本發(fā)明涉及疾病診斷領(lǐng)域，具體涉及一種檢測心肌梗死的試劑及其應(yīng)用，更具體的涉及一種檢測mir-520c的試劑及其在制備診斷心肌梗死試劑中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

急性心肌梗死(ami)是指急性心肌缺血性壞死，大多是在冠脈病變的基礎(chǔ)上發(fā)生冠脈血供應(yīng)急劇減少或中斷，使得相應(yīng)的心肌嚴重而持久的急性缺血所致。急性心肌梗死是最嚴重的一種心血管疾病，近十年來我國心肌梗死發(fā)病率呈明顯上升趨勢，早期、準確的診斷可以保證再灌注治療的立即開始可能減少死亡率。然而，目前診斷都是基于臨床癥狀、心電圖異常和生化指標，但大約1/3的ami病人早期臨床癥狀不典型，約1/2的病人心電圖不能出現(xiàn)特征性st段改變，常用的生化指標中如肌酸激酶、乳酸脫氫酶、肌紅蛋白等由于他們的特異性或敏感性等原因，在臨床應(yīng)用中受到一些限制。從目前的趨勢看，隨著醫(yī)學科研的發(fā)展，心肌梗死的血液生化指標已經(jīng)從以酶活為主的檢查發(fā)展到以基因或蛋白濃度的檢測。另外，分子標志物的聯(lián)合使用可使各種標志物互為補充，彌補單一標志物的某些不足，臨床的精準診斷和治療需要更多候選分子標志物。

本發(fā)明基于高通量測序方法，獲得心肌梗死m(xù)irna的表達數(shù)據(jù)，同時，結(jié)合geo數(shù)據(jù)庫中心肌梗死相關(guān)mirna數(shù)據(jù)，進行生物信息學分析驗證，從候選的mirna中挑選出mir-520c和mir-1274b進行分子生物學驗證，結(jié)果顯示，mir-520c和mir-1274b與心肌梗死密切相關(guān)?？蓡为毣蚝喜⒂糜谛募」Ｋ赖呐R床診斷及預(yù)防檢測，為臨床上相關(guān)診斷試劑研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

一種檢測心肌梗死的試劑，所述試劑檢測mir-520c的表達水平。

所述mir-520c的序列見序列表seqidno1。

進一步，試劑還檢測mir-1274b的表達水平。

所述mir-1274b的序列見序列表seqidno2。

進一步，檢測心肌梗死試劑包括基于高通量測序方法和/或基于定量pcr方法和/或基于探針雜交方法檢測樣本中mir-520c和/或mir-1274b。

優(yōu)選采用northern雜交方法、mirna表達譜芯片、核酶保護分析技術(shù)、rake法、原位雜交、基于微球的流式細胞術(shù)檢測樣本中mir-520c和/或mir-1274b的轉(zhuǎn)錄。

所述樣本為外周血。

優(yōu)選的，基于定量pcr方法包括特異性擴增mir-520c和/或mir-1274b的引物，進一步優(yōu)選，特異性擴增mir-520c的引物序列為seqidno3，特異性擴增mir-1274b的引物序列為seqidno4；基于探針雜交方法包括與mir-520c和/或mir-1274b的核酸序列雜交的探針。

進一步，所述mirna為mir-520c的前體，前體序列為seqidno5。

進一步，樣本中mir-520c和/或mir-1274b高表達顯示患心肌梗死風險增加。

優(yōu)選的，試劑檢測mir-520c和/或mir-1274b的表達水平。

檢測mirna的制劑在制備診斷心肌梗死試劑中的應(yīng)用，所述mirna選自下列中的一種或幾種：mir-520c、mir-1274b。

本發(fā)明的目的在于提供下調(diào)mir-520c和/或mir-1274b的轉(zhuǎn)錄和/或抑制mir-520c和/或mir-1274b的活性的試劑在制備防治心肌梗死制劑中的應(yīng)用。

優(yōu)選的，采用反義寡核苷酸、antagomirs、mirna海綿、mirnaerasers、targetmasking和/或多靶點反義寡核苷酸的方法下調(diào)mir-520c和/或mir-1274b的轉(zhuǎn)錄和/或阻斷mir-520c和/或mir-1274b的活性。

