本發(fā)明關(guān)于對ephrin?a型受體10(epha10)具有特異性之抗體或其抗原結(jié)合片段、表現(xiàn)其之嵌合抗原受體t細(xì)胞及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、利用治療性單株抗體治療包括實(shí)體及血液系統(tǒng)惡性疾病在內(nèi)之人類疾病是得到充分驗(yàn)證及確定的。嵌合或人類化單株抗體因其較低之免疫副作用而特別適用于治療應(yīng)用。在開發(fā)用于癌癥治療之各種免疫療法中，嵌合抗原受體(car)t細(xì)胞療法被視為一種強(qiáng)大的策略。一般而言，car?t細(xì)胞療法藉由以下方式執(zhí)行：對患者之t細(xì)胞進(jìn)行基因修飾以使其表現(xiàn)腫瘤特異性car，離體細(xì)胞擴(kuò)增并將其再回輸至患者體內(nèi)。盡管在急性淋巴球性白血病之臨床試驗(yàn)中實(shí)現(xiàn)高達(dá)92％的完全恢復(fù)率，但car?t細(xì)胞療法之臨床經(jīng)驗(yàn)仍受到若干挑戰(zhàn)限制，例如car-t細(xì)胞之?dāng)U增及腫瘤特異性抗原之選擇。

2、因此，需要開發(fā)一種治療癌癥的新穎方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本揭示提供一種新穎癌癥抗原受體及其應(yīng)用。

2、因此，本揭示提供一種對epha10之抗原決定基具有特異性的抗體或其抗原結(jié)合片段。因此，根據(jù)本揭示之抗體可用于治療及/或預(yù)防由epha10活性及/或信號傳導(dǎo)引起或與epha10活性及/或信號傳導(dǎo)相關(guān)之疾病及/或病癥。本揭示之抗體亦可用于偵測epha10。

3、在一些實(shí)施例中，本揭示提供一種對epha10中之抗原決定基具有特異性的抗體或其抗原結(jié)合片段；其中該抗體或其抗原結(jié)合片段包含重鏈可變區(qū)之互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)及輕鏈可變區(qū)之互補(bǔ)決定區(qū)，其中該重鏈可變區(qū)之該等互補(bǔ)決定區(qū)包含cdrh1區(qū)、cdrh2區(qū)及cdrh3區(qū)，且該輕鏈可變區(qū)之該等互補(bǔ)決定區(qū)包含cdrl1區(qū)、cdrl2區(qū)及cdrl3區(qū)，且其中：

4、該cdrh1區(qū)包含seq?id?no:1之氨基酸序列或其實(shí)質(zhì)上類似之序列；該cdrh2區(qū)包含seq?id?no:2之氨基酸序列或其實(shí)質(zhì)上類似之序列；該cdrh3區(qū)包含seq?id?no:3之氨基酸序列或其實(shí)質(zhì)上類似之序列；且

5、該cdrl1區(qū)包含seq?id?no:4之氨基酸序列或其實(shí)質(zhì)上類似之序列；該cdrl2區(qū)包含seq?id?no:5之氨基酸序列或其實(shí)質(zhì)上類似之序列；該cdrl3區(qū)包含seq?id?no:6之氨基酸序列或其實(shí)質(zhì)上類似之序列。

6、在一些實(shí)施例中，該抗體或其抗原結(jié)合片段包括含seq?id?no:7之氨基酸序列或其實(shí)質(zhì)上類似之序列的重鏈可變區(qū)；及包括含seq?id?no:8之氨基酸序列或其實(shí)質(zhì)上類似之序列的輕鏈可變區(qū)。

7、在一些實(shí)施例中，該抗體是單株抗體、嵌合抗體、人類化抗體、人類抗體或奈米抗體。

8、在一些實(shí)施例中，本揭示提供一種多特異性抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含：

9、第一抗原結(jié)合部分，其包含如本文所揭示之抗epha10抗體或其抗原結(jié)合片段；及

10、至少一個第二抗原結(jié)合部分。

11、在一些實(shí)施例中，該第二抗原結(jié)合部分包含對cd3中之抗原決定基具有特異性之抗體或其抗原結(jié)合片段的抗cd3部分或包含對cd16中之抗原決定基具有特異性之抗體或其抗原結(jié)合片段的抗cd16部分。

12、在一些實(shí)施例中，該多特異性抗體或其抗原結(jié)合片段包含

13、該第一抗原結(jié)合部分及該抗cd3部分；

14、該第一抗原結(jié)合部分及該抗cd16部分；或

15、該第一抗原結(jié)合部分、該抗cd3部分及該抗cd16部分。

16、在一些實(shí)施例中，該多特異性抗體或其抗原結(jié)合片段自n末端至c末端呈以下布置：[該第一抗原結(jié)合部分]-[該抗cd3部分]、[該抗cd3部分]-[該第一抗原結(jié)合部分]、[該第一抗原結(jié)合部分]-[該抗cd16部分]、[該抗cd16部分]-[該第一抗原結(jié)合部分]、[該第一抗原結(jié)合部分]-[該抗cd3部分]-[該抗cd16部分]、[該第一抗原結(jié)合部分]-[該抗cd16部分]-[該抗cd3部分]、[該抗cd3部分]-[該第一抗原結(jié)合部分]-[該抗cd16部分]、[該抗cd3部分]-[該抗cd16部分]-[該第一抗原結(jié)合部分]、[該抗cd16部分]-[該抗cd3部分]-[該第一抗原結(jié)合部分]或[該抗cd16部分]-[該第一抗原結(jié)合部分]-[該抗cd3部分]。

17、在一些實(shí)施例中，該多特異性抗體或其抗原結(jié)合片段進(jìn)一步包含位于該第一抗原結(jié)合部分與該第二抗原結(jié)合部分中之任何兩個之間的連接符。

18、在本揭示之一些實(shí)施例中，該多特異性抗體或其抗原結(jié)合片段進(jìn)一步包含分泌信號肽。

19、在本揭示之一些實(shí)施例中，該多特異性抗體或其抗原結(jié)合片段進(jìn)一步包含蛋白質(zhì)純化標(biāo)簽。

20、在本揭示之一些實(shí)施例中，該抗體或其抗原結(jié)合片段或該多特異性抗體或其抗原結(jié)合片段是與治療劑結(jié)合。治療劑之實(shí)例包括但不限于抗代謝物、烷化劑、類烷化劑、dna小溝(minor?groove)烷化劑、蒽環(huán)霉素(anthracyclines)、抗生素、卡奇霉素(calicheamicin)、抗有絲分裂劑、拓樸異構(gòu)酶抑制劑、hdac抑制劑、蛋白酶體抑制劑及放射性同位素。

21、在本揭示之一些實(shí)施例中，該抗體或其抗原結(jié)合片段或該多特異性抗體或其抗原結(jié)合片段是在細(xì)胞之表面上表現(xiàn)。該細(xì)胞可為免疫細(xì)胞或干細(xì)胞。在本揭示之一個實(shí)施例中，該免疫細(xì)胞是t細(xì)胞。在另一態(tài)樣中，干細(xì)胞可為誘導(dǎo)性富潛能干細(xì)胞。

22、本揭示亦提供一種載體，其編碼該抗體或其抗原結(jié)合片段或該多特異性抗體或其抗原結(jié)合片段。

23、在另一態(tài)樣中，本揭示提供一種經(jīng)基因工程改造之細(xì)胞，其表現(xiàn)該抗體或其抗原結(jié)合片段或該多特異性抗體或其抗原結(jié)合片段，或含有該載體。該經(jīng)基因工程改造之細(xì)胞可為免疫細(xì)胞或干細(xì)胞。此外，本揭示提供一種免疫細(xì)胞，其由經(jīng)基因工程改造之細(xì)胞分化得到。

24、本揭示提供一種醫(yī)藥組合物，其包含有效量的該抗體或其抗原結(jié)合片段、該多特異性抗體或其抗原結(jié)合片段、該經(jīng)基因工程改造之細(xì)胞或該免疫細(xì)胞。

25、本揭示提供一種用于抑制有需要之個體中epha10介導(dǎo)之信號傳導(dǎo)的方法，其包含向該個體投與該醫(yī)藥組合物?；蛘?，本揭示提供一種用于抑制有需要之個體中epha10介導(dǎo)之信號傳導(dǎo)的醫(yī)藥組合物，其包含有效量的如本文所揭示之抗體或其抗原結(jié)合片段、該多特異性抗體或其抗原結(jié)合片段、經(jīng)基因工程改造之細(xì)胞或免疫細(xì)胞。

26、本揭示亦提供一種用于在罹患由epha10活性及/或信號傳導(dǎo)引起或與epha10活性及/或信號傳導(dǎo)相關(guān)之疾病及/或病癥的個體中治療、預(yù)防性治療及/或預(yù)防該等疾病及/或病癥的方法，其包含向該個體投與該醫(yī)藥組合物?；蛘撸窘沂咎峁┮环N用于在罹患由epha10活性及/或信號傳導(dǎo)引起或與epha10活性及/或信號傳導(dǎo)相關(guān)之疾病及/或病癥的個體中治療、預(yù)防性治療及/或預(yù)防該等疾病及/或病癥的醫(yī)藥組合物，其包含有效量的如本文所揭示之抗體或其抗原結(jié)合片段、該多特異性抗體或其抗原結(jié)合片段、經(jīng)基因工程改造之細(xì)胞或免疫細(xì)胞。

27、本揭示亦提供一種用于在罹患腫瘤之個體中治療、預(yù)防性治療及/或預(yù)防該腫瘤的方法，其包含向該個體投與該醫(yī)藥組合物。在本揭示之一些實(shí)施例中，腫瘤是實(shí)體腫瘤。腫瘤之實(shí)例包括但不限于腎細(xì)胞癌、胰臟癌、乳癌、頭頸癌、前列腺癌、惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤、骨肉瘤、大腸直腸癌、胃癌、惡性間皮瘤、多發(fā)性骨髓瘤、卵巢癌、小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、滑膜肉瘤、甲狀腺癌或黑色素瘤?；蛘撸窘沂咎峁┮环N用于在罹患腫瘤之個體中治療、預(yù)防性治療及/或預(yù)防該腫瘤的醫(yī)藥組合物，其包含有效量的如本文所揭示之抗體或其抗原結(jié)合片段、該多特異性抗體或其抗原結(jié)合片段、經(jīng)基因工程改造之細(xì)胞或免疫細(xì)胞。

