biāo)檢測，分子克隆等領(lǐng)域。然而，傳統(tǒng)pcr檢測技術(shù)主要通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，染料檢測等方式，不僅需要專業(yè)的儀器設(shè)備，而且費時費力。pcr復(fù)雜的產(chǎn)物識別方法嚴(yán)重妨礙了其應(yīng)用于快速檢測領(lǐng)域。隨著功能核酸的發(fā)展，許多功能核酸因其獨特的結(jié)構(gòu)及其具有的物理化學(xué)特性被應(yīng)用到分子生物學(xué)研究中。近年來，功能核酸被用于構(gòu)建生物傳感器，從而開發(fā)出多種針對dna/rna，重金屬，生物毒素等靶標(biāo)的快速、高效、靈敏的檢測技術(shù)。

脫氧核酶(dnazyme)是通過指數(shù)富集配體的系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)由體外篩選分離得到的核酸序列，具有剪切rna分子或dna分子、t4聚核苷酸激酶樣活性、dna連接酶樣活性、催化活性等多種生物催化功能。它具有很高的化學(xué)穩(wěn)定性、造價低廉、容易合成和修飾的優(yōu)點。dnazyme已經(jīng)廣泛應(yīng)用于催化一系列化學(xué)和生物反應(yīng)中。g-四聚體是催化dnazyme一種。g-四聚體可以和陽離子卟啉如cu(ii)卟啉、zn(ii)卟啉、fe(iii)卟啉等作用，使離子卟啉和鳥嘌呤配位結(jié)合。g-四聚體可以作為載體和tmpyp4結(jié)合，通過高親和力核酸適體的靶向識別作用，定向運載到細(xì)胞表面，利用在其光照下產(chǎn)生單線態(tài)氧，實現(xiàn)對癌細(xì)胞的治療；g-四聚體也可以與血晶素hemin結(jié)合，形成g-四聚體/血晶素的復(fù)合結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)具有類似過氧化物酶的催化活性，可以催化過氧化氫h2o2氧化，從而使abts生成有色產(chǎn)物abts^.-，在顏色上呈現(xiàn)無色到綠色的變化，能夠快速判斷信號放大效果。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是開發(fā)一種基于pcr放大技術(shù)和dnazyme顯色技術(shù)的生物傳感器，達(dá)到高通量篩查分子靶標(biāo)的目標(biāo)。

本發(fā)明通過設(shè)計含有dnazyme序列的通用引物，一次性擴增多個靶標(biāo)。利用擴增產(chǎn)物中的dnazyme結(jié)構(gòu)進(jìn)行核酸比色檢測。整個技術(shù)操作簡便，不依賴昂貴儀器且對操作人員要求低，方法準(zhǔn)確無污染，能夠有效快速的篩選出核酸分子，可實現(xiàn)對待測樣品中的現(xiàn)場快速檢測。

為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供一種dna酶(即脫氧核酶，dnazyme)，其序列為5’-agggttgggcgggatggg3’(即seqid:no.1)。

本發(fā)明上述dna酶也可作為通用引物(ue-universalprimer)用于多重pcr反應(yīng)體系或檢測轉(zhuǎn)基因成分。

進(jìn)一步地，本發(fā)明還提供用于檢測(是否含有)轉(zhuǎn)基因成分的引物組，包括以下任一組引物或幾組引物，還包括上述dna酶(即脫氧核酶，dnazyme，即seqid:no.1；作為通用引物)：

第一組引物：

第二組引物：

第三組引物：

本發(fā)明還包括含有上述引物組(seqidno:1-7)的檢測裝置，所述檢測裝置包括核酸篩查試劑盒、核酸生物篩查傳感器。

本發(fā)明核酸生物篩查傳感器的設(shè)計思路是：首先將dnazyme序列的互補序列嵌合到pcr特異引物中，dnazyme序列作為通用引物(ue-universalprimer)序列添加到反應(yīng)中。pcr擴增過程中，通用引物中的dnazyme序列形成雙鏈dna片段。由于雙鏈dnazyme序列無法完成顯色反應(yīng)檢測，含有靶標(biāo)序列的反應(yīng)體系沒有顏色變化。而陰性反應(yīng)因為含有大量的單鏈dnazyme序列，因此能夠?qū)崿F(xiàn)較強的比色反應(yīng)，反應(yīng)體系由無色變?yōu)榫G色，從而區(qū)分出陽性擴增樣品。

進(jìn)一步地，為了達(dá)到良好的顯色效果，上述核酸篩查生物傳感器或核酸篩查試劑盒，還含有將所述dnazyme的3’端刪除3個堿基的引物，其核苷酸序列為：5’-agggttgggcgggat3’(即seqid:no.8)。

優(yōu)選地，所述將dnazyme的3’端刪除3個堿基的引物(即seqid:no.8)與dnazyme的比例為(1:1)-(5:1)，更優(yōu)選為1:1(0.2:0.2μm)。

