本發(fā)明屬于木質(zhì)纖維素酶水解技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種利用多段酶水解工藝提高木質(zhì)纖維素酶水解糖化轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)品糖濃度的方法。

背景技術(shù)：

隨著石油資源短缺及人們對能源、環(huán)境問題重視程度的提高，木質(zhì)纖維素類生物質(zhì)的利用受到世界各國越來越廣泛的重視，成為新的發(fā)展領(lǐng)域和科學(xué)研究熱點。木質(zhì)纖維素是豐富而廉價的可再生資源，每年全球綠色植物體光合作用產(chǎn)生的干物質(zhì)達(dá)1.55×10¹¹噸，主要包括纖維素、半纖維素和木質(zhì)素。

木質(zhì)纖維素高效水解為可發(fā)酵糖是其在生物燃料及高附加值化學(xué)品轉(zhuǎn)化過程中至關(guān)重要的環(huán)節(jié)，如生物乙醇、生物丁醇、生物制氫等都是建立在木質(zhì)纖維素高濃度水解糖平臺基礎(chǔ)上的。酶水解是木質(zhì)纖維素被徹底降解為單糖而無環(huán)境污染的有效途徑，并且酶水解反應(yīng)糖損耗低、無副產(chǎn)物、條件溫和，因此受到廣泛關(guān)注。但木質(zhì)纖維素的組成與結(jié)構(gòu)極為復(fù)雜，加之纖維素酶存在穩(wěn)定性差、壽命短、活性低等缺陷，致使酶水解效率較低，酶水解糖化成本過高，為此國內(nèi)外科技工作者對如何提高木質(zhì)纖維素酶水解效率和產(chǎn)物濃度開展了諸多方面的研究。

高濃度的糖水解液有利于降低后期發(fā)酵或者化學(xué)轉(zhuǎn)化的能耗和經(jīng)濟(jì)成本。由于木質(zhì)纖維素原料質(zhì)地疏松、能量密度小、產(chǎn)物抑制等原因，致使一次性加料固形物濃度較低、底物轉(zhuǎn)化率低、酶消耗量大、水解糖濃度較低等問題。為了克服現(xiàn)有酶水解工藝的這些缺陷，研究人員做了大量工作。appliedbiochemistryandmicrobiology,2000,36(2),101-108中，pristavka等人研究了在非連續(xù)攪拌反應(yīng)器中，21％的秸稈固形物，纖維素添加量42fpu/g秸稈，還原總糖濃度達(dá)到160g/l；chemistryandindustryofforestproducts,2007,27(4),7-10中，趙晶等人采用分批補(bǔ)料酶水解工藝，使底物最終質(zhì)量濃度達(dá)到200g/l，纖維素酶20fpu/g(底物)和纖維二糖酶6.5cbu/g(底物)酶水解60h后還原糖濃度達(dá)到116.3g/l，酶水解得率達(dá)到80.1％；中國專利201110195018.8中公開了一種新型大容量雙體循環(huán)纖維素酶解反應(yīng)器，其酶水解纖維素轉(zhuǎn)化率最高可達(dá)90％以上；中國專利201510401529.9中，邱學(xué)青等人利用復(fù)配的陰離子表面活性劑和陽離子表面活性劑可使糖化得率提高44％以上。

雖然纖維素水解技術(shù)取得了一定進(jìn)展，但仍然存在很多難以解決的問題：例如，為了獲得較高的水解轉(zhuǎn)化率和糖產(chǎn)品濃度，通常纖維素酶用量大，酶的添加量通常為20-45fpu/g原料；需要額外添加助劑促進(jìn)酶水解，增加了生產(chǎn)成本和產(chǎn)品后處理工藝的復(fù)雜性；復(fù)雜的反應(yīng)器設(shè)計致使投資成本高昂。以上這些不利因素制約纖維糖平臺相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展推進(jìn)。因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)更為高效和低成本的酶水解糖化工藝方法。