28、本揭示提供一種用于偵測樣本中之epha10的方法，其包含使該樣本與該抗體或其抗原結(jié)合片段接觸。

29、本揭示提供一種用于中和有需要之個體中之epha10的方法，其包含向該個體投與該抗體或其抗原結(jié)合片段。或者，本揭示提供一種用于中和有需要之個體中之epha10的醫(yī)藥組合物，其包含有效量的如本文所揭示之抗體或其抗原結(jié)合片段、該多特異性抗體或其抗原結(jié)合片段、經(jīng)基因工程改造之細(xì)胞或免疫細(xì)胞。

30、本揭示提供一種用于偵測樣本中之epha10的套組，其中該套組包含該抗體或其抗原結(jié)合片段或該多特異性抗體或其抗原結(jié)合片段。

31、以下部分中詳細(xì)描述本揭示。本揭示之其他特征、目的及優(yōu)點(diǎn)可見于實(shí)施方式及權(quán)利要求中。

32、圖式簡單說明

33、圖1顯示針對抗epha10抗體cmu#5之結(jié)合特異性分析的結(jié)果。

34、圖2顯示抗epha10抗體cmu#5之結(jié)合親和力分析的結(jié)果。

35、圖3顯示epha10?trinte對乳癌細(xì)胞之細(xì)胞毒性作用。

36、圖4顯示epha10?bite對乳癌細(xì)胞之細(xì)胞毒性作用。

37、圖5顯示epha10?bike對乳癌細(xì)胞之細(xì)胞毒性作用。

38、圖6顯示epha10?trinte對t細(xì)胞或nk細(xì)胞活化之作用。

39、圖7顯示epha10?trinte在動物模型中對癌癥抑制之作用。

40、圖8顯示共培養(yǎng)t細(xì)胞、nk細(xì)胞、bt-549細(xì)胞及epha10?trinte之免疫染色結(jié)果。

41、圖9顯示，藉由將抗epha10?car?t細(xì)胞與乳癌細(xì)胞共培養(yǎng)來驗(yàn)證抗epha10car-t細(xì)胞的增加之細(xì)胞毒性作用。

42、實(shí)施方式

43、應(yīng)了解，本揭示不限于本文所描述之特定材料及方法。亦應(yīng)了解，本文所使用之術(shù)語系出于描述特定實(shí)施例之目的且不意欲限制本揭示之范圍，本揭示之范圍將僅由所附權(quán)利要求限制。

44、必須注意的是，除非上下文另外明確指示，否則如本說明書及所附權(quán)利要求中所使用，單數(shù)形式“一個(種)(a/an)”及“該(the)”包括多數(shù)個(種)指示物。

45、如本文所使用，術(shù)語“抗體”意謂與特定抗原(epha10)特異性結(jié)合或相互作用的包含至少一個互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)之任何抗原結(jié)合分子或分子復(fù)合物。術(shù)語“抗體”包括免疫球蛋白分子以及其多聚體(例如igm)，該等免疫球蛋白分子包含四條多肽鏈，即藉由二硫鍵互連的兩條重(h)鏈及兩條輕(l)鏈。各重鏈包含重鏈可變區(qū)(本文中縮寫為hcvr或vh)及重鏈恒定區(qū)。重鏈恒定區(qū)包含三個域，即ch1、ch2及ch3。各輕鏈包含輕鏈可變區(qū)(本文中縮寫為lcvr或vl)及輕鏈恒定區(qū)。輕鏈恒定區(qū)包含一個域(cl1)。vh區(qū)及vl區(qū)可進(jìn)一步再分成高變區(qū)，稱為互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)，間雜有稱為構(gòu)架區(qū)(fr)的更為保守之區(qū)域。各vh及vl由三個cdr及四個fr構(gòu)成，自氨基末端至羧基末端按以下次序布置：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。在本揭示之不同實(shí)施例中，抗epha10抗體(或其抗原結(jié)合部分)之fr可與人類生殖系序列一致，或可經(jīng)天然或人工修飾。氨基酸共同序列可以基于兩個或更多個cdr之并列分析來界定。

46、如本文所使用，術(shù)語“對……具有特異性”意謂抗體不與其他抗原決定基發(fā)生顯著程度的交叉反應(yīng)。

47、如本文所使用，術(shù)語“抗原決定基”指抗原上抗體所結(jié)合之位點(diǎn)。

48、如本文所使用，術(shù)語“互補(bǔ)決定區(qū)”(cdr)指在重鏈及輕鏈多肽之可變區(qū)內(nèi)發(fā)現(xiàn)的不連續(xù)抗原組合位點(diǎn)。cdr描述于kabat等人，j.biol.chem.252:6609-6616(1977)；kabat等人,u.s.dept.of?health?and?human?services,“sequences?of?proteins?ofimmunological?interest”(1991)；chothia等人,j.mol.biol.196:901-917(1987)；及maccallum等人,j.mol.biol.262:732-745(1996)，其中定義包括相互比較時氨基酸殘基的重迭或子集。

49、當(dāng)應(yīng)用于多肽時，術(shù)語“相當(dāng)大的相似性”或“實(shí)質(zhì)上類似”意謂兩個肽序列在諸如藉由程序gap或bestfit，使用預(yù)設(shè)空位權(quán)重最優(yōu)選地比對時，共有至少95％序列一致性，甚至更優(yōu)選地至少98％或99％序列一致性。不一致之殘基位置優(yōu)選因保守性氨基酸取代而不同?！氨Ｊ匦园被崛〈笔沁@樣一種氨基酸取代，其中氨基酸殘基經(jīng)側(cè)鏈(r基團(tuán))具有類似化學(xué)特性(例如電荷或疏水性)之另一氨基酸殘基取代。一般而言，保守性氨基酸取代實(shí)質(zhì)上不會改變蛋白質(zhì)之功能特性。在兩個或更多個氨基酸序列因保守取代而彼此不同的情況下，可上調(diào)序列一致性或相似度百分比以根據(jù)取代之保守性質(zhì)加以校正。進(jìn)行此調(diào)節(jié)之方式是熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者熟知的。側(cè)鏈具有類似化學(xué)特性之氨基酸組的實(shí)例包括(1)脂族側(cè)鏈：甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、白氨酸及異白氨酸；(2)脂族羥基側(cè)鏈：絲氨酸及蘇氨酸；(3)含有酰氨之側(cè)鏈：天冬酰氨及麩酰氨酸；(4)芳族側(cè)鏈：苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸；(5)堿性側(cè)鏈：離氨酸、精氨酸及組氨酸；(6)酸性側(cè)鏈：天冬氨酸及麩氨酸；及(7)含硫側(cè)鏈系半胱氨酸及甲硫氨酸。優(yōu)選的保守性氨氨基酸取代組為：纈氨酸-白氨酸-異白氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、離氨酸-精氨酸、丙氨酸-纈氨酸、麩氨酸-天冬氨酸及天冬酰氨-麩酰氨酸?；蛘?，保守性置換是在以引用的方式并入本文中之gonnet等人(1992)science?256:1443-1445中所揭示的pam250對數(shù)概似矩陣中具有正值的任何變化?！爸械缺Ｊ匦浴敝脫Q是在pam250對數(shù)概似矩陣中具有非負(fù)值的任何變化。

50、如本文所使用，術(shù)語“單株抗體”不限于經(jīng)由融合瘤技術(shù)產(chǎn)生之抗體。單株抗體是藉由此項(xiàng)技術(shù)中可用或已知的任何手段，自單一殖株得到，該殖株包括任何真核、原核或噬菌體殖株。

51、如本文所使用，術(shù)語“嵌合”抗體指具有來源于非人類免疫球蛋白之可變序列及通常選自人類免疫球蛋白模板之人類免疫球蛋白恒定區(qū)的抗體。

52、非人類抗體之“人類化”形式含有來源于非人類免疫球蛋白之最小序列的嵌合免疫球蛋白。一般而言，人類化抗體將包含至少一個且通常兩個可變域之實(shí)質(zhì)上全部，其中全部或?qū)嵸|(zhì)上全部的cdr區(qū)對應(yīng)于非人類免疫球蛋白之cdr區(qū)且全部或?qū)嵸|(zhì)上全部的fr區(qū)系人類免疫球蛋白序列之fr區(qū)。

53、如本文所使用，術(shù)語“奈米抗體”指包含小型單一可變域(自駱駝及單峰駝獲得的抗體之vhh)的抗體。自駱駝及單峰駝(雙峰駱駝(camelus?baclrianus)及單峰駱駝(calelus?dromaderius))家族成員(包括新世界成員，諸如駱馬物種(羊駝(lama?pacos)、大羊駝(lama?glama)及瘦駝(lama?vicugna)))獲得的抗體蛋白已在大小、結(jié)構(gòu)復(fù)雜性及對人類個體之抗原性方面進(jìn)行表征。來自在自然界中所發(fā)現(xiàn)之此哺乳動物家族的某些igg抗體缺少輕鏈，且因此在結(jié)構(gòu)上不同于來自其他動物之抗體的具有兩條重鏈及兩條輕鏈之典型四鏈四級結(jié)構(gòu)。

54、如本文所使用，術(shù)語抗體之“抗原結(jié)合部分”、抗體之“抗原結(jié)合片段”及類似術(shù)語包括特異性結(jié)合抗原以形成復(fù)合物的任何天然存在、可以酶方式獲得、合成或經(jīng)基因工程改造之多肽或醣蛋白。

55、如本文所使用，“連接符”或“間隔子”肽指接合兩個多肽序列之短氨基酸序列(或編碼此類氨基酸序列之核酸)。“肽連接符”指接合兩個多肽序列之短氨基酸序列。示例性多肽連接符是將肽轉(zhuǎn)導(dǎo)域接合至抗體的連接符或在諸如scfv片段之類合成抗體片段中接合兩條抗體鏈之連接符。連接符是熟知的且任何已知連接符均可用于所提供之方法中。示例性多肽連接符為(gly-ser)n氨基酸序列，其中一些glu或lys殘基分散在各處以增加溶解性。其他示例性連接符描述于本文中；此等及其他已知連接符中之任一者均可用于所提供之組合物及方法。