本發(fā)明的目的在于提供檢測mir-520c和/或mir-1274b的靶基因制劑在制備診斷心肌梗死制劑中的應(yīng)用。

定義：

現(xiàn)階段檢測mirna的表達水平的方法主要包括基于高通量測序技術(shù)、基于核苷酸雜交和基于pcr的mirna檢測方法?；谔结橂s交技術(shù)的mirna檢測方法是一種直接檢測法，不需要對樣本rna進行預(yù)擴增，包括northern雜交方法、mirna表達譜芯片、核酶保護分析技術(shù)、rake法、原位雜交、基于微球的流式細胞術(shù)等技術(shù)。

(1)northern雜交

又稱rna印跡技術(shù)為最經(jīng)典的檢測真核生物rna大小，估計其豐度的實驗方法?；驹砣缦拢菏紫仍谳d體(如硅片、微球或膜等)上固定mirna樣本，再與經(jīng)過標記的探針雜交，洗滌多余的雜交探針后進行信號檢測；也可以在載體上先固定與靶mirna序列互補的dna探針，然后與經(jīng)過標記的樣本mirna雜交，再進行信號檢測。信號標記的方法包括同位素標記、熒光標記和納米金標記等。

(2)mirna表達譜芯片

原理同樣是使用標記探針檢測固相支持物上的目標分子。通過設(shè)計芯片上mirna基因及內(nèi)參序列，可精確分析出樣品中相應(yīng)mirna的表達水平?；蛐酒哂懈咄康膬?yōu)點，可以一次在同一樣本中檢測出幾百個基因的全部表達。luminex公司研制的液相芯片(liquidchip)又稱多功能懸浮點陣(multianalytesuspensionarray，masa)，是出的新一代生物芯片技術(shù)。液相芯片體系由許多小球體為主要基質(zhì)構(gòu)成，每種小球體上固定有不同的探針分子，為了區(qū)分不同的探針，每一種用于標記探針的球形基質(zhì)都帶有一個獨特的色彩編號，將這些小球體懸浮于一個液相體系中，就構(gòu)成了液相芯片系統(tǒng)。該系統(tǒng)可以對同一個微量樣本中的多個不同分子同時進行快速的定性、定量分析，這種檢測技術(shù)被稱為fmap(flexiblemultianalyteprofiling)技術(shù)。分子雜交在懸浮溶液中進行，檢測速度極快。

(3)核酶保護分析技術(shù)(rpa)

mirna的檢測還可以采用核酶保護分析技術(shù)，將標記好的探針和待測rna樣本混合，熱變性后雜交，未雜交的rna和多余的探針用單鏈核酸酶消化，熱失活核酸酶后純化受保護的rna分子，最后通過變性page電泳分離探針，顯色。這種基于液相雜交的新方法簡單快速，靈敏度高，但也只能用于分析已知mirna。

(4)rake法

rake法(rnaprimedarraybasedklenowemzyme)是在mirnamicroarray的基礎(chǔ)上利用dna聚合酶i的klenow片段，使mirna與固定的dna探針雜交的方法。rake可以敏感特異地檢測mirna，適用于大量快速的篩選所有己知的mirna。能夠在特定的細胞和腫瘤中檢測mirna表達譜情況。不僅如此，rake法還可以從由福爾馬林固定了的石蠟包埋的組織中分離出mirna并對其進行分析，為從存檔標本中分析mirna開啟了希望之門。

(5)原位雜交(insituhybridization)

原位雜交技術(shù)可直觀了解mirna表達方式，是觀測mirna時空表達的一種較簡便的方法，常標記方式包括地高辛、生物素、熒光標記等。鎖定核酸基礎(chǔ)上的原位雜交(lockednucleicacid(lna)basedinsituhybridization(lna-ish))是當前應(yīng)用較多的探針方式。

(6)基于微球的流式細胞術(shù)(bead-basedflowcytometry)

是一種液相芯片技術(shù)，該方法將流式細胞檢測與芯片技術(shù)有機地結(jié)合起來，兼有通量大、檢測速度快、靈敏度高和特異性好等特點。

(7)實時熒光定量pcr技術(shù)(real-timepcr，rt-pcr)

