本發(fā)明涉及基因變異率檢測(cè)方法領(lǐng)域，更具體的，本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)cdkn2b基因變異的試劑盒及cdkn2b基因變異率的定量檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
cdkn2b(cyclin-dependentkinase4inhibitorb)是細(xì)胞周期激酶抑制因子，毗鄰腫瘤抑制基因cdkn2a，是一個(gè)頻發(fā)突變的區(qū)域，這些變異可以在很多腫瘤病例檢測(cè)到。該基因編碼細(xì)胞周期激酶抑制因子，與cdk4或cdk6形成復(fù)合物，抑制細(xì)胞周期激酶的活性，通過(guò)控制細(xì)胞周期g1的進(jìn)程，功能蛋白是一種細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)作用。該基因的表達(dá)受到tgfbeta誘導(dǎo)，提示參與tgfbeta的生長(zhǎng)調(diào)控。
目前，cdkn2b基因的檢測(cè)主要用于臨床糖尿病人預(yù)測(cè)，并且由于很多基于cdk的抗腫瘤藥物已經(jīng)開(kāi)始臨床試驗(yàn)，該基因可以監(jiān)測(cè)藥物治療中的療效和預(yù)后，具有很高的臨床應(yīng)用價(jià)值，因此，cdkn2b的突變率檢測(cè)是目前的研究熱點(diǎn)之一。
現(xiàn)有技術(shù)中，采用常規(guī)定量pcr技術(shù)檢測(cè)cdkn2b的突變率，必須分為兩步或更多步驟，才能獲得該基因的變異率，使用不方便，花費(fèi)也高，限制了應(yīng)用。本文發(fā)明的新方法，可以在一個(gè)反應(yīng)體系內(nèi)完成cdkn2b表達(dá)水平和突變率兩個(gè)指標(biāo)的檢測(cè)，與現(xiàn)有方法比較，數(shù)據(jù)更加具有可比性，同時(shí)，節(jié)省時(shí)間和花費(fèi)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供了一種高效、簡(jiǎn)便且特異性和靈敏度高的cdkn2b基因變異率的定量檢測(cè)方法。
本發(fā)明第一方面，提供了一種用于檢測(cè)cdkn2b基因變異的試劑盒，所述試劑盒用于cdkn2b基因變異率的定量檢測(cè)；其中，所述試劑盒包含一對(duì)靶基因特異性引物和兩條不同熒光標(biāo)記的探針。
優(yōu)選的，所述試劑盒中，一對(duì)靶基因特異性引物為突變區(qū)引物和保守區(qū)引物，所述兩條不同熒光標(biāo)記的探針?lè)謩e為fam標(biāo)記的非突變探針，和vic標(biāo)記的突變探針；更進(jìn)一步的優(yōu)選，所述①突變區(qū)引物和vic標(biāo)記的突變探針的核苷酸序列分別為：
正向引物(forwardprimer)：cttatgcagttcctcaccaaagttt；
逆向引物(reverseprimer)：ggataggaagagaaccgcaagtt；
vic標(biāo)記的突變探針(probe)：vic-aggcaacaaatcca-none；
所述②保守區(qū)引物和fam標(biāo)記的非突變探針為如下產(chǎn)品：
assayidhs03922281_s1，
catalog#4426961，
abiproductusa。
本發(fā)明另一方面提供了一種cdkn2b基因變異率的定量檢測(cè)檢測(cè)方法，包括以下步驟：
(1)提取cdkn2b基因組dna作為模板；
(2)向反應(yīng)體系中加入pcr預(yù)混合液，權(quán)利要求1～3任一項(xiàng)所述的一對(duì)靶基因特異性引物和兩條不同熒光標(biāo)記的探針和dna模板進(jìn)行定量pcr；
(3)檢測(cè)步驟(3)突變區(qū)和非突變區(qū)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)(ct值)；
(4)根據(jù)步驟(4)突變區(qū)和非突變區(qū)ct值計(jì)算變異系數(shù)，即變異系數(shù)(％)＝突變ct值/非突變ct值x100。
上述方法中，優(yōu)選，步驟(1)dna的提取采用dneasyblood&tissuekit(qiagen產(chǎn)品)，按照說(shuō)明書指引提取血液或組織dna，鑒定dna濃度和質(zhì)量，-20℃存儲(chǔ)備用；進(jìn)一步的，優(yōu)選，步驟(2)反應(yīng)條件為：i)、50℃，2分鐘；ii)、95℃，10分鐘；iii)、95℃，15秒；iv)、59℃，1分鐘；其中iii)和iv)進(jìn)行45個(gè)循環(huán)；并且所述的pcr預(yù)混合液為2xmastermix。
