本發(fā)明屬于生物醫(yī)用材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種牛跟腱ⅰ型膠原的提取方法。

背景技術(shù)：

膠原是脊椎動(dòng)物體內(nèi)含量最多的一類蛋白質(zhì)，也是細(xì)胞外基質(zhì)的四大組分之一。它含有一個(gè)或幾個(gè)由α鏈組成的三螺旋結(jié)構(gòu)的區(qū)域，該獨(dú)特的三螺旋結(jié)構(gòu)及其分子之間的共價(jià)交聯(lián)，賦予膠原纖維極高的抗拉強(qiáng)度和熱穩(wěn)定性，也是膠原與細(xì)胞發(fā)揮相互作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

現(xiàn)有的提取方法中，提取的膠原純度低，如何提取高純度的具有三螺旋結(jié)構(gòu)的ⅰ型膠原成為了亟待解決的技術(shù)難題。硬腦膜/硬脊膜在外傷以及腫瘤侵及時(shí)，可能造成不同程度的腦膜/脊膜的損傷與缺損，繼而導(dǎo)致腦脊液滲漏，繼發(fā)感染。目前提取的材料可能會(huì)引起排斥反應(yīng)，且由于局部組織的反應(yīng)，可造成對(duì)腦組織的刺激，形成癜痕或包裹反應(yīng)、腦膜炎癥狀或出血等嚴(yán)重并發(fā)癥，目前的修復(fù)材料大都依賴進(jìn)口，價(jià)格昂貴。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種牛跟腱ⅰ型膠原的提取方法，該方法簡(jiǎn)單且對(duì)設(shè)備要求低，制備的產(chǎn)品純度及得率高。

本發(fā)明為了實(shí)現(xiàn)上述目的所采用的技術(shù)方案為：

本發(fā)明提供了一種牛跟腱ⅰ型膠原的提取方法，包括以下步驟：

（1）將新鮮牛跟腱洗凈后，去除脂肪、腱膜及肌肉，切塊，加入碳酸氫鈉水溶液浸泡16h，取出后去離子水清洗，晾干得純牛跟腱；

（2）將純牛跟腱加入到含有三乙醇胺的肉豆蔻酸溶液中浸泡2-3h，取出后去離子水清洗，晾干；

（3）將液氮中加入上述晾干的牛跟腱，待不沸騰后研磨成粉末，得牛跟腱粉末；

（4）取20g牛跟腱粉末，加入1000ml醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，加入胃蛋白酶,角鯊烯，攪拌均勻后，在35-37℃下，攪拌酶解40-50h，然后加入二疏基乙酸乙二醇酯，在28-30℃下，振蕩反應(yīng)2-3h，得酶解液；

（5）將酶解液鹽析透析后，得牛跟腱ⅰ型膠原。

進(jìn)一步的，所述碳酸氫鈉水溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%。

進(jìn)一步的，所述肉豆蔻酸溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5-8%。

上述每1l肉豆蔻酸溶液中含有三乙醇胺的含量為0.1-0.15g。

進(jìn)一步的，所述醋酸-醋酸鈉緩沖溶液的ph值為3.5。

進(jìn)一步的，所述胃蛋白酶的加入量占牛跟腱粉末重量的0.6-0.8%。

進(jìn)一步的，所述角鯊烯的加入量占牛跟腱粉末重量的0.2-0.3%。

進(jìn)一步的，所述二疏基乙酸乙二醇酯同牛跟腱粉末的質(zhì)量比為0.5：1。

本發(fā)明創(chuàng)造性的將牛跟腱浸泡于肉豆蔻酸溶液中，通過(guò)加入少量的三乙醇胺，能夠?qū)ε８斓拿撝幚砀訌氐祝コ^大部分可溶性酯類等物質(zhì)，提高后期的提取效率，同時(shí)提高產(chǎn)品的純度。發(fā)明人經(jīng)過(guò)大量實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供的提取方法，能夠提高酶解效率，減少酶解的時(shí)間，同時(shí)，能夠提高所得產(chǎn)品的純度。本發(fā)明所采用的鹽析透析方法采用現(xiàn)有方法即可。

本發(fā)明的有益效果為：

（1）本發(fā)明提供的制備方法簡(jiǎn)單，對(duì)設(shè)備要求低；

（2）本發(fā)明所得產(chǎn)品為高純度的具有三螺旋結(jié)構(gòu)的ⅰ型膠原，不會(huì)對(duì)神經(jīng)組織產(chǎn)生機(jī)械性損傷，生物相容性好。

具體實(shí)施方式

為了更好地理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，下面通過(guò)具體實(shí)施例和臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行進(jìn)一步的闡述。

實(shí)施例1

1.1將新鮮牛跟腱洗凈后，去除脂肪、腱膜及肌肉，切塊(塊的大小可以為0.5cm×0.5cm)，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的碳酸氫鈉水溶液浸泡16h（碳酸氫鈉水溶液沒(méi)過(guò)牛肉即可），取出后去離子水清洗，晾干得純牛跟腱；

1.2將純牛跟腱加入到含有三乙醇胺的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的肉豆蔻酸溶液中浸泡2-3h，取出后去離子水清洗，晾干；

