本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種與辣椒辣味相關(guān)的snp標(biāo)記及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：辣椒(capsicumspp.)的“辣味”，由辣椒果實(shí)特有的辣椒素引起的灼痛感，辣椒辣味的有無為質(zhì)量性狀，由顯性pun(最早用c表示)基因位點(diǎn)控制，pun基因的突變導(dǎo)致辣椒辣味的丟失，產(chǎn)生人們所說的甜椒。在辣椒遺傳育種中常根據(jù)不同的育種目標(biāo)，選擇辣椒或者甜椒育種材料，但往往要等到辣椒果實(shí)成熟后才進(jìn)行選擇，比較費(fèi)時(shí)。分子標(biāo)記輔助育種針對(duì)基因型篩選種質(zhì)資源，避免表型選擇的盲目性，大大縮短育種進(jìn)程，提高育種效率。獲得與辣椒辣味性狀連鎖的分子標(biāo)記，特別是針對(duì)目標(biāo)基因的關(guān)鍵突變位點(diǎn)開發(fā)的功能性分子標(biāo)記是利用分子標(biāo)記輔助辣椒辣味轉(zhuǎn)育，實(shí)現(xiàn)種質(zhì)創(chuàng)新的重要條件。雖然基于pcr和電泳技術(shù)的分子標(biāo)記輔助選擇可大大提高效率，但仍存在成本較高、通量低等問題。kaspar技術(shù)的snp分子標(biāo)記的高靈敏度和高通量，以及成本較低、易操作等優(yōu)點(diǎn)在分子標(biāo)記輔助選擇中具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種與辣椒辣味相關(guān)的snp標(biāo)記及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的應(yīng)用具體為辣椒基因組中如下snp位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性或用于檢測(cè)辣椒基因組中如下snp位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性的物質(zhì)在鑒定或輔助鑒定辣椒辣味性狀中的應(yīng)用；所述snp位點(diǎn)在辣椒基因組中對(duì)應(yīng)于序列表中序列4所示核苷酸序列的第24位；所述snp位點(diǎn)處的核苷酸為a或c。本發(fā)明還提供了一種用于鑒定或輔助鑒定辣椒辣味性狀的試劑。本發(fā)明所提供的用于鑒定或輔助鑒定辣椒辣味性狀的試劑，具體是用于檢測(cè)辣椒基因組中如下snp位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性的物質(zhì)；所述snp位點(diǎn)在辣椒基因組中對(duì)應(yīng)于序列表中序列4所示核苷酸序列的第24位；所述snp位點(diǎn)處的核苷酸為a或c。具體的，所述“用于檢測(cè)辣椒基因組中如下snp位點(diǎn)的單核苷酸多態(tài)性的物質(zhì)”可為如下a)或b)：a)成套單鏈dna甲，為如下(a1)或(a2)：(a1)由序列表中序列1的第22-45位核苷酸所示的單鏈dna、序列表中序列2的第22-45位核苷酸所示的單鏈dna、和序列表中序列3所示的單鏈dna組成的成套單鏈dna。(a2)由將序列表中序列1的第22-45位核苷酸、序列表中序列2的第22-45位核苷酸和序列3經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的三條單鏈dna分子組成的，且與(a1)中所述成套單鏈dna功能相同的成套單鏈dna。b)成套單鏈dna乙，為如下(b1)或(b2)：(b1)由序列表中序列1所示的單鏈dna、序列表中序列2所示的單鏈dna、和序列表中序列3所示的單鏈dna組成的成套單鏈dna。(b2)由將序列表中序列1、序列2和序列3經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的三條單鏈dna分子組成的，且與(b1)中所述成套單鏈dna功能相同的成套單鏈dna。含有所述試劑用于鑒定或輔助鑒定辣椒辣味性狀的試劑盒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。具體的，所述試劑盒中還含有熒光探針a、熒光探針b、淬滅探針a和淬滅探針b；所述熒光探針a的核苷酸序列為序列表中序列1的第1-21位，5’末端連接熒光基團(tuán)a；所述淬滅探針a的核苷酸序列為序列表中序列1的第1-21位的反向互補(bǔ)序列，3’末端連接淬滅基團(tuán)；所述熒光探針b的核苷酸序列為序列表中序列2的第1-21位，5’末端連接熒光基團(tuán)b；所述淬滅探針b的核苷酸序列為序列表中序列2的第1-21位的反向互補(bǔ)序列，3’末端連接淬滅基團(tuán)。