背景技術(shù)：

1、器官移植是目前終末期器官衰竭患者的首選治療手段。然而，臨床結(jié)果中位生存率仍然較差。免疫排斥反應(yīng)是移植患者功能衰竭的主要原因。準(zhǔn)確監(jiān)測(cè)移植物對(duì)移植受體的長(zhǎng)期生存至關(guān)重要。目前檢測(cè)或確認(rèn)器官移植后移植物排斥反應(yīng)的“金標(biāo)準(zhǔn)”需要活檢樣本(例如，肺移植的經(jīng)支氣管活檢和心臟移植的心內(nèi)膜心肌活檢)，以檢測(cè)免疫細(xì)胞(如t細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等)對(duì)移植物的浸潤(rùn)和其他病理變化。這些侵入性技術(shù)成本高且存在大量并發(fā)癥。

2、受體血漿中供體來(lái)源游離細(xì)胞dna(donor-derived?cell-free?dna，cfdna)的分?jǐn)?shù)(本文稱(chēng)為供體dna分?jǐn)?shù))與器官移植排斥反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)之間正相關(guān)的發(fā)現(xiàn)，推動(dòng)了預(yù)測(cè)和預(yù)防器官移植失敗的非侵入性方法的開(kāi)發(fā)。然而，先前的研究主要集中在移植后幾個(gè)月對(duì)供體dna分?jǐn)?shù)的整體性估計(jì)上，迫切需要可用于早期檢測(cè)同種異體移植物排斥反應(yīng)和預(yù)后的非侵入性檢測(cè)方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)受體樣本中供體cfdna分?jǐn)?shù)的方法。本發(fā)明還涉及一種用于檢測(cè)已知區(qū)域中供體cfdna的高比例snp的方法。本發(fā)明的方法可以用于確立早期供體dna動(dòng)力學(xué)在移植后操作中的作用，或提供用于確定移植排斥反應(yīng)(特別是急性排斥反應(yīng))的可能性的臨床數(shù)據(jù)，或監(jiān)測(cè)受試者的免疫抑制療法。

2、第一方面，本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)移植受體樣本中供體cfdna分?jǐn)?shù)的方法，包括：

3、a)從移植受體樣本中提取dna，以及

4、b)基于snp基因分型測(cè)量供體cfdna分?jǐn)?shù)。

5、在一些實(shí)施方案中，從移植受體樣本中提取dna包括從移植前受體樣本中提取基因組dna。

6、在一些實(shí)施方案中，從移植后受體樣本中提取cfdna。

7、在一些實(shí)施方案中，優(yōu)選地，在移植后的前四周內(nèi)，優(yōu)選地在移植后三周內(nèi)，更優(yōu)選在移植后兩周內(nèi)，從移植后受體樣本中提取cfdna。例如，在移植后第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20天從受體樣本中提取cfdna。

8、在一些實(shí)施方案中，該方法包括從移植受體樣本中提取的dna制備文庫(kù)的步驟。

9、在一些實(shí)施方案中，該方法包括從移植前受體樣本中提取的基因組dna制備文庫(kù)的步驟。優(yōu)選地，將基因組dna片段化為100bp-300bp大小的長(zhǎng)度，更優(yōu)選地，為～250bp大小的長(zhǎng)度。

10、在一些實(shí)施方案中，該方法包括從移植后受體樣本中提取的cfdna制備文庫(kù)的步驟。優(yōu)選地，cfdna為60bp～200bp大小的長(zhǎng)度。

11、在一些實(shí)施方案中，該方法還包括對(duì)制備的文庫(kù)dna進(jìn)行測(cè)序的步驟。優(yōu)選地，將測(cè)序接頭連接到片段化的dna或cfdna上。

12、在一些實(shí)施方案中，在制備文庫(kù)的步驟中，對(duì)提取的dna進(jìn)行通用擴(kuò)增。優(yōu)選地，通過(guò)高通量測(cè)序?qū)U(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。

