本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種cyp2c9*3基因多態(tài)性快速檢測的引物、分子信標(biāo)、試劑盒及其檢測方法。

背景技術(shù)：

單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism，snp)：指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的dna序列多態(tài)性。snp與許多疾病相關(guān)，決定了人類疾病的易感性和藥物反應(yīng)的差異性。

分子信標(biāo)(molecularbeacon)：是一種在5’和3’末端自身形成一個5-8個堿基左右的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標(biāo)記寡核苷酸探針。兩端的核酸序列互補(bǔ)配對，標(biāo)記在一端的熒光基團(tuán)與標(biāo)記在另一端的淬滅基團(tuán)緊緊靠近。在這種結(jié)構(gòu)下，熒光基團(tuán)被激發(fā)后產(chǎn)生的光子被淬滅劑淬滅，所以不會產(chǎn)生熒光；在高溫變性或之后的退火雜交過程中，這種結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致熒光基團(tuán)遠(yuǎn)離淬滅基團(tuán)，熒光便能被激發(fā)并被監(jiān)測儀器探測到。

近年來藥物代謝種族及個體差異與藥物代謝酶基因的遺傳多態(tài)性的關(guān)系越來越受到研究者們的重視。細(xì)胞色素p450超家族(cytochromep450proteins,cyp)是一類主要存在于肝臟、腸道中的單加氧酶，可催化多種內(nèi)、外源物質(zhì)(包括大多數(shù)臨床藥物)的代謝。cyp有多個亞家族，其中cyp2c(cytochromep4502c)是其中一個亞家族，cyp2c9是其中一員，占肝微粒體p450蛋白總量的20％。據(jù)統(tǒng)計，目前約有16％的的臨床藥物由cyp2c9負(fù)責(zé)代謝，主要包括苯妥因、華法林、醋酸香豆素、甲苯磺丁脲等。cyp2c9基因具有遺傳多態(tài)性，cyp2c9*3是外顯子7的第1061位核苷酸a突變?yōu)閏，導(dǎo)致多肽鏈第359位氨基酸由異亮氨酸突變?yōu)榱涟彼帷＞哂泄δ芤饬x的基因突變導(dǎo)致cyp2c9酶活性降低，可使cyp2c9酶底物藥物療效下降或產(chǎn)生更多不良反應(yīng)，甚至?xí)＜吧虼藢yp2c9代謝酶的基因檢測就尤為重要。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，cyp2c9*3的雜合子可以降低對s-華法林的代謝。在英國人群中，cyp2c9的多態(tài)性等位基因在華法林低劑量需求人群中的發(fā)生率明顯增加；在意大利人群中，cyp2c9的多態(tài)性也與華法林劑量的降低有關(guān)；在中國人口中,除了野生型cyp2c9*1，已發(fā)現(xiàn)的最主要的基因型是cyp2c9*3，其基因頻率約為3.3％。

目前，用于臨床檢測cyp2c9*3基因型的試劑盒均需要進(jìn)行抽血及提純dna的步驟，從抽血提取dna到得出檢測結(jié)果的整個過程至少需要8小時?，F(xiàn)有模式的有創(chuàng)檢測不僅會降低受檢者的檢測舒適度，而且難以滿足臨床疾病的快速診斷，增加了患者疾病治療的風(fēng)險，且操作復(fù)雜，污染的幾率大。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種操作簡單、避免污染且檢測快速的cyp2c9*3基因多態(tài)性快速檢測所涉及的引物、分子信標(biāo)、試劑盒及其檢測方法。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：cyp2c9*3基因多態(tài)性快速檢測的試劑盒，包括pcr反應(yīng)液；pcr反應(yīng)液的原料及終濃度為：dna聚合酶0.05-0.12u/μl；dntps0.2mm；5x反應(yīng)緩沖液1x；mgcl21.5-3.5mm；十二烷基硫酸鈉0.0005-0.015％(w/v)；聚乙二醇辛基苯基醚0.001-0.03％(w/v)；正向引物0.5-1μm；反向引物0.5-1μm；突變型探針0.5-1μm；野生型探針0.5-1μm；且其用于檢測細(xì)胞樣品。