本發(fā)明還包括上述引物組(seqidno:1-7)、檢測裝置(核酸篩查試劑盒或核酸篩查生物傳感器)在檢測(是否含有)轉(zhuǎn)基因成分中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供一種基于多重pcr和dnazyme比色技術(shù)篩查轉(zhuǎn)基因成分的方法，包括：

1)待測樣品提取dna；

2)以提取dna為模板，以上述引物組中的任一組引物或幾組引物(seqidno:2-7)為特異引物，以上述引物組中的dnazyme作為通用引物或者以上述dnazyme與所述將dnazyme的3’端刪除3個堿基的引物(即seqid:no.8)的混合物為通用引物，進(jìn)行pcr擴增；

優(yōu)選地，所述將dnazyme的3’端刪除3個堿基的引物(即seqid:no.8)與dnazyme的比例為(1:1)-(5:1)，更優(yōu)選為1:1(0.2μm:0.2μm)；

3)結(jié)果判斷：反應(yīng)體系沒有顏色變化的為含有轉(zhuǎn)基因；反應(yīng)體系由無色變?yōu)榫G色的為不含轉(zhuǎn)基因。

進(jìn)一步地，所述pcr反應(yīng)體系如下表所示：

進(jìn)一步地，所述待測樣品含有p35s，tnos或epsps基因。

本發(fā)明具有以下優(yōu)點：

1、首次將dnazyme應(yīng)用在多重pcr反應(yīng)體系中。

2、本傳感器的結(jié)果判讀程序簡單快速，適合現(xiàn)場快速診斷。

3、本傳感器具有良好的特異性，能夠?qū)κ惺凼称返倪M(jìn)行有效的核酸診斷分析。

4、本傳感器具有良好的靈敏度，檢測限為1％。

5、本傳感器能夠?qū)悠愤M(jìn)行樣品的高通量篩查檢測，可以一次快速檢測多個靶標(biāo)。

附圖說明

圖1表示實施例1中生物傳感器設(shè)計原理。

圖2表示實施例1中生物傳感器優(yōu)化結(jié)果。

圖3表示實施例1中生物傳感器靈敏度分析結(jié)果。

具體實施方式

以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例均按照常規(guī)實驗條件，如sambrook等分子克隆實驗手冊(sambrookj&russelldw,molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。

實施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件，或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可通過正規(guī)渠道商購買得到的常規(guī)產(chǎn)品。

以下所用pcr反應(yīng)體系：

實施例1

1、實驗材料：實驗中所用到的靶標(biāo)為轉(zhuǎn)基因作物，分別為mon87460，mon810，mon87701，mon87705，gt73，mon888302，h7-1，mon89788，j101andtt51-1，均有實驗室保存。多重pcr核酸篩查試劑盒購自大連寶生物公司。磷酸緩沖液(10mm磷酸二氫鉀，100mm氯化鉀，2mm氯化鎂，0.003％(v)tritonx-100，ph＝7.0)。儲存緩沖液(1.843g磷酸氫二鈉，0.933g檸檬酸，100ml，ph4.0)。

2、基因組提?。喊凑罩参锘蚪Mdna提取核酸篩查試劑盒(天根，北京)進(jìn)行提取，說明書如下：

(1)取植物干重組織約30mg，加入液氮充分碾磨。

(2)將研磨好的粉末迅速轉(zhuǎn)移到預(yù)先裝有700μl65℃預(yù)熱緩沖液gp1的離心管中(實驗前在預(yù)熱的gp1中加入巰基乙醇，使其終濃度為0.1％)，迅速顛倒混勻后，將離心管放在65℃水浴20min，水浴過程中顛倒離心管以混合樣品數(shù)次。

(3)加入700μl氯仿，充分混勻，12，000rpm離心5min。注:若提取富含多酚或淀粉的植物組織，可在第3步前，用酚:氯仿/1:1進(jìn)行等體積抽提。

(4)小心地將上一步所得上層水相轉(zhuǎn)入一個新的離心管中，加入700μl緩沖液gp2，充分混勻。

(5)將混勻的液體轉(zhuǎn)入吸附柱cb3中，12，000rpm離心30s，棄掉廢液。(吸附柱容積為700μl左右，可分次加入離心。)

(6)向吸附柱cb3中加入500μl緩沖液gd(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，12，000rpm離心30s，倒掉廢液，將吸附柱cb3放入收集管中。

(7)向吸附柱cb3中加入600μl漂洗液pw(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，12，000rpm離心30s，倒掉廢液，將吸附柱cb3放入收集管中。

(8)重復(fù)操作步驟7。

(9)將吸附柱cb3放回收集管中，12，000rpm離心2min，倒掉廢液。將吸附柱cb3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。

(10)將吸附柱cb3轉(zhuǎn)入一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50-200μl洗脫緩沖液te，室溫放置2-5min，12，000rpm離心2min，將溶液收集到離心管中。