56、如本揭示中所使用，術(shù)語“治療劑”意謂適合投與哺乳動物，例如人類的具有治療或藥理學(xué)作用之任何化合物、物質(zhì)、藥物、藥物或活性成分。如本文所使用，術(shù)語“免疫細(xì)胞”指在免疫反應(yīng)中起作用之細(xì)胞。免疫細(xì)胞為造血來源的，且包括淋巴球，諸如b細(xì)胞及t細(xì)胞；自然殺手細(xì)胞；骨髓細(xì)胞，諸如單核球、巨噬細(xì)胞、嗜伊紅血球、肥大細(xì)胞、嗜堿性球及顆粒球。

57、如本文所使用，術(shù)語“t細(xì)胞”包括cd4+t細(xì)胞及cd8+t細(xì)胞。術(shù)語t細(xì)胞亦包括t輔助1型t細(xì)胞、t輔助2型t細(xì)胞、t輔助17型t細(xì)胞及抑制性t細(xì)胞。

58、如本文所使用，術(shù)語“干細(xì)胞”指呈未分化或部分地分化狀態(tài)之細(xì)胞，其具有自我更新特性且具有自然分化為更易分化之細(xì)胞類型的發(fā)育潛能，關(guān)于發(fā)育潛能無特定隱含含義(亦即，分化全能、富潛能、多潛能等)。自我更新意謂干細(xì)胞能夠增殖且產(chǎn)生更多此類干細(xì)胞，同時維持其發(fā)育潛能。因此，術(shù)語“干細(xì)胞”指在特定情況下具有分化為更特定或分化表型之發(fā)育潛能，且在某些情況下保持增殖而不實(shí)質(zhì)上分化之能力的任何細(xì)胞亞群。

59、當(dāng)用于“富潛能細(xì)胞”時，術(shù)語“富潛能”指具有在不同條件下分化成全部三種生殖細(xì)胞層(內(nèi)胚層、中胚層及外胚層)特有之細(xì)胞類型之能力的細(xì)胞。富潛能細(xì)胞主要系藉由使用例如裸小鼠畸胎瘤形成分析測定的其分化成全部三種胚層之能力來表征。富潛能性亦藉由表現(xiàn)胚胎干(es)細(xì)胞標(biāo)志物證實(shí)，但針對富潛能性之優(yōu)選測試展示分化成該三種胚層中之各者之細(xì)胞的能力。

60、如本文所使用，術(shù)語“ips細(xì)胞”與“誘導(dǎo)性富潛能干細(xì)胞”可互換使用且指自分化細(xì)胞(例如非富潛能細(xì)胞)，通常為成體分化細(xì)胞，例如藉由使該細(xì)胞與任何化合物中之至少一種化合物接觸，而在技術(shù)上得到(例如藉由完全或部分反向誘導(dǎo))的富潛能細(xì)胞，該等化合物選自黃嘌呤、黃苷、次黃嘌呤或其類似物，例如具有黃嘌呤核之化合物。

61、如本文所使用，術(shù)語“載體”意指能夠轉(zhuǎn)運(yùn)所連接之另一種核酸的核酸分子。載體之一種類型為“質(zhì)體”，其指環(huán)狀雙股dna環(huán)，其中可連接額外dna區(qū)段。載體之另一類型為病毒載體，其中額外dna區(qū)段可連接至病毒基因體中。某些載體能夠在引入其之宿主細(xì)胞中自主復(fù)制(例如具有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)之細(xì)菌載體及游離型哺乳動物載體)。其他載體(例如非游離型哺乳動物載體)在引入至宿主細(xì)胞中時可整合至宿主細(xì)胞之基因體中，且藉此與宿主基因體一起復(fù)制。此外，某些載體能夠引導(dǎo)其操作性連接之基因的表現(xiàn)。此類載體在本文中被稱作“重組表現(xiàn)載體”(或簡稱為“表現(xiàn)載體”)。一般而言，用于重組dna技術(shù)中之表現(xiàn)載體常常呈質(zhì)體形式。由于質(zhì)體為載體之最常用形式，故在本說明書中，“質(zhì)體”與“載體”可互換使用。然而，本揭示意欲包括發(fā)揮等效功能的此類其他形式之表現(xiàn)載體，諸如病毒載體(例如復(fù)制缺陷型反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒以及腺相關(guān)病毒)。

62、術(shù)語細(xì)胞之“經(jīng)基因工程改造(genetically?engineered)”或“基因工程改造(genetic?engineering)”意指使用遺傳物質(zhì)操縱基因以改變細(xì)胞中之基因拷貝及/或基因表現(xiàn)量。遺傳物質(zhì)可呈dna或rna形式。遺傳物質(zhì)可藉由包括病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)及非病毒轉(zhuǎn)染在內(nèi)之各種方式轉(zhuǎn)移至細(xì)胞中。在經(jīng)基因工程改造之后，細(xì)胞中某些基因之表現(xiàn)量可永久或暫時改變。

63、在細(xì)胞個體發(fā)生之情形中，形容詞“分化(differentiated)”或“分化(differentiating)”為相對術(shù)語?！胺只?xì)胞”為相對于供比較之細(xì)胞，在發(fā)育途徑中進(jìn)一步向下發(fā)展的細(xì)胞。因此，干細(xì)胞可分化為譜系限制性前驅(qū)細(xì)胞，該等細(xì)胞又可進(jìn)一步沿路徑向下分化為其他類型之前驅(qū)細(xì)胞，且接著分化為末期分化細(xì)胞，該末期分化細(xì)胞在某一組織類型中起特有的作用，且可保持或可不保持進(jìn)一步增殖之能力。

64、如本揭示中所使用，術(shù)語“醫(yī)藥組合物”意謂含有向哺乳動物，例如人類投與以預(yù)防、治療或消除哺乳動物所患之特定疾病或病理病況之治療劑的混合物。

65、如本文所使用，術(shù)語“治療有效量”或“有效量”指當(dāng)投與哺乳動物或其他個體用于治療疾病時，足以實(shí)現(xiàn)對該疾病之該治療的抗體之量。

66、如本文所使用，術(shù)語“治療(treatment)”、“治療(treating)”及類似術(shù)語涵蓋哺乳動物，特別是人類之疾病的任何治療，且包括：(a)預(yù)防可能易患疾病但尚未診斷出患有該疾病的個體發(fā)生該疾病；(b)抑制疾病，亦即，遏制其發(fā)展；及(c)緩解疾病，亦即，使疾病消退。

67、術(shù)語“預(yù)防(preventing)”或“預(yù)防(prevention)”在此項(xiàng)技術(shù)中為公認(rèn)的，且當(dāng)與病況結(jié)合使用時，其包括在病況發(fā)作之前投與藥劑以相對于未接受該藥劑之個體，降低個體之醫(yī)學(xué)病況之癥狀的發(fā)生頻率或嚴(yán)重程度，或延遲其發(fā)作。

68、如本文可互換地使用的，術(shù)語“個人(individual)”、“個體(subject)”、“宿主”及“患者”指哺乳動物，包括但不限于鼠類(大鼠、小鼠)、非人類靈長類動物、人類、犬科動物、貓科動物、有蹄動物(例如馬科動物、牛科動物、綿羊科動物、豬科動物、山羊科動物)等。

69、如本文所使用，術(shù)語“需要治療”指由照護(hù)者(例如在人類之情況下為醫(yī)師、護(hù)士、護(hù)理從業(yè)者或個人；在包括非人類之哺乳動物在內(nèi)之動物的情況下為獸醫(yī))作出的個體需要治療或?qū)⑹芤嬗谥委熤袛唷４伺袛嗍腔诙喾N因素作出，該等因素系在照護(hù)者之專業(yè)知識領(lǐng)域內(nèi)，且包括個體由于可用本揭示之化合物治療之病況而患病或?qū)⒒疾〉闹R。

70、“癌癥”、“腫瘤”及類似術(shù)語包括癌變前細(xì)胞、贅生性細(xì)胞、轉(zhuǎn)型細(xì)胞及癌細(xì)胞，且可指實(shí)體腫瘤或非實(shí)體癌癥(參見例如edge等人,ajcc?cancer?staging?manual(第7版,2009)；cibas及ducatman?cytology:diagnostic?principles?and?clinical?correlates(第3版,2009))。癌癥包括良性贅瘤及惡性贅瘤(異常生長)兩者。“轉(zhuǎn)型”指自發(fā)性或誘導(dǎo)性表型變化，例如細(xì)胞不朽化、形態(tài)變化、異常細(xì)胞生長、減少之接觸抑制及固著及/或惡性疾病(參見freshney,culture?of?animal?cells?a?manual?of?basic?technique(第3版,1994))。盡管轉(zhuǎn)型可由用轉(zhuǎn)型病毒感染及并入新基因體dna或攝入外源dna引起，其亦可自發(fā)產(chǎn)生或在暴露于致癌物之后產(chǎn)生。

71、如本文所使用，術(shù)語“樣本”涵蓋獲自個人、個體或患者之多種樣本類型，且可用于診斷性或監(jiān)測分析中。該定義涵蓋血液及生物來源之其他液體樣本；固體組織樣本，諸如活組織檢查試樣或組織培養(yǎng)物或源自其之細(xì)胞及其后代。

72、本揭示產(chǎn)生對ephrin?a型受體10中之抗原決定基具有特異性的抗體或其抗原結(jié)合片段。

73、epha10系ephrin受體，即受體酪胺酸激酶(rtk)最大亞家族之成員，且在發(fā)育、血管生成及細(xì)胞分化中具有重要功能。先前的研究指示開發(fā)靶向epha10之單株抗體用于癌癥免疫療法的治療應(yīng)用。已發(fā)現(xiàn)，(1)epha10水平在除睪丸外之正常組織中極低；(2)相較于正常組織，epha10水平在各種類型之癌癥中較高；(3)epha10缺失藉由增強(qiáng)ctl介導(dǎo)之抗腫瘤免疫而誘導(dǎo)腫瘤消退。

74、具體言之，抗體或其抗原結(jié)合片段包含重鏈可變區(qū)之互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)及輕鏈可變區(qū)之互補(bǔ)決定區(qū)，其中該重鏈可變區(qū)之該等互補(bǔ)決定區(qū)包含cdrh1區(qū)、cdrh2區(qū)及cdrh3區(qū)，且該輕鏈可變區(qū)之該等互補(bǔ)決定區(qū)包含cdrl1區(qū)、cdrl2區(qū)及cdrl3區(qū)，且其中：