采用本發(fā)明技術(shù)方案的cyp2c9*3基因多態(tài)性快速檢測的試劑盒，以細(xì)胞為檢測樣本，以熒光探針法為基礎(chǔ)，結(jié)合細(xì)胞裂解液(由十二烷基硫酸鈉、聚乙二醇辛基苯基醚組成)對cyp2c9*3進(jìn)行檢測分析。利用細(xì)胞裂解液在反應(yīng)過程中直接裂解細(xì)胞并釋放出細(xì)胞核中dna。在現(xiàn)有的pcr反應(yīng)中，以細(xì)胞直接作為模板的pcr反應(yīng)，通常無法徹底裂解細(xì)胞，并且裂解后的細(xì)胞碎片及一些細(xì)胞內(nèi)容物(如蛋白酶)對pcr反應(yīng)有抑制，最終導(dǎo)致分型結(jié)果不穩(wěn)定，甚至失敗。而本發(fā)明中使用的裂解液采用與基因相關(guān)的原料終濃度，在增強(qiáng)細(xì)胞裂解程度的同時還降低了這些潛在的抑制劑對pcr的抑制作用(通過溶解細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，破壞分子間微弱的化學(xué)鍵，分解一些蛋白酶)。細(xì)胞裂解液的作用是溶解細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，繼而破壞分子間許多微弱的化學(xué)鍵，分解蛋白酶，從而降低細(xì)胞裂解之后產(chǎn)生的雜質(zhì)對pcr反應(yīng)的影響。細(xì)胞裂解液的原料由十二烷基硫酸鈉、聚乙二醇辛基苯基醚組成。聚乙二醇辛基苯基醚是一種非離子型表面活性劑，十二烷基硫酸鈉是一種能夠使蛋白質(zhì)變性的強(qiáng)陰離子去污劑。在細(xì)胞和分子生物學(xué)領(lǐng)域，十二烷基硫酸鈉，簡稱sds，被用于核酸抽提操作中破壞細(xì)胞壁及裂解核酸與蛋白復(fù)合物，在較高溫度下，破壞蛋白質(zhì)與dna的結(jié)合，使dna釋放出來。聚乙二醇辛基苯基醚簡稱tritonx-100，被用于分解蛋白酶，聚乙二醇辛基苯基醚在基因工程中還用作限制性內(nèi)切酶的緩沖液的成分之一。

由實(shí)驗(yàn)可知，pcr反應(yīng)液的原料、特異性引物及分子信標(biāo)的終濃度范圍為上述范圍時檢測結(jié)果均正確。其中，5x反應(yīng)緩沖液1x的原料為5x反應(yīng)緩沖液，指的是初始濃度為5倍的反應(yīng)緩沖液，1x是指的應(yīng)用的終濃度。

通過這一發(fā)明點(diǎn)不僅大大節(jié)省了檢測的時間，操作的時間可控制在1-1.5h，還避免了繁瑣操作可能帶來的dna污染。

進(jìn)一步，所述的pcr反應(yīng)液的原料終濃度為：dna聚合酶0.09u/μl；dntps0.2mm；5x反應(yīng)緩沖液1x；mgcl22.5mm；十二烷基硫酸鈉0.005％(w/v)；聚乙二醇辛基苯基醚0.01％(w/v)；正向引物0.7μm；反向引物0.7μm；突變型探針0.7μm；野生型探針0.6μm。

由實(shí)驗(yàn)可知，pcr反應(yīng)液的終濃度為上述范圍時檢測結(jié)果最準(zhǔn)確，且準(zhǔn)確率最高。

進(jìn)一步，所述的細(xì)胞樣品為口腔黏膜脫落細(xì)胞。本發(fā)明以直接刮取的口腔黏膜脫落細(xì)胞為樣本，操作方便。

進(jìn)一步，還包括有提純的人類dna基因序列。試劑盒中包括質(zhì)控品，為提純的人類dna基因序列，是在測定時為了做平行試驗(yàn)，來測定試劑結(jié)果的有效性。

本申請還提出另一個技術(shù)方案，本發(fā)明試劑盒中的cyp2c9*3基因多態(tài)性快速檢測的引物，

正向引物5’-3’的基因序列為：ctgcatgcaagacagga；

反向引物5’-3’的基因序列為：aacttaccttgggaatgaga。

本申請還提出另一個技術(shù)方案，試劑盒中引物檢測的cyp2c9*3基因多態(tài)性快速檢測的分子信標(biāo)，野生型探針的5’-3’的基因序列為：cgacgtgata+c+a+ttgaccttctcccacgtcg；