在本發(fā)明中，所述熒光基團(tuán)a具體為fam；所述熒光基團(tuán)b具體為hex；所述淬滅基團(tuán)具體為q。在本發(fā)明中，所述熒光探針a、所述熒光探針b、所述淬滅探針a和所述淬滅探針b是存在于kaspv4.02×mastermix96/384,lowrox中的，其中所述kaspv4.02×mastermix96/384,lowrox為英國lgc公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號(hào)為kbs-1016-017。所述試劑或所述試劑盒在鑒定或輔助鑒定辣椒辣味性狀中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明還提供了一種鑒定或輔助鑒定待測(cè)辣椒為有辣味辣椒還是無辣味辣椒的方法。本發(fā)明所提供的鑒定或輔助鑒定待測(cè)辣椒為有辣味辣椒還是無辣味辣椒的方法，具體可包括如下步驟：檢測(cè)待測(cè)辣椒的基因組中如下snp位點(diǎn)處的核苷酸為a還是c還是a和c，以確定所述待測(cè)辣椒的基因型是a:a還是c:c還是a:c，根據(jù)所述待測(cè)辣椒的基因型按照如下確定所述待測(cè)辣椒為有辣味辣椒還是無辣味辣椒：若所述待測(cè)辣椒為a:a基因型或a:c基因型，則所述待測(cè)辣椒為或候選為有辣味辣椒；若所述待測(cè)辣椒為c:c基因型，則所述待測(cè)辣椒為或候選為無辣味辣椒。所述snp位點(diǎn)在辣椒基因組中對(duì)應(yīng)于序列表中序列4所示核苷酸序列的第24位；所述snp位點(diǎn)處的核苷酸為a或c。所述a:a基因型為辣椒基因組中對(duì)應(yīng)于序列表中序列4所示核苷酸序列的第24位為a的純合型。所述c:c基因型為辣椒基因組中對(duì)應(yīng)于序列表中序列4所示核苷酸序列的第24位為c的純合型。所述a:c基因型為辣椒基因組中對(duì)應(yīng)于序列表中序列4所示核苷酸序列的第24位為a和c的雜合型。在所述方法中，所述“檢測(cè)待測(cè)辣椒的基因組中如下snp位點(diǎn)處的核苷酸為a還是c還是a和c”的方法具體可為kaspar檢測(cè)法。所述kaspar檢測(cè)法具體可包括如下兩個(gè)步驟：kaspar擴(kuò)增和對(duì)所述kaspar擴(kuò)增所得產(chǎn)物進(jìn)行熒光掃描從而確定所述snp位點(diǎn)處的核苷酸為a還是c還是a和c；所述kaspar擴(kuò)增的模板為所述待測(cè)辣椒的基因組dna，所用的kaspar引物滿足如下條件：以所述待測(cè)辣椒的基因組dna為模板進(jìn)行kaspar擴(kuò)增所得擴(kuò)增產(chǎn)物的序列含有序列表中序列4。進(jìn)一步，在所述kaspar檢測(cè)法中，所述kaspar引物為所述成套單鏈dna乙(由序列表中序列1、序列2和序列3所示的單鏈dna組成的成套單鏈dna)。更加具體的，所述kaspar檢測(cè)法包括如下步驟：以所述待測(cè)辣椒的基因組dna為模板，采用所述試劑盒(kaspar擴(kuò)增所用引物為所述成套單鏈dna乙，擴(kuò)增試劑中含有熒光探針a、熒光探針b、淬滅探針a和淬滅探針b；所述熒光探針a的核苷酸序列為序列表中序列1的第1-21位，5’末端連接熒光基團(tuán)fam；所述淬滅探針a的核苷酸序列為序列表中序列1的第1-21位的反向互補(bǔ)序列，3’末端連接淬滅基團(tuán)q；所述熒光探針b的核苷酸序列為序列表中序列1的第1-21位，5’末端連接熒光基團(tuán)hex；所述淬滅探針b的核苷酸序列為序列表中序列1的第1-21位的反向互補(bǔ)序列，3’末端連接淬滅基團(tuán)q)進(jìn)行kaspar擴(kuò)增，然后采用rochelc480進(jìn)行數(shù)據(jù)讀取，按照如下確定所述待測(cè)辣椒基因組中所述snp位點(diǎn)處的核苷酸為a還是c還是a和c：若所述待測(cè)辣椒的擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)數(shù)據(jù)經(jīng)rochelc480分析在所得分型聚類圖中呈現(xiàn)藍(lán)色(allelex)，則所述待測(cè)辣椒基因組中所述snp位點(diǎn)處的核苷酸為a；若所述待測(cè)辣椒的擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)數(shù)據(jù)經(jīng)rochelc480分析在所得分型聚類圖中呈現(xiàn)綠色(alleley)，則所述待測(cè)辣椒基因組中所述snp位點(diǎn)處的核苷酸為c；若所述待測(cè)辣椒的擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)數(shù)據(jù)經(jīng)rochelc480分析在所得分型聚類圖中呈現(xiàn)紅色(bothalleles)，則所述待測(cè)辣椒基因組中所述snp位點(diǎn)處的核苷酸為a和c。