熒光檢測pcr儀可對整個pcr過程中擴增序列的累積速率繪制動態(tài)變化曲線。在反應(yīng)混合體系中靶序列的起始濃度越大，要求獲得擴增產(chǎn)物某特定產(chǎn)量的pcr循環(huán)數(shù)(一般用特定閾值循環(huán)數(shù)ct來表達)越少。由于mirna長度僅為22nt，傳統(tǒng)的qrt-pcr不適合擴增如此短的片段?，F(xiàn)今有幾種用于mirna的實時定量pcr方法，如加尾法、頸環(huán)法等。頸環(huán)法是一種理想的mirna檢測qrt-pcr方法：首先設(shè)計特殊的莖環(huán)結(jié)構(gòu)引物，以待測mirna為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cdna第一鏈，該cdna一端為莖環(huán)狀引物，莖環(huán)狀結(jié)構(gòu)被打開便增加了cdna的長度，隨后以合成的cdna為模板設(shè)計引物進行實時定量pcr擴增。qrt-pcr具有特異性高、靈敏度好、快速簡單等多種優(yōu)點。

(8)測序法

大部分已知的mirna都是通過cdna克隆測序發(fā)現(xiàn)和鑒定的。該法需要先構(gòu)建mirna的cdna文庫，再進行pcr擴增，擴增產(chǎn)物隨后克隆到表達載體上測序。takada開發(fā)了一種改進的擴增克隆法(mirnaamplificationprofiling，mrap)，mrap法先在mirna的3’端連上接頭，然后用與接頭互補的反轉(zhuǎn)錄引物反轉(zhuǎn)錄。因為特定的反轉(zhuǎn)錄酶具有末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶活性，一些核苷酸(主要是脫氧胞苷酸)會連接到反轉(zhuǎn)錄出的cdna鏈的3’末端。當5’端接頭與cdna鏈的poly(c)粘性末端退火后，加入一對共用引物即可實現(xiàn)對cdna的pcr擴增。由于mrap高度靈敏，可以直接用克隆和測序技術(shù)檢測少量組織中mirna的表達量。標簽序列克隆法是一種在在基因表達系列分析(sage)技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展了檢測效率更高的mirage(mirnasage)克隆法，該法通過生成大的串聯(lián)子，通過單個測序反應(yīng)可檢測多個mirna，明顯提高了檢測效率。

高通量測序(high-throughputsequencing)又稱下一代測序技術(shù)(nextgenerationsequencing)是對傳統(tǒng)測序一次革命性的改變，一次對幾十萬到幾百萬條dna分子進行序列測定，極大提高了測序效率。這類大規(guī)模測序技術(shù)極大的提高了多個物種遺傳信息的解讀速度，為獲取所有mirna的序列信息，解密mirna圖譜提供了保證。同時高通量測序使得對一個物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進行細致全貌的分析成為可能，所以又被稱為深度測序(deepsequencing)。高通量測序平臺的代表是羅氏公司(roche)的454測序儀(rochgsflxsequencer)，illumina公司的solexa基因組分析儀(illuminagenomeanalyzer)和abi的solid測序儀(abisolidsequencer)。

基于rna的microrna功能獲得性技術(shù)即通過外源性補充mirnas合成的前體物質(zhì)來升高mirnas的水平。例如，可以人工合成與內(nèi)源性mirna序列一致的短發(fā)夾樣rna(shorthairpinrna，shrna)，由聚合酶ii或iii做啟動子，以病毒為載體轉(zhuǎn)染細胞，被dicer酶修飾后載入risc發(fā)揮作用，相當于升高pre-mirna的水平，作用效果穩(wěn)定而持久。

基因特異性mirmimics技術(shù)該技術(shù)避免了mirna與基因的非特異性作用。這種人工合成的與靶基因3’utr互補結(jié)合的特異性寡核苷酸鏈，能夠起到與mirna相同的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)作用。

mirna調(diào)控的主要方式有兩種：一種是與靶基因mrna的3’utr不完全互補配對，阻斷靶基因的翻譯，從而調(diào)節(jié)基因表達；另一種是與sirna類似，當mirna與mrna完全互補配對時，ago2蛋白通過切割mrna直接導致其降解，實現(xiàn)基因沉默?？傊斍罢J為mirna以何種方式與目的基因作用和mirna與目的基因的配對程度有關(guān)。mirna與目的基因配對不完全時，mirna就以抑制目的基因的表達發(fā)揮作用；mirna與目的基因某段序列配對完全時，就可能引起目的基因在互補區(qū)斷裂而導致基因沉默。

附圖說明

圖1是mir-520c診斷心肌梗死的roc曲線圖

圖2是mir-1274b診斷心肌梗死的roc曲線圖

圖3是mirna聯(lián)合診斷心肌梗死的roc曲線圖

圖4是mir-1274b和mir-520c相對表達量圖

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解：在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下可以對這些實施例進行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由權(quán)利要求及其等同物限定。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件或按照廠商所建議的條件實施檢測。