75、該cdrh1區(qū)包含seq?id?no:1之氨基酸序列或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性之實(shí)質(zhì)上類似之序列；該cdrh2區(qū)包含seq?id?no:2之氨基酸序列或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性之實(shí)質(zhì)上類似之序列；該cdrh3區(qū)包含seq?id?no:3之氨基酸序列或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性之實(shí)質(zhì)上類似之序列；且

76、該cdrl1區(qū)包含seq?id?no:4之氨基酸序列或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性之實(shí)質(zhì)上類似之序列；該cdrl2區(qū)包含seq?id?no:5之氨基酸序列或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性之實(shí)質(zhì)上類似之序列；該cdrl3區(qū)包含seq?id?no:6之氨基酸序列或具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性之實(shí)質(zhì)上類似之序列。

77、序列表示于表1中。

78、表1：

79、

80、

81、在一些實(shí)施例中，該抗體或其抗原結(jié)合片段包括含seq?id?no:7之氨基酸序列或其實(shí)質(zhì)上類似之序列的重鏈可變區(qū)；及包括含seq?id?no:8之氨基酸序列或其實(shí)質(zhì)上類似之序列的輕鏈可變區(qū)。在一些其他實(shí)施例中，該抗體或其抗原結(jié)合片段包括含seq?id?no:7之氨基酸序列或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的實(shí)質(zhì)上類似之序列的重鏈可變區(qū)。在一些其他實(shí)施例中，該抗體或其抗原結(jié)合片段包括含seq?idno:8之氨基酸序列或其具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％序列一致性的實(shí)質(zhì)上類似之序列的輕鏈可變區(qū)。

82、根據(jù)本揭示之抗體可為全長的(例如igg1或igg4抗體)或可僅包含抗原結(jié)合部分(例如fab、f(ab')2或scfv片段)，且可視需要經(jīng)修飾以影響功能性。

83、一般熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者已知之各種技術(shù)均可用于確定抗體是否“對多肽或蛋白質(zhì)內(nèi)之一或多個氨基酸具有特異性”。例示性技術(shù)包括例如常規(guī)交叉阻斷分析，諸如antibodies,harlow及l(fā)ane(cold?spring?harbor?press,cold?spring?harb.,ny)所描述之分析；丙胺酸掃描突變分析；肽墨點(diǎn)分析(reineke,2004,methods?mol?biol?248:443-463)；及肽裂解分析。另外，可采用諸如抗原決定基切除、抗原決定基提取及抗原化學(xué)修飾之類方法(tomer,2000,protein?science?9:487-496)?？捎糜阼b別與抗體特異性結(jié)合之多肽內(nèi)之氨基酸的另一方法為藉由質(zhì)譜法偵測之氫/氘交換。一般而言，氫/氘交換方法涉及氘標(biāo)記感興趣蛋白質(zhì)，隨后使抗體與該氘標(biāo)記之蛋白質(zhì)結(jié)合。接下來，將蛋白質(zhì)/抗體復(fù)合物轉(zhuǎn)移至水中以允許氫-氘交換在除了受抗體保護(hù)之殘基(其保持氘標(biāo)記)以外的所有殘基處發(fā)生。在抗體解離之后，對目標(biāo)蛋白進(jìn)行蛋白酶裂解及質(zhì)譜分析，由此揭露對應(yīng)于與抗體相互作用之特定氨基酸的氘標(biāo)記之殘基。參見例如ehring(1999)analyticalbiochemistry?267(2):252-259；engen及smith(2001)anal.chem.73:256a-265a。

84、藉由使用此項(xiàng)技術(shù)中已知之常規(guī)方法，可以容易地確定抗體是否對與參考抗epha10抗體相同之抗原決定基具有特異性或與參考抗epha10抗體競爭結(jié)合。舉例而言，為了確定測試抗體是否與本揭示之參考抗epha10抗體結(jié)合至相同之抗原決定基，使參考抗體結(jié)合至epha10蛋白。接下來，評估測試抗體與epha10分子結(jié)合之能力。若在epha10與參考抗epha10抗體飽和結(jié)合之后，測試抗體仍能夠結(jié)合至epha10，則可推斷測試抗體與參考抗epha10抗體結(jié)合至不同的抗原決定基。另一方面，若在epha10與參考抗epha10抗體飽和結(jié)合之后，測試抗體不能夠結(jié)合至epha10分子，則測試抗體可結(jié)合至與本揭示之參考抗epha10抗體所結(jié)合之抗原決定基相同的抗原決定基。接著，可進(jìn)行其他常規(guī)實(shí)驗(yàn)(例如肽突變及結(jié)合分析)，以確認(rèn)所觀察到的測試抗體結(jié)合之缺乏實(shí)際上系由于與參考抗體結(jié)合至同一抗原決定基，還是空間阻斷(或另一現(xiàn)象)造成所觀察到的結(jié)合之缺乏。此類實(shí)驗(yàn)可使用elisa、ria、biacore、流式細(xì)胞分析技術(shù)或此項(xiàng)技術(shù)中可用之任何其他定量或定性抗體結(jié)合分析來進(jìn)行。根據(jù)本揭示之某些實(shí)施例，當(dāng)在競爭性結(jié)合分析中量測時，若例如1倍、5倍、10倍、20倍或100倍過量之一種抗體將另一種抗體之結(jié)合抑制至少50％但優(yōu)選地75％、90％或甚至99％，則兩種抗體結(jié)合至相同(或重迭)的抗原決定基。或者，若抗原中降低或消除一種抗體之結(jié)合的基本上所有氨基酸突變皆降低或消除另一種抗體之結(jié)合，則將兩種抗體視為結(jié)合至相同抗原決定基。若僅一小組減少或消除一種抗體之結(jié)合的氨基酸突變減少或消除另一種抗體之結(jié)合，則認(rèn)為兩種抗體具有“重迭的抗原決定基”。

85、抗體亦包括完整抗體分子之抗原結(jié)合片段?？贵w之抗原結(jié)合片段可使用任何適合之標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，諸如蛋白水解消化或涉及編碼抗體可變域及視情況存在之恒定域之dna之操縱及表現(xiàn)的重組基因工程改造技術(shù)，例如自完整抗體分子得到。此類dna是已知的及/或可自例如商業(yè)來源、dna庫(包括例如噬菌體-抗體庫)容易地獲得，或可以合成?？梢詫na定序，并以化學(xué)方式或藉由使用分子生物學(xué)技術(shù)定序及操縱，例如將一或多個可變域及/或恒定域布置成適合組態(tài)，或引入密碼子，產(chǎn)生半胱胺酸殘基，修飾、添加或缺失氨基酸等。

86、抗原結(jié)合片段之非限制性實(shí)例包括：(i)fab片段；(ii)f(ab')2片段；(iii)fd片段；(iv)fv片段；(v)單鏈fv(scfv)分子；(vi)dab片段；以及(vii)由模擬抗體高變區(qū)之氨基酸殘基組成的最小識別單元(例如經(jīng)分離之互補(bǔ)決定區(qū)(cdr)，諸如cdr3肽)，或受限制之fr3-cdr3-fr4肽。其他經(jīng)工程改造之分子，諸如域特異性抗體、單域抗體、域缺失抗體、嵌合抗體、cdr移植抗體、雙功能抗體、三功能抗體、四功能抗體、微型抗體、奈米抗體(例如單價奈米抗體、二價奈米抗體等)、小模塊免疫藥物(smip)及鯊魚可變ignar域亦涵蓋在如本文所使用之表述“抗原結(jié)合片段”內(nèi)。

87、抗體之抗原結(jié)合片段通常包含至少一個可變域?？勺冇蚩蔀槿魏未笮』虬被峤M成且一般將包含與一或多個構(gòu)架序列相鄰或同框之至少一個cdr。在具有與vl域相關(guān)聯(lián)之vh域的抗原結(jié)合片段中，vh及vl域可相對于彼此以任何適合的布置定位。舉例而言，可變區(qū)可為二聚體且含有vh-vh、vh-vl或vl-vl二聚體?；蛘撸贵w之抗原結(jié)合片段可以含有單體vh或vl域。

88、在某些實(shí)施例中，抗體之抗原結(jié)合片段可含有與至少一個恒定域共價連接之至少一個可變域?？梢娪诒窘沂局贵w之抗原結(jié)合片段內(nèi)的可變域及恒定域之非限制性例示性組態(tài)包括：(i)vh-ch1；(ii)vh-ch2；(iii)vh-ch3；(iv)vh-ch1-ch2；(v)vh-ch1-ch2-ch3；(vi)vh-ch2-ch3；(vii)vh-cl；(viii)vl-ch1；(ix)vl-ch2；(x)vl-ch3；(xi)vl-ch1-ch2；(xii)vl-ch1-ch2-ch3；(xiii)vl-ch2-ch3；及(xiv)vl-cl。在可變域及恒定域之任何組態(tài)，包括上文所列之例示性組態(tài)中的任一者中，可變域及恒定域可彼此直接連接或可以藉由完全或部分鉸鏈區(qū)或連接符區(qū)連接。鉸鏈區(qū)可由至少2個(例如5個、10個、15個、20個、40個、60個或更多個)氨基酸組成，該等氨基酸在單個多肽分子中之相鄰可變域及/或恒定域之間產(chǎn)生可撓性或半可撓性鍵聯(lián)。此外，本揭示抗體之抗原結(jié)合片段可包含上文列出的任何可變域及恒定域組態(tài)彼此非共價締合及/或與一或多個單體vh或vl域(例如藉由二硫鍵)非共價締合之均二聚體或雜二聚體(或其他多聚體)。