所述試劑或所述試劑盒或所述方法在辣椒育種中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述試劑或所述試劑盒或所述方法如下在(a)或(b)中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍：(a)有辣味辣椒篩選；(b)有辣味辣椒親本和無辣味辣椒親本的雜交種的純度輔助鑒定。如下(a)或(b)的方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍：(a)培育有辣味辣椒品種的方法，包括選擇a:a基因型的辣椒作為親本進(jìn)行育種的步驟；所述a:a基因型為辣椒基因組中對(duì)應(yīng)于序列表中序列4所示核苷酸序列的第24位為a的純合型。(b)培育無辣味辣椒品種的方法，包括選擇c:c基因型的辣椒作為親本進(jìn)行育種的步驟；所述c:c基因型為辣椒基因組中對(duì)應(yīng)于序列表中序列4所示核苷酸序列的第24位為c的純合型。在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述辣椒具體選自如下材料或雜交后代(如f1代)：cm334、perennial、小馬賽、h3、77013a、0601m、83-60、77013a×cm334、77013a×perennial、77013a×小馬賽、77013a×h3、77013a×0601m、83-60×h3、0819、kls、83-163、0516、carolinawonder、dh330、0818、7714、益都紅、雞澤椒、豬大腸、茄門、望都椒、04q-29、04q-15、04q-29×04q-15。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是不需通過辣椒果實(shí)成熟期鑒定，只是在苗期對(duì)辣椒植株的dna檢測(cè)，就可以判斷辣椒辣味的有無，可以廣泛應(yīng)用到分子標(biāo)記輔助育種。并且該標(biāo)記可用kaspar基因分型技術(shù)進(jìn)行大批量檢測(cè)，可以提高效率，縮短鑒定時(shí)間。本發(fā)明提供的分子標(biāo)記實(shí)現(xiàn)了在苗期對(duì)辣味辣椒的篩選和雜交種純度的鑒定，大大縮短了育種時(shí)間，節(jié)約了人力物力。通過利用本發(fā)明提供的特異性引物并采用kaspar基因分型技術(shù)，以已公布全基因組序列具辣味辣椒cm334和zunla_1為對(duì)照，與辣味辣椒cm334和zunla_1同基因型的及雜合基因型的具有辣味，與辣味辣椒cm334和zunla_1不同基因型的不具有辣味。通過該分子標(biāo)記可進(jìn)行辣椒辣味材料的篩選和雜交種純度的鑒定，提高了育種效率。相比之前發(fā)現(xiàn)的其它分子標(biāo)記，本發(fā)明的snp標(biāo)記2_25位于辣椒ca02g19240基因區(qū)間，屬于候選基因分子標(biāo)記。附圖說明圖1為kaspar標(biāo)記2_25在雜交組合中的擴(kuò)增結(jié)果。藍(lán)色點(diǎn)為與有辣味親本相同基因型的單株(a:a基因型)，綠色點(diǎn)為無辣味材料0601m和77013a(c:c基因型)，紅色點(diǎn)為雜合型單株(a:c基因型)。圖2為kaspar標(biāo)記2_25在18個(gè)辣椒材料中的擴(kuò)增結(jié)果。藍(lán)色點(diǎn)為有辣味純合單株(a:a基因型)，綠色點(diǎn)為無辣味單株(c:c基因型)。圖3為kaspar標(biāo)記2_25在有辣味辣椒和無辣味辣椒雜交后代中的擴(kuò)增結(jié)果。藍(lán)色點(diǎn)為無辣味親本和假雜交f1單株(a:a基因型)，紅色點(diǎn)為f1雜交單株(a:c基因型)。具體實(shí)施方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實(shí)施例中所涉及到的辣椒有如下：cm334、perennial、小馬賽、h3、77013a、0601m、83-60、0819、kls、83-163、0516、carolinawonder、dh330、0818、7714、益都紅、雞澤椒、豬大腸、茄門、望都椒、04q-29和04q-15。