突變型探針的5’-3’的基因序列為：cgcacgcagagata+c+c+ttgaccttccgtgcg；

且野生型探針和突變型探針基因序列的5’端或3’端分別設(shè)有熒光基團(tuán)和與熒光基團(tuán)配合的熒光淬滅基團(tuán)。

+為鎖核酸修飾的堿基。

本技術(shù)方案使用了分子信標(biāo)探針，分子信標(biāo)為一種在5’和3’末端可自身形成由5-8個堿基組成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的雙標(biāo)記寡核苷酸探針。即為上述探針的基因序列和結(jié)構(gòu)。自由狀態(tài)時，發(fā)夾結(jié)構(gòu)的兩個末端使熒光分子與淬滅分子靠近(約為7-10nm)。此時發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移,使熒光分子發(fā)出的熒光被淬滅分子吸收并以熱的形式散發(fā)，熒光幾乎完全被淬滅。當(dāng)分子信標(biāo)與細(xì)胞的基因序列完全互補(bǔ)的靶標(biāo)序列結(jié)合形成雙鏈雜交體時，莖結(jié)構(gòu)互補(bǔ)區(qū)的堿基對被分開，熒光分子和淬滅分子之間距離增大，這時分子信標(biāo)的熒光幾乎100％恢復(fù)。這種設(shè)計能有效地增加探針的特異性，提高對cyp2c9*3檢測的正確性。

檢測的原理為：利用熒光探針法(分子信標(biāo)技術(shù))對cyp2c9*3等位基因進(jìn)行定性檢測。檢測時利用兩對特異性引物分別對兩條目的片段進(jìn)行擴(kuò)增。再通過兩對由不同熒光基團(tuán)標(biāo)記，且可與這些位點(diǎn)不同堿基互補(bǔ)的分子信標(biāo)探針與擴(kuò)增片段進(jìn)行特異性雜交。雜交過程致使熒光基團(tuán)遠(yuǎn)離淬滅基團(tuán)從而釋放熒光信號。隨著擴(kuò)增片段數(shù)量的積累，熒光信號也得到相應(yīng)的增加并被儀器采集。通過配套軟件對采集的熒光信號進(jìn)行分析，即可獲得所檢測樣本的基因型。

進(jìn)一步，所述的熒光基團(tuán)為fam標(biāo)記基團(tuán)，所述的淬滅基團(tuán)為bhq1標(biāo)記基團(tuán)；

或者熒光基團(tuán)為alexafluor594標(biāo)記基團(tuán)，所述的淬滅基團(tuán)為bhq2標(biāo)記基團(tuán)。以上為本發(fā)明中所使用的兩種熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，當(dāng)然，也可用其他熒光基團(tuán)和與其配合的淬滅基團(tuán)代替，不影響檢測結(jié)果。

本申請還提出另一個技術(shù)方案，利用上述的引物、分子信標(biāo)及試劑盒進(jìn)行的cyp2c9*3基因多態(tài)性快速檢測方法，操作方法為，

(1)取樣前用水漱口2次，每次大于5秒，漱口后吞咽2-3次；

(2)取取樣裝置的取樣部近90°接觸口腔內(nèi)腮壁，均勻刮拭5次，上、下為1次；

(3)取樣后將取樣裝置的取樣部插入pcr反應(yīng)液中，混勻；

(4)取1μl提純的人類基因組dna基因序列加入到另一支pcr反應(yīng)液中，混勻；

(5)將完成加樣的pcr反應(yīng)液放入定量pcr儀中，運(yùn)行反應(yīng)程序。

進(jìn)一步，其定量pcr儀的反應(yīng)程序?yàn)椋?/p>

a、預(yù)變性：溫度95℃，5min，1個循環(huán)；

b、變性：95℃，8s；

c、退火及延伸：55℃，35s；

d、b、c程序操作50個循環(huán)。

進(jìn)一步，所述的定量pcr儀為雙通道，激發(fā)波長分別為450-500nm和550-600nm。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實(shí)施例一的第一個樣品檢測擴(kuò)增曲線圖；

圖2是本發(fā)明實(shí)施例一的第二個樣品檢測擴(kuò)增曲線圖；

圖3是本發(fā)明實(shí)施例一的第三個樣品檢測擴(kuò)增曲線圖；

圖4是本發(fā)明實(shí)施例二的第一個樣品檢測擴(kuò)增曲線圖；

圖5是本發(fā)明實(shí)施例二的第二個樣品檢測擴(kuò)增曲線圖；

圖6是本發(fā)明實(shí)施例二的第三個樣品檢測擴(kuò)增曲線圖；

圖7是本發(fā)明實(shí)施例三的第一個樣品檢測擴(kuò)增曲線圖；

圖8是本發(fā)明實(shí)施例三的第二個樣品檢測擴(kuò)增曲線圖；

圖9是本發(fā)明實(shí)施例三的第三個樣品檢測擴(kuò)增曲線圖。

具體實(shí)施方式

以下是本發(fā)明cyp2c9*3基因多態(tài)性快速檢測試劑盒中的各實(shí)施例的原料終濃度，如表1所示：

表1

以下為本發(fā)明cyp2c9*3基因多態(tài)性快速檢測的具體操作方式：

一、細(xì)胞裂解液的配制

不同總濃度的細(xì)胞裂解液均配制成為200×的儲存液，首先是因?yàn)槊恳恢Х磻?yīng)液所需原料少，加之聚乙二醇辛基苯基醚為粘稠液體，不易精準(zhǔn)吸取。