89、相較于得到抗體之相應(yīng)生殖系序列，本文所揭示之抗epha10抗體可在重鏈及輕鏈可變域之構(gòu)架區(qū)及/或cdr區(qū)中包含一或多個氨基酸取代、插入及/或缺失。此類突變可容易地藉由比較本文所揭示之氨基酸序列與可得自例如公共抗體序列數(shù)據(jù)庫之生殖系序列來確定。本揭示包括一種抗體及其抗原結(jié)合片段，其來源于本文所揭示之氨基酸序列中之任一者，其中在一或多個構(gòu)架區(qū)及/或cdr區(qū)內(nèi)之一或多個氨基酸突變?yōu)榈玫皆摽贵w之生殖系序列的相應(yīng)殘基，或另一哺乳動物生殖系序列之相應(yīng)殘基，或相應(yīng)生殖系殘基之保守性氨基酸取代(此類序列變化在本文中統(tǒng)稱為“生殖系突變”)。以本文所揭示之重鏈及輕鏈可變區(qū)序列為起始物質(zhì)，熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者可以容易地產(chǎn)生許多包含一或多個個別生殖系突變或其組合的抗體及抗原結(jié)合片段。在某些實(shí)施例中，vh及/或vl域內(nèi)之所有構(gòu)架及/或cdr殘基全部回復(fù)突變?yōu)樵诘玫皆摽贵w之初始生殖系序列中發(fā)現(xiàn)的殘基。在其他實(shí)施例中，僅某些殘基回復(fù)突變?yōu)樵忌诚敌蛄?，例如僅fr1之前8個氨基酸內(nèi)或fr4之最后8個氨基酸內(nèi)發(fā)現(xiàn)之突變殘基，或僅cdr1、cdr2或cdr3內(nèi)發(fā)現(xiàn)之突變殘基。在其他實(shí)施例中，構(gòu)架及/或cdr殘基中之一或多者突變成不同生殖系序列(亦即，不同于最初得到該抗體之生殖系序列的生殖系序列)之相應(yīng)殘基。此外，本揭示之抗體可含有構(gòu)架區(qū)及/或cdr區(qū)內(nèi)兩個或更多個生殖系突變之任何組合，例如其中某些個別殘基突變?yōu)樘囟ㄉ诚敌蛄兄鄳?yīng)殘基，而與原始生殖系序列不同之某些其他殘基維持不變或突變?yōu)椴煌诚敌蛄兄鄳?yīng)殘基。一旦獲得，即可容易地測試含有一或多個生殖系突變之抗體及抗原結(jié)合片段的一或多種所需特性，該等特性為諸如改善之結(jié)合特異性、增加之結(jié)合親和力、改善或增強(qiáng)之拮抗或促效生物特性(視具體情況而定)、降低之免疫原性等。本揭示內(nèi)涵蓋以此一般方式獲得的抗體及抗原結(jié)合片段。

90、本揭示亦包括這樣一種抗epha10抗體，其包含具有一或多個保守性取代的本文所揭示之vh、vl及/或cdr氨基酸序列中之任一者的變異體。舉例而言，本揭示包括這樣一種抗epha10抗體，該抗體具有相對于本文所揭示之vh、vl及/或cdr氨基酸序列中之任一者含例如10個或更少、8個或更少、6個或更少、4個或更少等保守性氨基酸取代的vh、vl及/或cdr氨基酸序列。

91、在本揭示之一些實(shí)施例中，根據(jù)本揭示之抗體系人類化抗體。為了改善根據(jù)本揭示之人類化抗體之結(jié)合親和力，人類構(gòu)架區(qū)中之一些氨基酸殘基經(jīng)cdr之物種(例如嚙齒動物)中的相應(yīng)氨基酸殘基置換。

92、本揭示之抗體可為單特異性、雙特異性或多特異性的。多特異性抗體可對一種目標(biāo)多肽之不同抗原決定基具有特異性或可含有對多于一種目標(biāo)多肽具有特異性之抗原結(jié)合域。本揭示之抗epha10抗體可連接至另一官能性分子(例如另一種肽或蛋白質(zhì))，或與另一官能性分子共表現(xiàn)。舉例而言，抗體或其片段可與一或多個其他分子實(shí)體，諸如另一抗體或抗體片段功能性連接(例如藉由化學(xué)偶合、基因融合、非共價締合或其他方式)，以產(chǎn)生具有第二結(jié)合特異性之雙特異性或多特異性抗體。舉例而言，本揭示包括雙特異性抗體，其中免疫球蛋白之一個臂對epha10或其片段具有特異性，且免疫球蛋白之另一個臂對第二治療目標(biāo)具有特異性或與治療部分結(jié)合。

93、在一些實(shí)施例中，本揭示提供一種多特異性抗體或其抗原結(jié)合片段，其包含：

94、第一抗原結(jié)合部分，其包含如本文所揭示之抗epha10抗體或其抗原結(jié)合片段；及

95、至少一個第二抗原結(jié)合部分。

96、在一些實(shí)施例中，該第二抗原結(jié)合部分系包含對cd3中之抗原決定基具有特異性之抗體或其抗原結(jié)合片段的抗cd3部分或包含對cd16中之抗原決定基具有特異性之抗體或其抗原結(jié)合片段的抗cd16部分。

97、如本文所使用，術(shù)語“分化簇3”或“cd3”系指來自包括哺乳動物諸如靈長類動物(例如人類)及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠)在內(nèi)之任何脊椎動物來源的任何原生cd3，除非另外指示，否則其包括例如cd3ε、cd3γ、cd3α及cd3β鏈，且涵蓋全長、“未加工”之cd3(例如未加工或未修飾之cd3ε或cd3γ)，以及在細(xì)胞中加工產(chǎn)生的任何形式之cd3，諸如“經(jīng)加工”之cd3ε多肽，不含其信號肽之全部或一部分。cd3系一種多聚體蛋白復(fù)合物，歷史上稱為t3復(fù)合物，且由四條不同多肽鏈構(gòu)成：ε、γ、δ及ζ，該等多肽鏈組裝成三對二聚體(εγ、εδ、ζζ)并發(fā)揮作用。cd3復(fù)合物用作t細(xì)胞輔助受體，其與t細(xì)胞受體非共價締合。

98、在本揭示之一個實(shí)施例中，抗cd3部分具有seq?id?no:11之序列的scfv。

99、cd16(又稱為fcγriii)是已知涉及抗體依賴性細(xì)胞毒性(adcc)之一些igg之fc部分的低親和力受體，并為負(fù)責(zé)藉由nk細(xì)胞觸發(fā)目標(biāo)細(xì)胞溶解的得到最佳表征之膜受體(mandelboim等人,1999,pnas?96:5640-5644)。大多數(shù)(約90％)的人類nk細(xì)胞以低密度表現(xiàn)cd56(cd56dim)且高水平表現(xiàn)fcγriii(cd16)(cooper等人,2001,trends?immunol.22:633-640)。人類fcγriii系以兩種同功異型物，即fcγriiia及fcγriiib存在，該兩種同功異型物在其細(xì)胞外免疫球蛋白結(jié)合區(qū)中共有96％序列一致性(van?de?winkel及capel,1993,immunol.today?14(5):215-221)。

100、在本揭示之一些實(shí)施例中，抗cd16部分具有seq?id?no:12之序列的scfv。

101、在一些實(shí)施例中，該多特異性抗體或其抗原結(jié)合片段包含

102、該第一抗原結(jié)合部分及該抗cd3部分；

103、該第一抗原結(jié)合部分及該抗cd16部分；或

104、該第一抗原結(jié)合部分、該抗cd3部分及該抗cd16部分。

105、在一些實(shí)施例中，該多特異性抗體或其抗原結(jié)合片段自n末端至c末端呈以下布置：[該第一抗原結(jié)合部分]-[該抗cd3部分]、[該抗cd3部分]-[該第一抗原結(jié)合部分]、[該第一抗原結(jié)合部分]-[該抗cd16部分]、[該抗cd16部分]-[該第一抗原結(jié)合部分]、[該第一抗原結(jié)合部分]-[該抗cd3部分]-[該抗cd16部分]、[該第一抗原結(jié)合部分]-[該抗cd16部分]-[該抗cd3部分]、[該抗cd3部分]-[該第一抗原結(jié)合部分]-[該抗cd16部分]、[該抗cd3部分]-[該抗cd16部分]-[該第一抗原結(jié)合部分]、[該抗cd16部分]-[該抗cd3部分]-[該第一抗原結(jié)合部分]或[該抗cd16部分]-[該第一抗原結(jié)合部分]-[該抗cd3部分]。

106、在一些實(shí)施例中，該多特異性抗體或其抗原結(jié)合片段進(jìn)一步包含位于該第一抗原結(jié)合部分與該第二抗原結(jié)合部分中之任何兩個之間的連接符。

107、在本揭示之一些實(shí)施例中，該多特異性抗體或其抗原結(jié)合片段進(jìn)一步包含分泌信號肽。如本文所使用，信號肽(有時稱為信號序列、靶向信號、定位信號、定位序列、轉(zhuǎn)運(yùn)肽、前導(dǎo)序列或前導(dǎo)肽)系指位于預(yù)定朝向分泌路徑之蛋白質(zhì)之n末端的短肽。

108、在本揭示之一些實(shí)施例中，該多特異性抗體或其抗原結(jié)合片段進(jìn)一步包含蛋白質(zhì)純化標(biāo)簽，諸如6×his純化標(biāo)簽(hhhhhh)、myc偵測標(biāo)簽(eqkliseedl)及strepii親和純化標(biāo)簽(wshpqfek)。若采用ni-nta親和樹脂(對于6×his標(biāo)簽)或鏈霉親和素(streptactin)親和樹脂(對于strep?ii標(biāo)簽)分離未結(jié)合之受質(zhì)與經(jīng)結(jié)合產(chǎn)物，則此允許選擇經(jīng)結(jié)合產(chǎn)物。

109、根據(jù)本揭示之融合蛋白識別腫瘤細(xì)胞上之epha10、t細(xì)胞上之cd3及/或nk細(xì)胞上之cd16(trinte、bite及bike)。在本揭示之一些實(shí)施例中，融合蛋白是t細(xì)胞接合三特異性構(gòu)筑體，其以經(jīng)短連接符連接的三個單鏈可變片段(scfv)形式存在。一個scfv經(jīng)由cd3受體結(jié)合t細(xì)胞；一個scfv經(jīng)由腫瘤相關(guān)抗原結(jié)合腫瘤細(xì)胞及/或另一個結(jié)合至nk細(xì)胞cd16受體。