實施例1樣品的收集及總rna提取

收集醫(yī)院2015年3月到2016年9月心肌梗死患者外周血及健康對照外周血各6例。急性心肌梗死診斷標準：根據(jù)2012年第三次《心肌梗死全球統(tǒng)一定義》推薦的診斷標準制定。檢測到心肌壞死標志物(主要是肌鈣蛋白)水平上升和/或下降，至少有1次超過參考值上限的第99％百分位值，并至少伴有下列一項缺血的癥狀。

1)心肌缺血的癥狀；

2)新發(fā)生的缺血性ecg改變；

3)心電圖出現(xiàn)病理性q波；

4)影像學證據(jù)顯示有新的心肌活性喪失或新發(fā)的局部室壁運動異常；

5)冠狀動脈造影或尸檢發(fā)現(xiàn)冠狀動脈內(nèi)存在新鮮血栓。

血液rna提取標準：rna純度：od260/280≧1.8，28s/18s≧1；rna完整性：rin值≧7.0。rna完整性檢測方法：agilent2100(rna6000nanokit)、瓊脂糖凝膠電泳(瓊脂糖凝膠濃度：1％瓊脂糖膠；電壓：5v/cm；時間：20min)。

實施例2測序、數(shù)據(jù)分析及電子驗證

測序：運用lluminahiseq2500/miseq第二代高通量測序技術(shù)對mirna進行測序，通過去接頭、去低質(zhì)量、去污染等過程完成數(shù)據(jù)的處理，得到最終數(shù)據(jù)。通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析軟件對mirna測序原始數(shù)據(jù)進行背景校正后進行t-test得到p值，然后利用fisher檢驗合并p值，篩選差異表達mirna。

最終從候選的差異表達mirna中挑選到mir-1274b、mir-520c、mir-1262，進行后期實驗驗證。

實施例3電子驗證

電子驗證：從geo(geneexpressionomnibus)數(shù)據(jù)庫篩選得到3套mrna數(shù)據(jù)集(gse48060、gse34198和gse61145-gpl6884)和2套mirna數(shù)據(jù)集(gse61741、gse31568)，3套mrna數(shù)據(jù)集(gse48060、gse34198和gse61145-gpl6884)共有基因13680個，我們通過使用metama包采用合并p值法計算并合并效應(yīng)值后得到612個(fdr<0.05)差異表達基因，其中上調(diào)352個，下調(diào)260個；2套數(shù)據(jù)集(gse24371,gse17498)共同mirna數(shù)目848個。使用r包metama對兩套mirna數(shù)據(jù)集進行合并p值分析，找到15個差異表達mirna(fdr<0.001&&|combined.es|>1)。結(jié)果顯示電子驗證結(jié)果與測序結(jié)果表達趨勢一致。

對于單個mirna分子或是診斷模型的效能評價的方法為建立受試者工作特征(receiveroperatingcharacteristic，roc)曲線，通過計算曲線下面積(areaundercurve)來判斷診斷的能力。roc曲線下的面積值在1.0和0.5之間，在auc>0.5的情況下，auc越接近于1，說明診斷效果越好，auc在0.5-0.7時有較低準確性，auc在0.7-0.9時有一定準確性，auc在0.9以上時具有較高準確性。我們將利用gse31568數(shù)據(jù)集(包括70例對照組和20例病例組)，進而進行分析，結(jié)果顯示，mir-520c診斷心肌梗死的auc為0.729(見圖1)，mir-1274b診斷心肌梗死的auc為0.779(見圖2)，mir-1262診斷心肌梗死的auc為0.746，顯示其準確率較高，表明三者可以作為診斷心肌梗死的分子標志物，進一步聯(lián)合診斷分析(見圖3)，mir-1274b和mir-1262聯(lián)合診斷心肌梗死的auc為0.790，mir-1274b和mir-520c聯(lián)合診斷心肌梗死的auc為0.797，mir-520c和mir-1262聯(lián)合診斷心肌梗死的auc為0.776。聯(lián)合診斷的結(jié)果表明雖然三者auc值均比較高，但是不同mirna直接的聯(lián)合有的效果不同，其中mir-520c和mir-1274b的聯(lián)合診斷效果接近0.8，顯示出很高的準確率。