所有試劑配制均在滅菌后的超凈工作臺進(jìn)行。

(1)實(shí)施例一中200x細(xì)胞裂解液的配制

使用1.5ml的離心管，加入10μlsds和1.88μltritonx-100，再加入988.12μl無核酸酶的水至總體積1000μl，使sds的終濃度達(dá)到0.1％，使tritonx-100的終濃度達(dá)到0.2％，即為200x的細(xì)胞裂解液，然后震蕩混勻，-4℃保存。

(2)實(shí)施例二中200x細(xì)胞裂解液的配制

使用1.5ml的離心管，加入100μlsds和18.78μltritonx-100，再加入881.22μl無核酸酶的水至總體積1000μl，使sds的終濃度達(dá)到1％，使tritonx-100的終濃度達(dá)到2％，即為200x的細(xì)胞裂解液，然后震蕩混勻，-4℃保存。

(3)實(shí)施例三中200x細(xì)胞裂解液的配制

使用1.5ml的離心管，加入300ulsds和56.34ultritonx-100，再加入643.66ul無核酸酶的水至總體積1000ul，使sds的終濃度達(dá)到3％，使tritonx-100的終濃度達(dá)到6％，即為200x的細(xì)胞裂解液，然后震蕩混勻，-4℃保存。

正向引物5’-3’的基因序列為：ctgcatgcaagacagga；

反向引物5’-3’的基因序列為：aacttaccttgggaatgaga。

野生型探針5’-3’的基因序列為：

(fam標(biāo)記)-cgacgtgata+c+a+ttgaccttctcccacgtcg-(bhq1標(biāo)記)；

突變型探針5’-3’的基因序列為：

(alexafluor594標(biāo)記)-cgcacgcagagata+c+c+ttgaccttccgtgcg-(bhq2標(biāo)記)；

+為鎖核酸修飾的堿基。

上述原料，除特異性引物、分子信標(biāo)、細(xì)胞裂解液外，均購自上海普洛麥格生物制品有限公司。特異性引物由上海占標(biāo)生物科技有限公司合成；分子信標(biāo)由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

二.pcr反應(yīng)液配制

各原料的加入量如表2所示。所有配制均在滅菌后的超凈工作臺進(jìn)行。

表2

三、cyp2c9*3基因型檢測；

cyp2c9*3基因型快速檢測試劑盒由9支分裝好的試劑管組成，每個被測者檢測3次重復(fù)(一次一支反應(yīng)液)，每測試9支試劑，同時測試一次質(zhì)控品，質(zhì)控品即為提純的人類基因組dna基因序列樣品，作為平行測試。

將配制好的pcr反應(yīng)液分裝于試劑管中，實(shí)施例一、二、三每支分裝23.5μl，-20℃避光保存；

(1)取樣前用清水漱口2次，每次不少于5秒，漱口后吞咽2-3次，盡量避免口腔內(nèi)壁殘留唾液；

(2)取出一次性使用無菌拭子(專利授權(quán)公告號：cn205359515u)及反應(yīng)液，拔掉反應(yīng)液塞子及拭子端蓋；

(3)使拭子端部近90°接觸口腔內(nèi)腮壁，實(shí)施例一、二、三均勻刮拭5次(上下為1次)，力度以腮部微突為宜；

(4)取樣后立即將拭子插入反應(yīng)液中，按壓頂部使其與試劑管密封，而后輕彈試劑管使樣本與反應(yīng)液充分混勻；

(5)用移液器取1μl質(zhì)控品加入到另一支反應(yīng)液中，輕彈試劑管并混勻；

(6)將完成加樣的反應(yīng)液放入om-1000型熒光pcr儀器(專利授權(quán)公告號：cn103820306b)中，并運(yùn)行表3中程序。

表3

(7)得到擴(kuò)增曲線和熒光顏色，分析結(jié)果。

四、結(jié)果分析：

標(biāo)記姓名、科室、針對藥物等，一個小時后觀察結(jié)果。結(jié)果有三種情況，分別是“aa”、“ac”或“cc”，其中陰性結(jié)果是“aa”，陽性結(jié)果是“ac”和“cc”。