110、盡管不希望受理論限制，咸信根據(jù)本揭示之融合蛋白將t細(xì)胞及/或nk細(xì)胞引至癌細(xì)胞周圍。其達(dá)成之作用優(yōu)于單獨(dú)t細(xì)胞或nk細(xì)胞。在本揭示之一些實(shí)施例中，在人類t細(xì)胞存在下，trinte、bite及bike引起人類癌癥細(xì)胞之特異性殺滅。

111、在本揭示之一個優(yōu)選實(shí)施例中，抗體或其抗原結(jié)合片段或該多特異性抗體或其抗原結(jié)合片段與治療劑結(jié)合。

112、在本揭示之一些實(shí)施例中，治療劑表示細(xì)胞生長抑制劑或細(xì)胞毒性劑或具有相應(yīng)放射性同位素之同位素螯合劑。細(xì)胞生長抑制或細(xì)胞毒性劑之實(shí)例包括但不限于抗代謝物(例如氟尿嘧啶(5-fu)、氟尿苷(5-fudr)、甲胺喋呤(methotrexate)、甲酰四氫葉酸(leucovorin)、羥基脲、硫鳥嘌呤(6-tg)、巰基嘌呤(6-mp)、阿糖胞苷(cytarabine)、噴司他丁(pentostatin)、磷酸氟達(dá)拉濱(fludarabine?phosphate)、克拉屈濱(cladribine)(2-cda)、天冬酰胺酶(asparaginase)、吉西他濱(gemcitabine)、卡培他濱(capecitibine)、硫唑嘌呤(azathioprine)、胞嘧啶甲胺喋呤、甲氧芐啶(trimethoprim)、乙胺嘧啶(pyrimethamine)或培美曲塞(pemetrexed))；烷化劑(例如美法侖(cmelphalan)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、白消安(busulfan)、噻替派(thiotepa)、異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)、卡莫司汀(carmustine)、洛莫司汀(lomustine)、司莫司汀(semustine)、鏈脲菌素(streptozocin)、達(dá)喀爾巴嗪(dacarbazine)、絲裂霉素c(mitomycin?c)、環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)、甲氮芥(mechlorethamine)、烏拉莫司汀(uramustine)、二溴甘露醇(dibromomannitol)、四硝酸酯(tetranitrate)、丙卡巴肼(procarbazine)、六甲蜜胺(altretamine)、米托唑胺(mitozolomide)或替莫唑胺(temozolomide))；類烷化劑(例如順鉑(cisplatin)、卡鉑(carboplatin)、奈達(dá)鉑(nedaplatin)、奧沙利鉑(oxaliplatin)、賽特鉑(satraplatin)或特瑞鉑(triplatin))；dna小溝烷化劑(例如倍癌霉素(duocarmycins)，諸如cc-1065及任何類似物或其衍生物；吡咯并苯并二氮呯或其任何類似物或衍生物)；蒽環(huán)霉素(例如道諾霉素(daunorubicin)、小紅莓(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、埃達(dá)霉素(idarubicin)或伐柔比星(valrubicin)；抗生素(例如放線菌素d(dactinomycin)、博萊霉素(bleomycin)、光神霉素(mithramycin)、安曲霉素(anthramycin)、鏈佐霉素(streptozotocin)、短桿菌素d(gramicidin?d)、絲裂霉素(例如絲裂霉素c)；卡奇霉素；抗有絲分裂劑(包括例如類美登素(maytansinoids)(諸如dm1、dm3及dm4)、奧瑞他汀(auristatins)(包括例如單甲基奧瑞他汀e(mmae)及單甲基奧瑞他汀f(mmaf))、海兔毒素(dolastatins)、念珠藻素(cryptophycins)、長春花生物堿(vinca?alkaloids)(例如長春新堿(vincristine)、長春花堿(vinblastine)、長春地辛(vindesine)、長春瑞濱(vinorelbine))、紫杉烷(taxanes)(例如太平洋紫杉醇(paclitaxel)、多西他賽(docetaxel)或新穎紫杉烷)、妥布賴森(tubulysins)及秋水仙堿(colchicines))；拓樸異構(gòu)酶抑制劑(例如伊立替康(irinotecan)、拓樸替康(topotecan)、喜樹堿(camptothecin)、依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide)、安吖啶(amsacrine)或米托蒽醌(mitoxantrone))；hdac抑制劑(例如伏立諾他(vorinostat)、羅米地辛(romidepsin)、西達(dá)本胺(chidamide)、帕比司他(panobinostat)或貝林司他(belinostat))；蛋白酶體抑制劑(例如肽基亞硼酸)；以及放射性同位素，諸如at211、i131、i125、y90、re186、re188、sm153、bi212或bi213、p32及l(fā)u之放射性同位素，包括lu177。同位素螯合劑之實(shí)例包括但不限于乙二胺四乙酸(edta)、二伸乙基三胺-n,n,n',n",n"-五乙酸鹽(dtpa)、1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-n,n',n",n"'-四乙酸鹽(dota)、1,4,7,10-肆(2-羥丙基)-1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷(thp)、三伸乙基四胺-n,n,n',n",n"',n"'-六乙酸鹽(ttha)、1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷-n,n',n",n"'-肆(亞甲基膦酸鹽)(dotp)及巰基乙?；拾匪?mag3)。

113、在本揭示之一個實(shí)施例中，該抗體或其抗原結(jié)合片段或該多特異性抗體或其抗原結(jié)合片段是在細(xì)胞表面上表現(xiàn)。特定言之，細(xì)胞是t細(xì)胞或干細(xì)胞，諸如ipsc。誘導(dǎo)性富潛能干細(xì)胞可藉由將山中因子(yamanaka?factor)誘導(dǎo)至體細(xì)胞中來再程序化。與胚胎干細(xì)胞相同，ipsc能夠分化成三種胚層之細(xì)胞，而無需關(guān)注倫理問題。利用此特性，ipsc展現(xiàn)出有前景的臨床用途應(yīng)用。

114、在本揭示之一些實(shí)施例中，該抗體或其抗原結(jié)合片段或該多特異性抗體或其抗原結(jié)合片段呈嵌合抗原受體之形式。

115、術(shù)語“嵌合抗原受體”或者“car”指包含至少細(xì)胞外抗原結(jié)合域、跨膜域及胞質(zhì)信號傳導(dǎo)域(在本文中亦稱為“胞內(nèi)信號傳導(dǎo)域”)的重組多肽構(gòu)筑體，該胞質(zhì)信號傳導(dǎo)域包含來源于如下所定義之刺激分子的功能性信號傳導(dǎo)域。在一些實(shí)施例中，car多肽構(gòu)筑體中之各域是在同一多肽鏈中，例如構(gòu)成嵌合融合蛋白。在一些實(shí)施例中，car多肽構(gòu)筑體中各域彼此不相鄰，例如在不同多肽鏈中。car之產(chǎn)生及構(gòu)筑由以下概括：jayarama等人,ebiomedicine?58(2020)102931；zhang等人,biomarker?research(2017)5:22；feins等人,am?j?hematol.(2019)94:s3-s9；及roselli等人,j?clin?invest.2021；131(2):e142030。

116、該抗體或其抗原結(jié)合片段或該多特異性抗體或其抗原結(jié)合片段可在編碼該抗體或其抗原結(jié)合片段之載體中編碼。例示性載體為慢病毒載體?！奥《尽敝改軌蚋腥痉至鸭?xì)胞及非分裂細(xì)胞之反轉(zhuǎn)錄病毒屬。慢病毒之若干實(shí)例包括hiv(人類免疫缺乏病毒：包括第1型hiv及第2型hiv)；馬感染性貧血病毒；貓免疫缺乏病毒(fiv)；牛免疫缺乏病毒(biv)；及猿猴免疫缺乏病毒(siv)。

117、在另一態(tài)樣中，本揭示提供一種經(jīng)基因工程改造之細(xì)胞，其表現(xiàn)該抗體或其抗原結(jié)合片段或該多特異性抗體或其抗原結(jié)合片段，或含有該載體。該經(jīng)基因工程改造之細(xì)胞可為免疫細(xì)胞或干細(xì)胞。此外，本揭示提供一種免疫細(xì)胞，其是由經(jīng)基因工程改造之細(xì)胞分化得到。

118、在本揭示之一個實(shí)施例中，產(chǎn)生具有攜帶epha10基因之慢病毒的抗epha10ipsc及t細(xì)胞。另外，ipsc將此等分化成car-免疫細(xì)胞。觀察到此等car-免疫細(xì)胞對癌細(xì)胞之細(xì)胞毒性作用。本揭示提供一種克服腫瘤抗原之特異性并產(chǎn)生用于臨床癌癥治療應(yīng)用之無限制性car-免疫細(xì)胞的方法。

119、本揭示提供醫(yī)藥組合物，其包含本揭示之抗體或其抗原結(jié)合片段或該多特異性抗體或其抗原結(jié)合片段、基因工程改造之細(xì)胞或免疫細(xì)胞。本揭示之醫(yī)藥組合物是用適合稀釋劑、載劑、賦形劑及提供改良之轉(zhuǎn)移、遞送、耐受性及類似特性之其他試劑調(diào)配。該等組合物可以調(diào)配用于特定應(yīng)用，諸如用于獸醫(yī)學(xué)應(yīng)用或人類醫(yī)藥應(yīng)用。所用組合物及賦形劑、稀釋劑及/或載劑之形式將取決于抗體之預(yù)期應(yīng)用及用于治療應(yīng)用之投與模式。眾多適當(dāng)調(diào)配物可于所有醫(yī)藥化學(xué)家已知之處方集：remington's?pharmaceutical?sciences,mackpublishing?company,easton,pa。此等調(diào)配物包括例如粉劑、糊劑、軟膏、凝膠劑、蠟、油、脂質(zhì)、含有脂質(zhì)(陽離子型或陰離子型)之囊泡(諸如lipofectin.tm.,life?technologies,carlsbad,calif.)、dna結(jié)合物、無水吸收糊劑、水包油及油包水乳液、乳液卡波蠟(carbowax)(各種分子量之聚乙二醇)、半固體凝膠劑及含有卡波蠟之半固體混合物。亦參見powell等人,“compendium?of?excipients?for?parenteral?formulations”pda(1998)jpharm?sci?technol?52:238-311。