所述每1l肉豆蔻酸溶液中含有三乙醇胺的含量為0.15g；

1.3將液氮中加入上述晾干的牛跟腱，待不沸騰后研磨成粉末，得牛跟腱粉末；

1.4取20g牛跟腱粉末，加入1000ml醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，加入占牛跟腱粉末重量的0.6%的胃蛋白酶,占牛跟腱粉末重量的0.2%角鯊烯，攪拌均勻后，在35-37℃下，攪拌酶解40-50h，然后加入二疏基乙酸乙二醇酯，在28-30℃下，振蕩反應(yīng)2-3h，得酶解液；

二疏基乙酸乙二醇酯同牛跟腱粉末的質(zhì)量比為0.5：1；

1.5將酶解液鹽析透析后，得牛跟腱ⅰ型膠原。

實(shí)施例2

2.1將新鮮牛跟腱洗凈后，去除脂肪、腱膜及肌肉，切塊(塊的大小可以為0.5cm×0.5cm)，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的碳酸氫鈉水溶液浸泡16h（碳酸氫鈉水溶液沒(méi)過(guò)牛肉即可），取出后去離子水清洗，晾干得純牛跟腱；

2.2將純牛跟腱加入到含有三乙醇胺的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.5%的肉豆蔻酸溶液中浸泡2-3h，取出后去離子水清洗，晾干；

所述每1l肉豆蔻酸溶液中含有三乙醇胺的含量為0.12g；

2.3將液氮中加入上述晾干的牛跟腱，待不沸騰后研磨成粉末，得牛跟腱粉末；

2.4取20g牛跟腱粉末，加入1000ml醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，加入占牛跟腱粉末重量的0.8%的胃蛋白酶,占牛跟腱粉末重量的0.3%角鯊烯，攪拌均勻后，在35-37℃下，攪拌酶解40-50h，然后加入二疏基乙酸乙二醇酯，在28-30℃下，振蕩反應(yīng)2-3h，得酶解液；

二疏基乙酸乙二醇酯同牛跟腱粉末的質(zhì)量比為0.5：1；

2.5將酶解液鹽析透析后，得牛跟腱ⅰ型膠原。

實(shí)施例3

3.1將新鮮牛跟腱洗凈后，去除脂肪、腱膜及肌肉，切塊(塊的大小可以為0.5cm×0.5cm)，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的碳酸氫鈉水溶液浸泡16h（碳酸氫鈉水溶液沒(méi)過(guò)牛肉即可），取出后去離子水清洗，晾干得純牛跟腱；

3.2將純牛跟腱加入到含有三乙醇胺的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%的肉豆蔻酸溶液中浸泡2-3h，取出后去離子水清洗，晾干；

所述每1l肉豆蔻酸溶液中含有三乙醇胺的含量為0.1g；

3.3將液氮中加入上述晾干的牛跟腱，待不沸騰后研磨成粉末，得牛跟腱粉末；

3.4取20g牛跟腱粉末，加入1000ml醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，加入占牛跟腱粉末重量的0.7%的胃蛋白酶,占牛跟腱粉末重量的0.3%角鯊烯，攪拌均勻后，在35-37℃下，攪拌酶解40-50h，然后加入二疏基乙酸乙二醇酯，在28-30℃下，振蕩反應(yīng)2-3h，得酶解液；

二疏基乙酸乙二醇酯同牛跟腱粉末的質(zhì)量比為0.5：1；

3.5將酶解液鹽析透析后，得牛跟腱ⅰ型膠原。

對(duì)比例1（純度不夠，影響提取效率）不加三乙醇胺

1.1將新鮮牛跟腱洗凈后，去除脂肪、腱膜及肌肉，切塊(塊的大小可以為0.5cm×0.5cm)，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的碳酸氫鈉水溶液浸泡16h（碳酸氫鈉水溶液沒(méi)過(guò)牛肉即可），取出后去離子水清洗，晾干得純牛跟腱；

1.2將純牛跟腱加入到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%的肉豆蔻酸溶液中浸泡2-3h，取出后去離子水清洗，晾干；

1.3將液氮中加入上述晾干的牛跟腱，待不沸騰后研磨成粉末，得牛跟腱粉末；

1.4取20g牛跟腱粉末，加入1000ml醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，加入占牛跟腱粉末重量的0.7%的胃蛋白酶,占牛跟腱粉末重量的0.3%角鯊烯，攪拌均勻后，在35-37℃下，攪拌酶解40-50h，然后加入二疏基乙酸乙二醇酯，在28-30℃下，振蕩反應(yīng)2-3h，得酶解液；

二疏基乙酸乙二醇酯同牛跟腱粉末的質(zhì)量比為0.5：1；

1.5將酶解液鹽析透析后，得牛跟腱ⅰ型膠原。

對(duì)比例2（提取時(shí)間長(zhǎng)，純度?。┎患咏酋徬?/p>

2.1將新鮮牛跟腱洗凈后，去除脂肪、腱膜及肌肉，切塊(塊的大小可以為0.5cm×0.5cm)，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的碳酸氫鈉水溶液浸泡16h（碳酸氫鈉水溶液沒(méi)過(guò)牛肉即可），取出后去離子水清洗，晾干得純牛跟腱；