實(shí)施例一的檢測結(jié)果為：

如圖1、圖2和圖3所示，圖中a線表示未檢測到cyp2c9*3，c線表示檢測到cyp2c9*3。

由圖1可知，只有a線有指數(shù)增長，而c線沒有指數(shù)增長，因此檢測結(jié)果是野生純合型aa，提示所檢測基因表達(dá)或活性可能正常，該基因型為正常代謝型；

由圖2可知，a線和c線都有指數(shù)增長，表示檢測結(jié)果是突變雜合型ac，提示所檢測基因活性可能下降，該基因型屬于中等代謝型；

由圖3可知，只有c線有指數(shù)增長，而a線沒有指數(shù)增長，表示檢測結(jié)果是突變純合型cc，提示所檢測基因活性明顯下降或可能喪失，其活性下降或喪失可能導(dǎo)致藥物活性成分血藥濃度降低；

由此，可從圖1、圖2和圖3中分析得出cyp2c9*3的基因型，從而可得出，患者對藥物的代謝類型。

實(shí)施例二的檢測結(jié)果為：

如圖4、圖5和圖6所示，圖中a線表示未檢測到cyp2c9*3，c線表示檢測到cyp2c9*3。

由圖4可知，只有a線有指數(shù)增長，而c線沒有指數(shù)增長，因此檢測結(jié)果是野生純合型aa；

由圖5可知，a線和c線都有指數(shù)增長，表示檢測結(jié)果是突變雜合型ac；

由圖6可知，只有c線有指數(shù)增長，而a線沒有指數(shù)增長，表示檢測結(jié)果是突變純合型cc；

由此，可從圖4、圖5和圖6中分析得出cyp2c9*3的基因型。

實(shí)施例三的檢測結(jié)果為：

如圖7、圖8和圖9所示：

由圖7可知，只有a線有指數(shù)增長，而c線沒有指數(shù)增長，因此檢測結(jié)果是野生型aa；

由圖8可知，a線和c線都有指數(shù)增長，表示檢測結(jié)果是雜合變異型ac；

由圖9可知，只有c線有指數(shù)增長，而a線沒有指數(shù)增長，表示檢測結(jié)果是純合變異型cc；

由此，可從圖7、圖8和圖9中分析得出cyp2c9*3的基因型。

實(shí)施例一～實(shí)施例三的測試均能正確進(jìn)行得出cyp2c9*3位點(diǎn)的基因型分型，從而可知被測試對象的藥物代謝類型。但實(shí)施例一中，引物的使用量較實(shí)施例二、三少，導(dǎo)致其分型曲線較后兩者進(jìn)入平臺期的循環(huán)晚。雖實(shí)施例二、三差異不大，但從突變雜合型觀察到實(shí)施例三配方顯示兩曲線各循環(huán)間熒光強(qiáng)度波動較大，因此選擇實(shí)施例二中配方比例作為最優(yōu)配方。

本發(fā)明的核苷酸序列表如下：

<110>重慶京因生物科技有限責(zé)任公司

<120>cyp2c93基因多態(tài)性快速檢測的引物、分子信標(biāo)、試劑盒及其檢測方法

<160>4

<210>1

<211>17

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>prim_bind

<400>1

ctgcatgcaagacagga

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>prim_bind

<400>2

aacttaccttgggaatgaga

<210>3

<211>34

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<221>misc_binding

<400>3

cgacgtgata+c+a+ttgaccttctcccacgtcg

<210>4

<211>34

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>misc_binding

<400>4

cgcacgcagagata+c+c+ttgaccttccgtgcg。

對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的前提下，還可以作出若干變形和改進(jìn)，這些也應(yīng)該視為本發(fā)明的保護(hù)范圍，這些都不會影響本發(fā)明實(shí)施的效果和專利的實(shí)用性。

<110>重慶京因生物科技有限責(zé)任公司

<120>cyp2c93基因多態(tài)性快速檢測的引物、分子信標(biāo)、試劑盒及其檢測方法

<160>4

<210>1

<211>17

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>prim_bind

<400>1

ctgcatgcaagacagga

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>prim_bind

<400>2

aacttaccttgggaatgaga

<210>3

<211>34

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<221>misc_binding

<400>3

cgacgtgata+c+a+ttgaccttctcccacgtcg

<210>4

<211>34

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>misc_binding

<400>4

cgcacgcagagata+c+c+ttgaccttccgtgcg。