記載有各材料的文獻(xiàn)如下所示。實(shí)施例1、與辣椒辣味性狀相關(guān)的snp位點(diǎn)的獲得及對(duì)應(yīng)kaspar引物的確定一、試驗(yàn)材料本實(shí)施例以有辣味辣椒cm334、perennial、小馬賽、h3和無辣味辣椒77013a、0601m、83-60，及其f1為試驗(yàn)材料。二、表型鑒定各辣椒材料及其f1代表型鑒定采用對(duì)辣椒成熟果實(shí)進(jìn)行口嘗的方法鑒定。每個(gè)材料取3株，每株采果3個(gè)，分別交由不同的人員嘗試。有2個(gè)以上果實(shí)為辣的單株為辣味單株，3個(gè)辣味單株的材料為辣味材料。三、77013a基因組重測(cè)序采用pe150，hiseq4000對(duì)77013a基因組進(jìn)行重測(cè)序，平均測(cè)序深度42x，以cm334(pepper.v.1.55,http://peppergenome.snu.ac.kr/.)為參考基因組，利用samtools軟件預(yù)測(cè)樣本中的snp位點(diǎn)。利用primer3(http://bioinfo.ut.ee/primer3)在線設(shè)計(jì)kaspar引物。四、多態(tài)性snp標(biāo)記的篩選1、kaspar標(biāo)記本發(fā)明所采用的每對(duì)kaspar分子標(biāo)記含有3條引物序列：a1、a2、c。其中，a1、a2僅僅是末端的snp位點(diǎn)存在差異，在a1、a2的5’端分別加有不同熒光標(biāo)簽序列：5’-gaaggtgaccaagttcatgct-3’(fam熒光標(biāo)簽序列)；5’-gaaggtcggagtcaacggatt-3’(hex熒光標(biāo)簽序列)。此兩段序列與kaspv4.02xmastermix96/384,lowrox里帶有熒光的序列互補(bǔ)，配對(duì)后會(huì)激發(fā)熒光。c為反向互補(bǔ)序列。(1)kaspar標(biāo)記的pcr擴(kuò)增體系(4.055μl)：dna模板(5ng·μl-1)2μlkaspv4.02xmastermix96/384,lowrox2μl引物混合液0.055μl其中，kaspv4.02×mastermix96/384,lowrox為英國lgc公司產(chǎn)品，其產(chǎn)品目錄號(hào)為kbs-1016-017。kaspv4.02×mastermix96/384,lowrox由熒光探針a、熒光探針b、淬滅探針a和淬滅探針b，以及高保真的taq酶，dntp等組成。熒光探針a的序列為5′-gaaggtgaccaagttcatgct-3′，5′末端連接1個(gè)熒光基團(tuán)fam；熒光探針b的序列為5′-gaaggtcggagtcaacggatt-3′，5′末端連接1個(gè)熒光基團(tuán)hex；淬滅探針a的序列為5′-agcatgaacttggtcaccttc-3′，3′末端連接淬滅基團(tuán)q；淬滅探針b的序列為5′-aatccgttgactccgaccttc-3′，3′末端連接淬滅基團(tuán)q(2)引物混合液體系(50μl)：引物濃度均為100μmol·l-1c15μla16μla26μl滅菌h2o23μl(3)384孔pcr板擴(kuò)增，程序如下：(4)pcr產(chǎn)物的檢測(cè)kasparpcr擴(kuò)增反應(yīng)后讀數(shù)需使用roche480熒光定量儀，進(jìn)行kaspargenotying，讀取熒光數(shù)據(jù)，若基因分型效果不理想，則需要添加程序：94℃20s，57℃60s，3個(gè)循環(huán)；37℃1min，再進(jìn)行數(shù)據(jù)讀取。lgc公司提供了在roche480熒光定量儀上分析的說明書，可從www.lgcgenomics.com獲的。x軸為fam(465-510)通道，y軸為hex(533-580)通道。根據(jù)分析結(jié)果按照如下確定待測(cè)基因的具體基因型：聚合在接近x軸的顯示藍(lán)色的樣本的基因型為連接fam熒光標(biāo)簽序列的等位基因型，聚合在接近y軸上的顯示綠色的樣本的基因型為連接hex熒光標(biāo)簽序列的等位基因型，中間顯示紅色的樣本的基因型為兩種等位基因的雜合型，左下角顯示黑色的樣本為以h2o替代模板的空白對(duì)照。2、辣椒pun候選基因snp標(biāo)記的獲得及對(duì)應(yīng)kaspar引物的確定設(shè)計(jì)位于辣椒pun候選基因區(qū)間的kaspar引物，利用5個(gè)不同的雜交組合進(jìn)行多態(tài)性篩選，結(jié)果在辣椒ca02g19240基因區(qū)間發(fā)現(xiàn)表型與pun基因型一致的kaspar引物組合2_25(引物序列信息見表1，表型及基因型鑒定結(jié)果如表2和圖1)，可用于辣椒辣味材料的snp分子標(biāo)記輔助選擇。