針對現(xiàn)有工藝存在的這些問題，本發(fā)明提供一種不添加任何額外化學(xué)試劑，也不需要復(fù)雜的反應(yīng)器，工藝設(shè)備簡單、易于規(guī)模化應(yīng)用的木質(zhì)纖維多段酶水解制糖生產(chǎn)工藝。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明通過改變固體和液體的物流輸送方式，以及各段酶添加量和反應(yīng)時間的不同組合，構(gòu)建了一套木質(zhì)纖維素的多段高效酶水解工藝方法，實現(xiàn)了酶水解轉(zhuǎn)化率和糖產(chǎn)品濃度的顯著提高。本發(fā)明的具體工藝方法主要包括以下步驟：

1)向第一酶水解罐(編號1#，其它酶水解罐編號以此類推至n)中加入新鮮木質(zhì)纖維素原料、纖維素酶和水，在一定溫度和ph值的條件下水解10-40小時；

2)步驟1)中第一酶水解反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行固液分離，分離得到的液體直接取出作為糖產(chǎn)品，分離得到的固體直接進(jìn)入第二酶水解罐進(jìn)行反應(yīng)；第二酶水解罐補(bǔ)充一定量的酶和水繼續(xù)按照步驟1)中所述條件進(jìn)行水解反應(yīng)8-30小時；

3)步驟2)中第二酶水解罐反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行固液分離，分離得到的液體輸送至第一酶水解罐繼續(xù)參與酶水解反應(yīng)，分離得到的固體直接進(jìn)入第三酶水解罐繼續(xù)進(jìn)行反應(yīng)；

……

n)步驟n-1)中第n-1酶水解罐反應(yīng)結(jié)束后，進(jìn)行固液分離，分離得到的液體輸送至第n-2酶水解罐繼續(xù)參與酶水解反應(yīng)，分離得到的固體直接進(jìn)入第n酶水解罐繼續(xù)進(jìn)行反應(yīng)。

優(yōu)選地，每段酶水解結(jié)束后液體進(jìn)入前一段工序參與酶水解反應(yīng)，而固體進(jìn)入下一段工序繼續(xù)酶水解，此過程不斷重復(fù)直至最后一段酶水解工序(第n酶水解罐)；在每段酶水解補(bǔ)充添加新鮮酶之前，需將底物和后一段輸送來的液體進(jìn)行充分預(yù)混合，以減少新鮮酶在底物上的無效吸附。

優(yōu)選地，各段酶水解持續(xù)進(jìn)行，第一酶水解罐不斷加入新鮮木質(zhì)纖維素原料，持續(xù)生產(chǎn)糖液產(chǎn)品以及提供第二酶水解罐反應(yīng)所需固體物料；后續(xù)的每段酶水解罐加入上一段反應(yīng)殘余的固體和下一段反應(yīng)得到的液體，同時按照比例補(bǔ)充添加酶和水進(jìn)行酶水解反應(yīng)；最后一段酶水解罐(n#)只加入上一段反應(yīng)殘余的固體，并按比例添加新鮮水和酶，反應(yīng)結(jié)束后液體進(jìn)入上一段酶水解罐參與酶水解，固體為木質(zhì)素廢棄物。隨著新鮮物料的不斷加入和各段酶水解工序的進(jìn)行，最終木質(zhì)纖維素原料的酶水解轉(zhuǎn)化率和1#酶水解罐產(chǎn)出糖產(chǎn)品濃度達(dá)到穩(wěn)定值，整個多段酶水解工藝流程達(dá)到穩(wěn)定。

優(yōu)選地，整個體系總酶用量控制在5-40fpu/g木質(zhì)纖維原料，優(yōu)選的總酶用量為10-20fpu/g木質(zhì)纖維素原料。

優(yōu)選地，單段反應(yīng)的酶用量為2-20fpu/g木質(zhì)纖維原料，優(yōu)選的單段反應(yīng)酶用量為4-18fpu。

優(yōu)選地，各段酶水解時間總和為36-90小時，優(yōu)選的酶水解時間總和為48-72小時。

優(yōu)選地，各段酶水解固體底物重量百分比濃度為4-30％，優(yōu)選的固體底物重量百分比濃度為6-18％。

優(yōu)選地，各段酶水解的反應(yīng)條件ph值為4.5-5.2，溫度為45-55℃。

優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的酶水解工藝方法段數(shù)n為2-8，優(yōu)選為2-6，更優(yōu)選為2-3。

優(yōu)選地，第一酶水解罐的酶用量要不低于后續(xù)其它酶水解罐的酶用量，第一酶水解罐的酶水解時間應(yīng)不低于后續(xù)其它單段酶水解罐的水解時間。