實施例4樣品的采集及總rna的提取

1樣品采集：

36例心肌梗死患者和22例健康對照人群外周血(采集時間2014年1月-2015年8月)。

2總rna提取：

相關(guān)實驗物品的去rnase的處理：

①將所有玻璃器皿應(yīng)用前均用depc沖洗侵泡，120℃高壓20min，180℃高溫烤干2小時以上。

②將塑料器皿(如：ep管/槍頭)使用前需用0.1％depc水侵泡過夜，后控干液體，120℃高壓20min，烤箱烤干備用。

白細胞分離

(1)取2m1抗凝外周血(采血時間不超過3h)；

(2)加入等體積無菌pbs于外周血中充分混合，形成細胞懸液；

(3)加入4m1淋巴細胞分離液于另一離心管；

(4)吸取4m1細胞懸液沿管壁輕輕加入到淋巴細胞分離液表面(注意勿與淋巴細胞分離液混合)。離心1500rpm20min；

(5)用吸管輕輕吸出界面層(白膜)入另一離心管中。無菌冷pbs洗2次，最后1次洗滌可以將細胞懸液移入ep管中，離心去上清，用于提取rna。

rna提取

(1)從-80℃冰箱里取出樣本，切碎，按1ml/50-100mg的比例加入trizol于ep管中，進行勻漿處理，室溫靜置5-l0min；

(2)每毫升trizol加入0.2m1氯仿，劇烈震蕩15s，室溫靜置2-3min，在4℃下12000轉(zhuǎn)離心15min；

(3)小心吸出上清水相約600ul移入另一離心管(注意不要抽到蛋白層)，加入等量異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10min；

(4)4℃12000g離心l0min，棄上清液，底部可見白色物質(zhì)；

(5)加入lml75％冷乙醇旋轉(zhuǎn)洗滌，清洗異丙醇；

(6)4℃12000g離心5min，去除乙醇后晾5-l0min，半透明即可，以20u1depc水溶解rna。取3u1rna樣本，于1.5％瓊脂糖凝膠中電泳；lu1rna樣品于紫外分光光度計檢測濃度，以a260/280在1.8-2.0視為rna樣本合格。

實施例5rt-pcr檢測mir-1274b和/或mir-520c的表達情況

1rt-pcr檢測mir-1274b和/或mir-520c的表達

逆轉(zhuǎn)錄

rt體系的配制：1μg總rna作為模板rna；5×miscripthispecbuffer4μl；10×nucleicsmix2μl；miscriptreversetranscriptasemix2μl；滅菌水補平至20μl。abi9700型pcr儀上37℃保溫60min使逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)完全后，95℃5min終止反應(yīng)。加入80μlnuclease-freeh2o稀釋至100μl儲存在-20℃冰箱備用。

熒光定量pcr

mirna的rt-pcr體系的配制：

mir-520c的microrna-specificprimer引物為seqidno3，mir-1274b的microrna-specificprimer引物為seqidno4。

反應(yīng)體系：mirnas的表達檢測每次設(shè)置3個平行管反應(yīng)，以snrnau6作為內(nèi)參。擴增程序：95℃10min；40個循環(huán)(95℃10s，60℃30s)。

3統(tǒng)計學分析

實時定量pcr樣本擴增產(chǎn)物溶解曲線都是單峰，說明擴增產(chǎn)物只有一條，為特異性擴增；擴增曲線拐點清楚，擴增曲線整體平行性好，表明各反應(yīng)管的擴增效率相近，極限平而無上揚現(xiàn)在，曲線指數(shù)期斜率較大，說明擴增效率較高；根據(jù)qrt-pcr的相對定量公式計算實驗組與對照組目的基因表達的倍數(shù)關(guān)系，比較mir-1274b和/或mir-520c在心肌梗死組和對照組中的表達水平。結(jié)果顯示：mir-1274b在患病組的表達量為對照組的約2.3倍，mir-520c在患病組的表達量為對照組的約2.4倍，以上結(jié)果驗證了高通量測序數(shù)據(jù)分析的結(jié)果。58例樣品中，mir-1274b、mir-520c單獨檢測準確率為84.5％和81％，二者聯(lián)合檢測準確率為86.2％。顯示mir-1274b、mir-520c可單獨或者合并用于心肌梗死疾病的檢測。

雖然已參考各種優(yōu)選實施方案描述了本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，可進行各種變化，并且可用等同物替代其組件而不背離本發(fā)明的基本范圍。此外，可進行許多改動來使特定情況或材料適合于本發(fā)明的教導而不背離其基本范圍。

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<110>北京泱深生物信息技術(shù)有限公司

<120>一種檢測心肌梗死的試劑及其應(yīng)用

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