3、引物設(shè)計：

通過primerexpress3.0設(shè)計軟件(美國生命技術(shù)公司)針對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中的篩選基因p35s，tnos和epsps基因設(shè)計pcr引物。

定性pcr所用引物

4、傳感器設(shè)計

設(shè)計思路：核酸篩查傳感器首先將dnazyme序列的互補序列嵌合到pcr特異引物中，dnazyme序列作為通用引物序列添加到反應(yīng)中。pcr擴增過程中，通用引物中的dnazyme序列形成雙鏈dna片段。由于雙鏈dnazyme序列無法完成顯色反應(yīng)檢測，含有靶標(biāo)序列的反應(yīng)體系沒有顏色變化。而陰性反應(yīng)因為含有大量的單鏈dnazyme序列，因此能夠?qū)崿F(xiàn)較強的比色反應(yīng)，反應(yīng)體系由無色變?yōu)榫G色，從而區(qū)分出陽性擴增樣品。

如圖1所示，核酸篩查傳感器首先將dnazyme序列的互補序列(圖1a圓圈中長鏈淺色部分)嵌合到pcr特異引物中，dnazyme序列(圖1a圓圈中雜亂短鏈)作為通用引物序列添加到反應(yīng)中。pcr擴增過程中，通用引物中的dnazyme序列形成雙鏈dna片段。pcr后加入80μl磷酸緩沖液和10μl氯高鐵血紅素(圖1淺色橢圓)，37℃孵育20min，而后加入30μl儲存緩沖液即可肉眼觀察顏色變化效果。由于雙鏈dnazyme序列無法完成顯色反應(yīng)檢測，含有靶標(biāo)序列的反應(yīng)體系沒有顏色變化。而陰性反應(yīng)因為含有大量的單鏈dnazyme序列，因此能夠?qū)崿F(xiàn)較強的比色反應(yīng)，反應(yīng)體系由無色變?yōu)榫G色，從而區(qū)分出陽性擴增樣品。

5、反應(yīng)體系優(yōu)化：為了達(dá)到良好的顯色效果，本發(fā)明設(shè)計了不同dnazyme序列長度的通用引物以及通用引物的混合比例。通過優(yōu)化發(fā)現(xiàn)，3’端刪除3個堿基的通用引物和原始通用引物混合且混合比例在在(1:1)-(5:1)為佳，尤以1:1(0.2μm:0.2μm)時效果最好。優(yōu)化后的傳感器能夠?qū)崿F(xiàn)分子靶標(biāo)的肉眼識別。結(jié)果見圖2；其中，圖a1和圖a2表示不同通用引物和混合比例的比色值(淺色為優(yōu)化結(jié)果，深色為對應(yīng)陰性比色結(jié)果)；圖b表示不同通用引物的比色情況；圖c表示不同引物混合比例的比色情況(與圖a2相對應(yīng))。

6、傳感器特異性分析

利用實驗室保存的轉(zhuǎn)基因樣品和市售食品進(jìn)行傳感器的特異性分析。通過實驗室保存的轉(zhuǎn)基因樣品和超市購買的食品的檢測，充分體現(xiàn)了本傳感器的特異性。通過邏輯門的運算可以最終判斷出樣品中是否含有轉(zhuǎn)基因成分，從而完成多靶標(biāo)的高通量篩查效果。本發(fā)明選取的p35s，tnos和epsps能夠覆蓋90％商業(yè)化的轉(zhuǎn)基因作物，因此能夠有效地篩查市場中的轉(zhuǎn)基因成分。結(jié)果見下表。

傳感器特異性分析

7、傳感器靈敏度分析

為了評定傳感器的靈敏性，將轉(zhuǎn)基因樣品mon87460和mon88302的基因組dna濃度稀釋成6個梯度，100％，50％20％，10％，1％和0.1％，進(jìn)行通用引物多重pcr和dnazyme比色研究。結(jié)果顯示，本傳感器可以檢測最低1％含量的轉(zhuǎn)基因樣品，即180個拷貝數(shù)。雖然本傳感器的靈敏度沒有很大的提高，但是其對于樣品的初篩和質(zhì)量控制依然有很大的應(yīng)用價值。結(jié)果見圖3。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。

序列表

<110>中國農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120>基于dna酶嵌合引物的核酸篩查生物傳感器

<130>khp171113743.8

<160>8

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

agggttgggcgggatggg18

<210>2

<211>41

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

tcccaacccgccctaccccatcattgcgataaaggaaaggc41

<210>3

<211>39

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

tcccaacccgccctaccctgctttgaagacgtggttgga39

<210>4

<211>38

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

tcccaacccgccctacccgaatcctgttgccggtcttg38

<210>5

<211>38

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

tcccaacccgccctacccttatcctagtttgcgcgcta38

<210>6

<211>40

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

tcccaacccgccctacccacggtgaccgtcttccagttac40

<210>7

<211>39

<212>dna

<213>人工序列

<400>7

tcccaacccgccctacccgaacaagcaaggcagcaacca39

<210>8

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>8

agggttgggcgggat15