有益效果

相對于傳統(tǒng)的單段酶解工藝，本發(fā)明在同樣酶用量和反應(yīng)時間的條件下將得到更高的底物轉(zhuǎn)化率和最終糖產(chǎn)品濃度，整個酶解體系生產(chǎn)效率和產(chǎn)物濃度的提升將有利于降低能耗、減少耗水量，特別是有利于降低后續(xù)發(fā)酵產(chǎn)品的濃縮成本，從而提高整個木質(zhì)纖維素生化轉(zhuǎn)化的經(jīng)濟(jì)性；本發(fā)明無需復(fù)雜的反應(yīng)器，投資成本低、工藝放大簡單。

附圖說明

圖1為表示根據(jù)本發(fā)明的酶水解工藝流程的示意圖；

圖2為表示根據(jù)實施例1的整個工藝過程中麥稈的形貌變化的掃描電鏡照片，a為初始原料；b為預(yù)處理后原料；c為單段酶解后原料；d為多段酶解后原料。

具體實施方式

以下，將詳細(xì)地描述本發(fā)明。在進(jìn)行描述之前，應(yīng)當(dāng)理解的是，在本說明書和所附的權(quán)利要求書中使用的術(shù)語不應(yīng)解釋為限制于一般含義和字典含義，而應(yīng)當(dāng)在允許發(fā)明人適當(dāng)定義術(shù)語以進(jìn)行最佳解釋的原則的基礎(chǔ)上，根據(jù)與本發(fā)明的技術(shù)方面相應(yīng)的含義和概念進(jìn)行解釋。因此，這里提出的描述僅僅是出于舉例說明目的的優(yōu)選實例，并非意圖限制本發(fā)明的范圍，從而應(yīng)當(dāng)理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，可以由其獲得其他等價方式或改進(jìn)方式。

在下文中，將參照附圖詳細(xì)地描述本公開的優(yōu)選的實施方式。在描述之前，應(yīng)當(dāng)了解在說明書和所附權(quán)利要求中使用的術(shù)語，并不應(yīng)解釋為局限于一般及辭典意義，而是應(yīng)當(dāng)基于允許發(fā)明人為最好的解釋而適當(dāng)定義術(shù)語的原則，基于對應(yīng)于本發(fā)明技術(shù)層面的意義及概念進(jìn)行解釋。因此，在此的描述僅為說明目的的優(yōu)選實例，而并非是意指限制本發(fā)明的范圍，因而應(yīng)當(dāng)了解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以做出其他等同實施和修改。

本發(fā)明酶解反應(yīng)均在常規(guī)恒溫機(jī)械攪拌反應(yīng)器中進(jìn)行。

實施例1：

麥稈經(jīng)過20wt％亞硫酸銨脫木質(zhì)素處理后(140℃、2小時、液固比6)的木質(zhì)纖維素作為酶水解的底物，進(jìn)行2段酶水解制糖。1#和2#酶水解罐的具體反應(yīng)條件分別為：酶用量為11fpu/g底物和4fpu/g底物(酶總用量15fpu/g底物)；酶水解時間為36小時和12小時(總反應(yīng)時間48小時)；各段酶水解的溫度、底物濃度和ph值均為50℃、8％和4.8。約在進(jìn)行第6批木質(zhì)纖維原料酶水解時，酶水解系統(tǒng)達(dá)到穩(wěn)定生產(chǎn)狀態(tài)。此時，1#酶水解罐得到的糖濃度約為53g/l，底物總糖轉(zhuǎn)化率為82％。

整個工藝過程中麥稈的形貌變化如圖2所示，圖中可見根據(jù)本實施例的多段酶水解方法更有利于破壞木質(zhì)纖維原料的天然結(jié)構(gòu)。

實施例2

以商品漂白針葉木漿為原料(酶水解底物)，直接采用3段酶水解制糖。1#、2#和3#酶水解罐的具體反應(yīng)條件分別為：酶用量20fpu/g底物、5fpu/g底物和5fpu/g底物(酶總用量30fpu/g底物)；酶水解時間為48小時、12小時和12小時(總反應(yīng)時間72小時)；底物濃度為20％、15％和10％；各段酶水解的溫度和ph值均為50℃和4.8。約在進(jìn)行第8批木質(zhì)纖維原料酶水解時，酶水解系統(tǒng)達(dá)到穩(wěn)定生產(chǎn)狀態(tài)。此時，1#酶水解罐得到的糖濃度約為126g/l，底物總糖轉(zhuǎn)化率為77％。