在本發(fā)明的另一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式中，提供了一種cdkn2b基因變異率的定量檢測(cè)檢測(cè)方法，包括以下步驟：
(1)提取cdkn2b基因組dna：用dneasyblood&tissuekit(qiagen產(chǎn)品)，按照說(shuō)明書指引提取血液或組織dna；
(2)定量pcr：
反應(yīng)體系：
pcr預(yù)混合液選用2xmastermix(
引物(primer)-mf(50nm):0.5ul
引物(primer)-mr(50nm):0.5ul
探針(probe)-mp(250nm):0.5ul
hs03922281_s1:1.0ul
模板dna(10-20ng/ml):10ul
去離子水:7.5ul
總反應(yīng)體積＝40ul
反應(yīng)條件：i)、50℃，2分鐘；ii)、95℃，10分鐘；iii)、95℃，15秒；iv)、59℃，1分鐘；其中iii)和iv)進(jìn)行45個(gè)循環(huán)。
(3)檢測(cè)結(jié)果：變異系數(shù)(％)＝突變ct值/非突變ct值x100。
本發(fā)明所提供的的cdkn2b基因變異率的定量檢測(cè)方法的檢測(cè)結(jié)果判定方法如下：
反應(yīng)是由一套標(biāo)記了不同熒光的探針和引物組成，在檢索方案中，先由一對(duì)引物加不易發(fā)生變異區(qū)的熒光標(biāo)記探針(例如，優(yōu)選fam標(biāo)記的非突變探針，更優(yōu)選為試驗(yàn)碼(assayid)：hs03922281_s1，登記號(hào)(catalog#)：4426961，abi產(chǎn)品(abiproductusa))檢測(cè)總cdkn2b表達(dá)水平，同時(shí)，另外一個(gè)不同熒光標(biāo)記探針(例如優(yōu)選vic標(biāo)記的突變探針)位于變異區(qū)，如果發(fā)生變異，變異區(qū)探針不能結(jié)合擴(kuò)增產(chǎn)物，計(jì)數(shù)降低，最后，通過(guò)變異區(qū)與穩(wěn)定區(qū)計(jì)數(shù)差異和比值，計(jì)算出該基因的變異率。
變異率(％)＝(穩(wěn)定區(qū)總基因計(jì)數(shù)-變異區(qū)基因計(jì)數(shù))x100/穩(wěn)定區(qū)總基因計(jì)數(shù)。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明提供的試劑盒檢測(cè)靈敏度高；本發(fā)明所提供的cdkn2b基因變異率的定量檢測(cè)方法可以在一個(gè)反應(yīng)體系內(nèi)完成cdkn2b表達(dá)水平和突變率兩個(gè)指標(biāo)的檢測(cè)，與現(xiàn)行方法比較，數(shù)據(jù)更加具有可比性，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確率更高，同時(shí)，節(jié)省時(shí)間和花費(fèi)。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步，應(yīng)當(dāng)理解，以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1cdkn2b基因變異率的定量檢測(cè)方法
(1)提取cdkn2b基因組dna：用dneasyblood&tissuekit(qiagen產(chǎn)品)，按照說(shuō)明書指引提取血液或組織dna；
(2)定量pcr：
反應(yīng)體系：
pcr預(yù)混合液選用2xmastermix(
引物(primer)-mf(50nm):0.5ul
引物(primer)-mr(50nm):0.5ul
探針(probe)-mp(250nm):0.5ul
hs03922281_s1:1.0ul
模板dna(10-20ng/ml):10ul
去離子水:7.5ul
總反應(yīng)體積＝40ul
反應(yīng)條件為：i)、50℃，2分鐘；ii)、95℃，10分鐘；iii)、95℃，15秒；iv)、59℃，1分鐘；其中iii)和iv)進(jìn)行45個(gè)循環(huán)。
(3)檢測(cè)結(jié)果：變異系數(shù)(％)＝突變ct值/非突變ct值x100。
當(dāng)變異系數(shù)大于正常人對(duì)照3倍以上者為異常。
上述診斷結(jié)果可以用于具有消化道，泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤的輔助性診斷。
以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。