120、向患者投與之抗體的劑量可取決于患者之年齡及體型、目標(biāo)疾病、病況、投與途徑及類似因素而變化。優(yōu)選劑量通常根據(jù)體重或體表面積計算。當(dāng)使用本揭示之抗體治療成年患者的與epha10相關(guān)之病況或疾病時，靜脈內(nèi)投與本揭示之抗體可為有利的。取決于病況之嚴(yán)重程度，可調(diào)整治療之頻率及持續(xù)時間。投與抗體之有效劑量及時程可憑經(jīng)驗(yàn)確定；例如，可藉由定期評估來監(jiān)測患者進(jìn)展，且相應(yīng)地調(diào)整劑量。此外，可使用此項(xiàng)技術(shù)中熟知之方法(例如mordenti等人,1991,pharmaceut.res.8:1351)執(zhí)行劑量之種間縮放。

121、各種遞送系統(tǒng)為吾人所知且可用于投與本揭示之醫(yī)藥組合物，例如囊封于脂質(zhì)體中、微粒、微膠囊、能夠表現(xiàn)突變病毒之重組細(xì)胞、受體介導(dǎo)之內(nèi)吞作用(參見例如wu等人,1987,j.biol.chem.262:4429-4432)。引入方法包括但不限于皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、硬膜外及經(jīng)口途徑。該組合物可以藉由任何適宜途徑投與，例如藉由輸注或彈丸注射、藉由經(jīng)上皮或黏膜皮膚內(nèi)層(例如口腔黏膜、直腸黏膜和腸黏膜等)吸收投與并且可以與其他生物活性劑一起投與。投藥可為全身性或局部的。

122、可使用標(biāo)準(zhǔn)針及注射器皮下或靜脈內(nèi)遞送本揭示之醫(yī)藥組合物。此外，關(guān)于皮下遞送，筆式遞送裝置易于在遞送本揭示之醫(yī)藥組合物時應(yīng)用。此類筆式遞送裝置可為可再用的或拋棄式的。可再用的筆式遞送裝置一般利用含有醫(yī)藥組合物之可替換套筒。在投與了套筒內(nèi)之所有醫(yī)藥組合物且套筒變空后，可容易地丟棄空套筒且用含有醫(yī)藥組合物之新套筒替換。接著，可再使用筆式遞送裝置。在拋棄式筆式遞送裝置中，不存在可替換套筒。實(shí)際上，拋棄式筆式遞送裝置用保持在該裝置內(nèi)之儲集器中的醫(yī)藥組合物預(yù)填充。一旦清空儲集器之醫(yī)藥組合物，即棄去整個裝置。

123、在某些情況中，該醫(yī)藥組合物可在控制釋放系統(tǒng)中遞送。在一個實(shí)施例中，可以使用泵(參見langer,同上文；sefton,1987,crc?crit.ref.biomed.eng.14:201)。在另一實(shí)施例中，可使用聚合材料；參見medical?applications?of?controlled?release,langer?andwise(編輯),1974,crc?pres.,boca?raton,fla。在另一實(shí)施例中，控制釋放系統(tǒng)可置放在該組合物之目標(biāo)附近，因此僅需要全身性劑量之一部分(參見例如goodson,1984,medicalapplications?of?controlled?release,同上文,第2卷,第115-138頁)。其他受控釋放系統(tǒng)論述于langer,1990,science?249:1527-1533之綜述中。

124、可注射制劑可包括用于靜脈內(nèi)、皮下、皮內(nèi)及肌肉內(nèi)注射、點(diǎn)滴等之劑型。此等可注射制劑可藉由公開已知之方法制備。舉例而言，可注射制劑可例如藉由在習(xí)知用于注射之無菌水性介質(zhì)或油性介質(zhì)中溶解、懸浮或乳化上文所描述之抗體或其鹽來制備。作為注射用水性介質(zhì)，存在例如生理鹽水、含有葡萄糖及其他助劑之等張溶液等，其可與適當(dāng)增溶劑，諸如醇(例如乙醇)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇)、非離子型界面活性劑[例如聚山梨醇酯80、hco-50(氫化蓖麻油之聚氧乙烯(50mol)加合物)]等組合使用。采用例如芝麻油、大豆油等作為油性介質(zhì)，其可與增溶劑，諸如苯甲酸苯甲酯、苯甲醇等組合使用。優(yōu)選將由此制備之注射液填充于適當(dāng)安瓿中。

125、上文所描述的供經(jīng)口或非經(jīng)腸使用之醫(yī)藥組合物宜制備成呈適于符合活性成分之劑量之單位劑量的劑型。此類呈單位劑量之劑型包括例如錠劑、丸劑、膠囊、注射劑(安瓿)、栓劑等。

126、本揭示提供一種用于抑制有需要之個體中epha10介導(dǎo)之信號傳導(dǎo)的方法，其包含向該個體投與該醫(yī)藥組合物。或者，本揭示提供一種用于抑制有需要之個體中epha10介導(dǎo)之信號傳導(dǎo)的醫(yī)藥組合物，其包含有效量的如本文所揭示之抗體或其抗原結(jié)合片段或該多特異性抗體或其抗原結(jié)合片段、經(jīng)基因工程改造之細(xì)胞或免疫細(xì)胞。

127、本揭示亦提供一種用于在罹患由epha10活性及/或信號傳導(dǎo)引起或與epha10活性及/或信號傳導(dǎo)相關(guān)之疾病及/或病癥的個體中治療、預(yù)防性治療及/或預(yù)防該等疾病及/或病癥的方法，其包含向該個體投與該醫(yī)藥組合物。或者，本揭示提供一種用于在罹患由epha10活性及/或信號傳導(dǎo)引起或與epha10活性及/或信號傳導(dǎo)相關(guān)之疾病及/或病癥的個體中治療、預(yù)防性治療及/或預(yù)防該等疾病及/或病癥的醫(yī)藥組合物，其包含有效量的如本文所揭示之抗體或其抗原結(jié)合片段或該多特異性抗體或其抗原結(jié)合片段、經(jīng)基因工程改造之細(xì)胞或免疫細(xì)胞。

128、本揭示亦提供一種用于在罹患腫瘤之個體中治療、預(yù)防性治療及/或預(yù)防該腫瘤的方法，其包含向該個體投與該醫(yī)藥組合物。在本揭示之一些實(shí)施例中，腫瘤是實(shí)體腫瘤。腫瘤之實(shí)例包括但不限于腎細(xì)胞癌、胰臟癌、乳癌、頭頸癌、前列腺癌、惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤、骨肉瘤、大腸直腸癌、胃癌、惡性間皮瘤、多發(fā)性骨髓瘤、卵巢癌、小細(xì)胞肺癌、非小細(xì)胞肺癌、滑膜肉瘤、甲狀腺癌或黑色素瘤?；蛘?，本揭示提供一種用于在罹患腫瘤之個體中治療、預(yù)防性治療及/或預(yù)防該腫瘤的醫(yī)藥組合物，其包含有效量的如本文所揭示之抗體或其抗原結(jié)合片段或該多特異性抗體或其抗原結(jié)合片段、經(jīng)基因工程改造之細(xì)胞或免疫細(xì)胞。

129、本揭示提供一種用于偵測樣本中之epha10的方法，其包含使該樣本與該抗體或其抗原結(jié)合片段接觸。

130、本揭示提供一種用于中和有需要之個體中之epha10的方法，其包含向該個體投與該抗體或其抗原結(jié)合片段?；蛘?，本揭示提供一種用于中和有需要之個體中之epha10的醫(yī)藥組合物，其包含有效量的如本文所揭示之抗體或其抗原結(jié)合片段或該多特異性抗體或其抗原結(jié)合片段、經(jīng)基因工程改造之細(xì)胞或免疫細(xì)胞。

131、本揭示提供一種用于偵測樣本中之epha10的套組，其中該套組包含抗體或其抗原結(jié)合片段或該多特異性抗體或其抗原結(jié)合片段。

132、本揭示之抗epha10抗體亦可用于偵測及/或量測樣本中之epha10或epha10表現(xiàn)細(xì)胞，例如用于診斷目的。舉例而言，抗epha10抗體或其片段可用于診斷以epha10異常表現(xiàn)(例如過度表現(xiàn)、表現(xiàn)不足、缺乏表現(xiàn)等)為特征病況或疾病。用于epha10之例示性診斷分析可包含例如使獲自患者之樣本與本揭示之抗epha10抗體接觸，其中該抗epha10抗體系用可偵測標(biāo)記或報導(dǎo)體分子標(biāo)記?；蛘?，未標(biāo)記之抗epha10抗體可與自身經(jīng)可偵測標(biāo)記之二次抗體組合用于診斷應(yīng)用中?？蓚蓽y標(biāo)記或報導(dǎo)體分子可為放射性同位素，諸如3h、14c、32p、35s或125i；熒光或化學(xué)發(fā)光部分，諸如異硫氰酸熒光素或若丹明(rhodamine)；或酶，諸如堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、辣根過氧化酶或熒光素酶?？捎糜趥蓽y或量測樣本中之epha10的特定例示性分析包括酶聯(lián)免疫吸附分析(elisa)、放射免疫分析(ria)及熒光活化細(xì)胞分選(facs)。

133、提供以下實(shí)例以幫助熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者實(shí)施本揭示。

134、實(shí)例

135、噬菌體呈現(xiàn)庫篩選

136、使用人類b細(xì)胞來源之scfv噬菌體呈現(xiàn)庫(creative?biolabs,usa)淘選在c末端與ddk/his標(biāo)簽融合之重組人類epha10細(xì)胞外域蛋白質(zhì)(glu34-ala565)，轉(zhuǎn)錄物變異體3(creative?biomart,usa,目錄號epha10-369h)。使用elisa篩選陽性殖株。藉由dna定序鑒別獨(dú)特的cmu#13。藉由facs，使用表現(xiàn)全長人類epha10之nih?3t3細(xì)胞證實(shí)該等獨(dú)特殖株之結(jié)合特異性。

137、epha10-scfv-cd3z-scfv-cd16-scfv、epha10-scfv-cd3z-scfv及epha10-scfv-cd16-scfv質(zhì)體之構(gòu)筑