實施例3

玉米秸稈經(jīng)過重量百分比濃度為12wt％的naoh脫木質(zhì)素處理后(130℃、2小時、液固比6)，進(jìn)行3段酶水解制糖。1#、2#和3#酶水解罐的具體反應(yīng)條件分別為：酶用量為12fpu/g底物、5fpu/g底物和3fpu/g底物(酶總用量20fpu/g底物)；酶水解時間為24小時、12小時和12小時(總反應(yīng)時間48小時)；各段酶水解的溫度、底物濃度和ph值均為50℃、12％和4.8。約在進(jìn)行第8批木質(zhì)纖維原料酶水解時，酶水解系統(tǒng)達(dá)到穩(wěn)定生產(chǎn)狀態(tài)。此時，1#酶水解罐得到的產(chǎn)品糖濃度約為82g/l，底物總糖轉(zhuǎn)化率為83％。

實施例4

以微晶纖維素為，直接采用4段酶水解工藝制糖。1#、2#、3#和4#酶水解罐的具體反應(yīng)條件分別為：酶用量為12fpu/g底物、8fpu/g底物、4fpu/g底物和4fpu/g底物(酶總用量28fpu/g底物)；酶水解時間為24小時、12小時、12小時和12小時(總反應(yīng)時間60小時)；各段酶水解的溫度、底物濃度和ph值均為50℃、10％和4.8。約在進(jìn)行第8批木質(zhì)纖維原料酶水解時，酶水解系統(tǒng)達(dá)到穩(wěn)定生產(chǎn)狀態(tài)。此時，1#酶水解罐得到的產(chǎn)品糖濃度約為85g/l，底物總糖轉(zhuǎn)化率為87％。

實施例5

以商品漂白麥草漿為原料，直接采用2段酶水解制糖。1#和2#酶水解罐的具體反應(yīng)條件分別為：酶用量為17fpu/g底物和3fpu/g底物(酶總用量20fpu/g底物)；酶水解時間為48小時和12小時(總反應(yīng)時間60小時)；底物濃度為14％和6％；各段酶水解的溫度和ph值為50℃和4.8。約在進(jìn)行第7批木質(zhì)纖維原料酶水解時，酶解系統(tǒng)達(dá)到穩(wěn)定生產(chǎn)狀態(tài)。此時，1#酶水解罐得到的糖濃度約為103g/l，底物總糖轉(zhuǎn)化率為83％。

對比實施例1

按照實施例1同樣的反應(yīng)容器、總酶用量和總反應(yīng)時間的條件下，僅通過單段酶水解方式處理木質(zhì)纖維素，結(jié)果糖濃度僅為43g/l，底物總糖轉(zhuǎn)化率只有61％。說明多段酶水解工藝的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物濃度均優(yōu)于傳統(tǒng)的單段酶水解工藝。

對比實施例2

按照實施例2同樣的反應(yīng)容器、總酶用量和總反應(yīng)時間的條件下，僅通過單段酶水解方式處理木質(zhì)纖維素，結(jié)果糖濃度為73g/l，底物總糖轉(zhuǎn)化率為45％。

對比實施例3

按照實施例3同樣的反應(yīng)容器、總酶用量和總反應(yīng)時間的條件下，僅通過單段酶水解方式處理木質(zhì)纖維素，結(jié)果糖濃度為49g/l，底物總糖轉(zhuǎn)化率為56％。

對比實施例4

按照實施例4同樣的反應(yīng)容器、總酶用量和總反應(yīng)時間的條件下，僅通過單段酶水解方式處理木質(zhì)纖維素，結(jié)果糖濃度為62g/l，底物總糖轉(zhuǎn)化率為58％。

對比實施例5

按照實施例5同樣的反應(yīng)容器、總酶用量和總反應(yīng)時間的條件下，僅通過單段酶水解方式處理木質(zhì)纖維素，結(jié)果糖濃度為63g/l，底物總糖轉(zhuǎn)化率為54％。