其對(duì)應(yīng)的snp位點(diǎn)具體為辣椒基因組中對(duì)應(yīng)于序列表中序列4所示核苷酸序列的第24位；所述snp位點(diǎn)處的核苷酸為a或c。當(dāng)所述辣椒的表型為“有辣味”，且對(duì)應(yīng)的pun基因型為pun/pun時(shí)，該snp位點(diǎn)均為a:a基因型(即辣椒基因組中對(duì)應(yīng)于序列表中序列4所示核苷酸序列的第24位為a的純合型)；當(dāng)所述辣椒的表型為“有辣味”，且對(duì)應(yīng)的pun基因型為pun/pun時(shí)，該snp位點(diǎn)均為a:c基因型(即辣椒基因組中對(duì)應(yīng)于序列表中序列4所示核苷酸序列的第24位為a和c的雜合型)；當(dāng)所述辣椒的表型為“無辣味”，且對(duì)應(yīng)的pun基因型為pun/pun時(shí)，該snp位點(diǎn)均為c:c基因型(即辣椒基因組中對(duì)應(yīng)于序列表中序列4所示核苷酸序列的第24位為c的純合型)。表1kaspar引物2_25核苷酸序列信息表2分子標(biāo)記2_25在辣椒雙親及f1代分型情況實(shí)施例2、利用本發(fā)明標(biāo)記2_25從自然群體中篩選辣味材料一、試驗(yàn)材料18份辣椒材料(表3)。二、kaspar標(biāo)記參見實(shí)施例1步驟四。三、試驗(yàn)結(jié)果結(jié)果參見表3和圖2，可見：當(dāng)供試?yán)苯返谋硇蜑椤坝欣蔽丁?對(duì)應(yīng)的pun基因型為pun/pun)時(shí)，分子標(biāo)記2_25對(duì)應(yīng)的snp位點(diǎn)均為a:a基因型；當(dāng)供試?yán)苯返谋硇蜑椤盁o辣味”(對(duì)應(yīng)的pun基因型為pun/pun)時(shí)，分子標(biāo)記2_25對(duì)應(yīng)的snp位點(diǎn)均為c:c基因型。因此，可利用本發(fā)明標(biāo)記2_25從自然群體中篩選辣味材料。表3分子標(biāo)記2_25在辣椒自然群體中的分型情況實(shí)施例3、利用本發(fā)明標(biāo)記2_25進(jìn)行有辣味辣椒和無辣味辣椒(甜椒)雜交后代純度鑒定一、試驗(yàn)材料1)有辣味母本對(duì)照5株(04q-29)；2)辣椒(04q-29)×甜椒(04q-15)雜交種抽樣群體88株，分別提取基因組dna。二、表型鑒定田間種植辣椒×甜椒雜交后代株及其母本，常規(guī)管理措施進(jìn)行管理，在成株期依據(jù)品種的特征特性逐一進(jìn)行表型鑒定，標(biāo)出與母本相似的假f1后代，計(jì)算純度。三、kaspar標(biāo)記參見實(shí)施例1步驟四。四、試驗(yàn)結(jié)果苗期表型鑒定在88個(gè)單株樣本中發(fā)現(xiàn)8株為假f1代，純度為91％。標(biāo)記2_25分析表明，88個(gè)單株樣本中8株為母本基因型(圖3)。結(jié)果表明，本發(fā)明標(biāo)記能夠快速地對(duì)辣椒×甜椒雜交后代中的母本自交后代進(jìn)行分子標(biāo)記輔助鑒別，可用于生產(chǎn)或科研實(shí)踐中辣椒×甜椒雜交種的純度鑒定。<110>中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所<120>與辣椒辣味相關(guān)的snp標(biāo)記及其應(yīng)用<130>gncln171368<160>4<170>patentinversion3.5<210>1<211>45<212>dna<213>人工序列<220><223><400>1gaaggtgaccaagttcatgcttcaatcaaacatccagttactcca45<210>2<211>45<212>dna<213>人工序列<220><223><400>2gaaggtcggagtcaacggatttcaatcaaacatccagttactccc45<210>3<211>25<212>dna<213>人工序列<220><223><400>3aagcaacaaatgtctgaatttgaac25<210>4<211>95<212>dna<213>辣椒（capsicumannuuml.）<220><221>misc_feature<222>(24)..(24)<223>m為a或c<400>4tcaatcaaacatccagttactccmaaacttggaattaattaggcaataaattcaaagagt60tcctcattgcgttcaaattcagacatttgttgctt95當(dāng)前第1頁12