138、設(shè)計并構(gòu)筑三種質(zhì)體以產(chǎn)生trinte(epha10(cmu#5)-scfv(seq?id?no:9)-cd3z-scfv(seq?id?no:11)-cd16-scfv(seq?id?no:12))、bite(epha10(cmu#5)-scfv(seq?idno:9)-cd3z-scfv(seq?id?no:11))及bike(epha10(cmu#5)-scfv(seq?id?no:9)-cd3z-scfv(seq?id?no:12))。在組裝各抗體之氨基酸序列之后，合成scfv序列并將其選殖至真核表現(xiàn)載體中。

139、抗epha10/抗cd3/抗cd16?trinte抗體產(chǎn)生

140、藉由使用expifectamine?293轉(zhuǎn)染套組(thermo?fisher?scientific)將表現(xiàn)質(zhì)體短暫轉(zhuǎn)染至hek293細(xì)胞中，產(chǎn)生trinte、bite及bike。簡言之，將質(zhì)體稀釋于opti-mem中，在室溫下與預(yù)先稀釋之expifectamine混合20–30分鐘，并添加至hek293細(xì)胞中。使轉(zhuǎn)染效率優(yōu)化以測定產(chǎn)生具有良好產(chǎn)率及純度之trinte、bite及bike的最佳質(zhì)體比率。在轉(zhuǎn)染后4–5天，收集來自經(jīng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞之上清液并經(jīng)由0.45μm過濾器單元(nalgene)過濾。使用抗his珠粒純化出上清液中之trinte、bite及bike。接著，將純化之trinte、bite及bike等分并在-80℃儲存。

141、酶聯(lián)免疫吸附分析(elisa)

142、將scfv序列與小鼠igg2a序列融合并次選殖至pcdna3.1質(zhì)體中。將三種scfv-小鼠igg2a質(zhì)體轉(zhuǎn)染至hek293細(xì)胞中。藉由蛋白質(zhì)a樹脂純化三種scfv-小鼠igg2a抗體。利用間接elisa針對經(jīng)涂覆之9種epha抗原(epha1-8及10，r&d系統(tǒng))測試三種抗體。

143、結(jié)果顯示于圖1及表2中。cmu#5被證明只與epha10結(jié)合而不與其他epha結(jié)合，通過elisa測定的對epha?10的ec50為0.117nm。

144、表2

145、

146、細(xì)胞毒性分析

147、將人類乳癌細(xì)胞(bt-549)用cfse標(biāo)記并在trinte、bite、bite或pbs存在下，與純化之人類t細(xì)胞及nk細(xì)胞以指定的e:t比一起培育4小時。為了監(jiān)測自發(fā)死亡，將單獨(dú)經(jīng)cfse標(biāo)記之目標(biāo)細(xì)胞在相同條件下培養(yǎng)。4小時之后，收集細(xì)胞并在分析之前添加7-氨基放線菌素d(7aad)。將樣本充分混合并藉由流式細(xì)胞分析技術(shù)分析。

148、epha10?trinte之結(jié)果顯示于圖3中。在超過3.125μg/ml時，細(xì)胞毒性作用明顯高于對照組之作用。在超過50μg/ml時，細(xì)胞毒性百分比為約80％。由此得出結(jié)論，epha10trinte提供有效的抗腫瘤活性。

149、epha10?bite之結(jié)果顯示于圖4中。在超過50μg/ml時，細(xì)胞毒性百分比為約80％。由此得出結(jié)論，epha10?bite提供有效的抗腫瘤活性。

150、epha10?bike之結(jié)果顯示于圖4中。在超過50μg/ml時，細(xì)胞毒性百分比為約80％。由此得出結(jié)論，epha10?bike提供有效的抗腫瘤活性。

151、nk細(xì)胞及t細(xì)胞之分離及純化

152、利用流式細(xì)胞分析技術(shù)，使用人類pbmc或經(jīng)分離之t細(xì)胞及nk細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞且使用各種epha10陽性人類乳癌細(xì)胞株檢查復(fù)位向細(xì)胞之細(xì)胞毒性。使用標(biāo)準(zhǔn)程序，利用ficoll密度梯度離心自健康供體分離pbmc。簡言之，在離心后，在室溫下將細(xì)胞于10ml紅血球溶解緩沖液(sigma–aldrich)中培育10分鐘，用pbs洗滌，使其以6×106個細(xì)胞/毫升之濃度再懸浮于rpmi-1640培養(yǎng)基中?；蛘撸褂胮an?t細(xì)胞分離套組ii(miltenyi?biotec)自pbmc中分離出t細(xì)胞。對于t細(xì)胞活化，將2×106個t細(xì)胞在涂有1μg抗cd3抗體及1μg抗cd28抗體(ebioscience)之24孔盤中培養(yǎng)。將細(xì)胞在5％?co2含濕氣培育箱中在37℃下培育3天。使用nk細(xì)胞分離套組(miltenyi?biotec)自pbmc分離出nk細(xì)胞。將細(xì)胞在facs緩沖液(pbs，2％?fbs及0.02％nan3)中洗滌一次并在4℃于200μl中培育30分鐘。添加碘化丙錠(pi)達(dá)到1μg/ml最終濃度，并藉由流式細(xì)胞分析技術(shù)(bd?biosciences)分析樣本。目標(biāo)細(xì)胞溶解是以經(jīng)pi染色之細(xì)胞的百分比測定。所有實(shí)驗(yàn)均一式兩份進(jìn)行。

153、t細(xì)胞活化之表征

154、藉由流式細(xì)胞技術(shù)分析，根據(jù)cd25表現(xiàn)測定t細(xì)胞活化。將淋巴球在存在或不存在自體目標(biāo)mdm(e:t比率為4:1及8:1)之96孔盤中培育，且用trinte、bite及bike處理。在50％腹水液中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。共培養(yǎng)4天之后，收集淋巴球并用抗cd4、抗cd8、抗cd25、抗cd69、抗cd107a及抗hla-dr抗體染色。

155、nk細(xì)胞活化之表征

156、使用流式細(xì)胞分析技術(shù)，根據(jù)cd107a介導(dǎo)之脫粒及ifn-γ制造量測在處理存在或不存在下針對腫瘤目標(biāo)之nk細(xì)胞活化作用。將淋巴球在存在或不存在自體目標(biāo)mdm(e:t比率為4:1及8:1)之96孔盤中培育，且用trinte、bite及bike處理。在50％腹水液中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在共培養(yǎng)4天之后，收集淋巴球并用抗cd69、抗cd107a、抗trial、抗ifn-γ及抗tnf-α抗體染色。

157、k細(xì)胞及nk細(xì)胞活化之結(jié)果顯示于圖5中。當(dāng)共培養(yǎng)乳癌細(xì)胞及t細(xì)胞或nk細(xì)胞時，epha10?trinte處理組使細(xì)胞介素之釋放量增加約三倍。實(shí)際上，epha10?trinte增加t細(xì)胞或nk細(xì)胞之活化并增加細(xì)胞介素之釋放。

158、活體內(nèi)植入乳癌細(xì)胞

159、在接受皮下植入之1×106個mda-mb-231細(xì)胞及1×106個未刺激pbmc的nsg小鼠中評價epha10?trinte之活體內(nèi)功效。將每組六只動物用1μg或10μg?trinte靜脈內(nèi)治療，并在研究第0天、第1天、第2天及第3天，投與對照鹽水。在指定日，用測徑規(guī)量測在兩個垂直方向上之腫瘤生長，并使用下式計算腫瘤體積(mm3)：v＝(寬度2×長度)/2(taki等人,2015)。亦使用ivis量測nsg小鼠體內(nèi)之腫瘤生長。

160、結(jié)果顯示于圖7中。epha10?trinte治療組顯示對腫瘤生長之顯著抑制作用。因此，epha10?trinte顯示針對epha10陽性乳癌腫瘤之活體內(nèi)效用。

161、免疫染色

162、將t細(xì)胞、nk細(xì)胞及bt-549細(xì)胞與epha10?trinte一起培養(yǎng)。將細(xì)胞用4％pfa/pbs固定10分鐘并在4℃下與單株抗體一起培育隔夜。次日，將群落用dapi染色，用抗cd3(fitc)抗體及用抗cd16(txrd)抗體監(jiān)測bt-549。

163、結(jié)果顯示于圖8中。epha10?trinte同時結(jié)合至t細(xì)胞、nk細(xì)胞及bt-549細(xì)胞。

164、epha10-car-t慢病毒載體之構(gòu)筑

165、將cmu#5scfv(seq?id?no:9)選殖并插入含有cd8鉸鏈、cd28?tm及ic、41-bb及cd3ζ之第三代car-t慢病毒載體中。合成cmu#5scfv序列并將其次選殖至第三代car-t慢病毒載體(pcdh-ef1a-mcs)(creative?biolabs,usa)中。為了產(chǎn)生epha10?car慢病毒，將第三代car-t慢病毒載體及包裝載體(lentiarttm病毒包裝套組，creative?biolabs,usa，目錄號cart-027cl)共轉(zhuǎn)染至hek293細(xì)胞中。epha10-car?t(epha10-car?t)之產(chǎn)生

166、使用人類cd8+t細(xì)胞產(chǎn)生epha10-car?t。簡言之，用編碼cmu#5?scfv(seq?id?no:9)之car慢病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)cd8+t細(xì)胞。所有epha10-car?t細(xì)胞株皆維持在kbm502培養(yǎng)基(kohjin?bio,japan)中。每2個月測試epha10-car?t細(xì)胞株之霉?jié){菌污染情況。

167、細(xì)胞毒性分析

168、在非放射性細(xì)胞毒性分析中評價epha10-car-t細(xì)胞的細(xì)胞毒性潛力。將epha10-car-t細(xì)胞與epha10陽性mda-mb-231細(xì)胞以10之效應(yīng)物比目標(biāo)比率(e/t比率＝10；效應(yīng)細(xì)胞：epha10-car-t細(xì)胞；目標(biāo)細(xì)胞：mda-mb-231細(xì)胞)共培養(yǎng)24小時。利用mtt分析來分析mda-mb-231之細(xì)胞生存力。

169、結(jié)果顯示于圖9中。epha10-car-t細(xì)胞處理明顯降低mda-mb-231之生存力。

170、盡管已結(jié)合上述特定實(shí)施例描述本揭示，但其許多替代方案以及其修改及變化對于一般熟習(xí)此項(xiàng)技術(shù)者而言將為顯而易見的。所有此類替代方案、修改及變化被視為屬于本揭示之范圍內(nèi)。