2.2將純牛跟腱加入到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%的肉豆蔻酸溶液中浸泡2-3h，取出后去離子水清洗，晾干；

2.3將液氮中加入上述晾干的牛跟腱，待不沸騰后研磨成粉末，得牛跟腱粉末；

2.4取20g牛跟腱粉末，加入1000ml醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，加入占牛跟腱粉末重量的0.7%的胃蛋白酶，攪拌均勻后，在35-37℃下，攪拌酶解40-50h，然后加入二疏基乙酸乙二醇酯，在28-30℃下，振蕩反應(yīng)2-3h，得酶解液；

二疏基乙酸乙二醇酯同牛跟腱粉末的質(zhì)量比為0.5：1；

2.5將酶解液鹽析透析后，得牛跟腱ⅰ型膠原。

對(duì)比例3

3.1將新鮮牛跟腱洗凈后，去除脂肪、腱膜及肌肉，切塊(塊的大小可以為0.5cm×0.5cm)，用氯化鈉溶液浸泡，去除雜質(zhì)，晾干待用；

3.2將晾干的牛跟腱丙酮浸泡脫脂；然后采用透析袋處理后，利用胃蛋白酶進(jìn)行提取。

效果實(shí)施例

（一）將實(shí)施例1-3及對(duì)比例1-3提取的膠原蛋白進(jìn)行提取率及純度的檢測(cè)，具體結(jié)果見(jiàn)表1。

表1

（二）將本發(fā)明實(shí)施例提取的膠原應(yīng)用18克高純度的具有三螺旋結(jié)構(gòu)的i型醫(yī)用膠原材料在鹽酸的環(huán)境下采用28,000轉(zhuǎn)速攪拌15分鐘制成2.5%濃度的膠原復(fù)合懸濁液。其后使用氫氧化鈉調(diào)節(jié)其酸堿度和100%酒精，使之達(dá)到粘稠度符合要求的狀態(tài)。繼續(xù)攪拌15分鐘。取500毫升倒入50x50厘米的冷凍托盤中，于-75攝氏度的低溫條件下，冷凍3～6小時(shí)，干燥25小時(shí)，制成孔隙小于20微米，2毫米厚的腦膜/脊膜生物膜片。

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：將3只雄性獵狗進(jìn)行右側(cè)前外側(cè)顱骨切除術(shù)。用直徑3厘米的環(huán)鉆行行右前外側(cè)頂骨切開(kāi)術(shù)。不損傷任何顱骨下組織。小心止血后將其下的硬腦膜提起，小心的剪切直徑3厘米的硬腦膜。保護(hù)其下的蛛網(wǎng)膜和軟腦膜不受任何損傷。

將分別采用實(shí)施例1-3直徑3.5厘米的生物膜片小心的植入硬腦膜缺損的部位，覆蓋硬腦膜的缺損部位和腦實(shí)質(zhì)的表面而進(jìn)行縫合。其后小心止血后將切除的顱骨瓣放回顱骨缺損的部位。

術(shù)后動(dòng)物全部健康成活，無(wú)任何神經(jīng)，精神異常癥狀，無(wú)腦脊液滲漏，無(wú)感染。6周后處死動(dòng)物，用直徑6厘米的環(huán)鉆以第一次手術(shù)骨瓣復(fù)位后的原顱骨的中心為新中心，擴(kuò)大范圍切除顱骨，暴露其下的硬腦膜和腦實(shí)質(zhì)組織。

肉眼觀察：3只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的右前外側(cè)頂骨愈合亮好，無(wú)任何感染。掀開(kāi)骨瓣后，顱骨和硬腦膜間無(wú)明顯粘連，新生的硬腦膜組織光滑，硬腦膜，蛛網(wǎng)膜和腦實(shí)質(zhì)間無(wú)明顯粘連和瘢痕。腦實(shí)質(zhì)表面正常，無(wú)任何退化性改變。

組織學(xué)檢查：將顱骨/硬腦膜/腦實(shí)質(zhì)整體切除。經(jīng)脫鈣，臘塊包埋后，制成5～6微米厚的切片經(jīng)he染色后觀察組織學(xué)形態(tài)。

顯微鏡下常規(guī)切片檢查均未發(fā)現(xiàn)異常組織細(xì)胞出現(xiàn)。整體顯示為序的成纖維細(xì)胞和纖維結(jié)碲組織。和正常硬腦膜相比除在新生硬腦膜基底有活動(dòng)性新生細(xì)胞分化外，在結(jié)構(gòu)，形態(tài)和正常硬腦膜無(wú)異。無(wú)粘連，無(wú)瘢痕形成。偏光顯微鏡下顯示新生的纖維組織

呈現(xiàn)出i型膠原特有的結(jié)構(gòu)-階段性光譜結(jié)構(gòu)，而且植入的膠原膜均已降解吸收，無(wú)任何殘留的膠原材料。

但是對(duì)比例3制備的膜片進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)過(guò)程中，出現(xiàn)癲痕形成的案例。