13、在一些實(shí)施方案中，在制備文庫(kù)的步驟中，對(duì)cfdna進(jìn)行末端修復(fù)。

14、在一些實(shí)施方案中，在制備文庫(kù)的步驟中，對(duì)片段化的dna或cfdna進(jìn)行da加尾處理。具體而言，將非模板damp添加到片段化的dna或cfdna的3'端。

15、在一些實(shí)施方案中，該方法包括選擇在移植前受體樣本中具有純合基因型、在移植后受體樣本中具有不同基因型的全基因組snp的步驟。如果移植前受體樣本和移植后受體樣本讀取的基因型不同，則稱(chēng)為snp。

16、在一些實(shí)施方案中，該方法包括計(jì)算每個(gè)所選snp的次要等位基因頻率(minorallele?frequency，maf)的步驟。

17、供體cfdna分?jǐn)?shù)是從每個(gè)所選snpi中減去供體分?jǐn)?shù)(本文表示為β)的所有觀(guān)測(cè)值的平均值。

18、在一些實(shí)施方案中，供體cfdna分?jǐn)?shù)利用以下公式1計(jì)算：

19、

20、其中χ是maf列表的平均值，maf列表是兩個(gè)正態(tài)分布的混合物，一個(gè)以0.5β為中心，另一個(gè)以β為中心，且0.5β<χ<β，其轉(zhuǎn)換為：

21、0.5x<0.5β

22、β<2χ。

23、給定snpi的供體基因型也為純合的(即受體為野生型/野生型和供體為突變型/突變型或相反)，βi等于maf；如果供體基因型為雜合的，βi將等于maf的兩倍(即，供體分?jǐn)?shù)的一半等于maf)。

24、首先過(guò)濾掉超出(0.5χ，2χ)范圍的異常值。為了分離兩個(gè)不同分布的值，對(duì)列表進(jìn)行排序，并找到使組內(nèi)總方差最小的最佳分離值點(diǎn)，這可描述為上述目標(biāo)函數(shù)公式1。

25、當(dāng)k＝2時(shí)，這已知為k-均值聚類(lèi)的目標(biāo)函數(shù)。然而，k-均值聚類(lèi)不能保證整體最優(yōu)(可能陷入局部最優(yōu))，而貪心算法可以在k＝2時(shí)實(shí)現(xiàn)整體最優(yōu)，時(shí)間復(fù)雜度為o(n)。排序列表中在最佳分離值點(diǎn)之前的所有值都被視為0.5β分布的樣本，然后將這些值乘以2。所得到的新值列表的平均值是預(yù)測(cè)的β，即預(yù)測(cè)的整體供體dna分?jǐn)?shù)。

26、供體cfdna分?jǐn)?shù)大于1％表示移植發(fā)生急性排斥反應(yīng)，供體cfdna分?jǐn)?shù)小于1％表示移植發(fā)生臨界排斥反應(yīng)、發(fā)生其他損傷或穩(wěn)定。

27、在一些實(shí)施方案中，該方法還包括使用移植受體樣本中檢測(cè)到的供體cfdna分?jǐn)?shù)來(lái)確定發(fā)生或可能發(fā)生主動(dòng)抑制排斥反應(yīng)的步驟。

28、在一些實(shí)施方案中，樣本是血液樣本、尿液樣本或體液樣本。

29、在一些實(shí)施方案中，移植受體是哺乳動(dòng)物，優(yōu)選地，是人類(lèi)。

30、在一些實(shí)施方案中，移植受體接受的移植選自器官移植、組織移植和細(xì)胞移植。

31、在一些實(shí)施方案中，移植受體接受的移植選自，但不限于，肺移植、腎移植、心臟移植、肝移植、胰腺移植、腸移植、胃移植、睪丸移植、陰莖移植、胸腺移植、子宮移植、骨移植、骨髓移植、肌腱移植、角膜移植、子宮移植、卵巢移植、神經(jīng)移植、胰島細(xì)胞移植、血管移植、心臟瓣膜移植、皮膚移植、手移植和/或腿移植。

32、第二方面，本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)移植受體樣本中高比例供體cfdna的方法，包括：

33、a)從移植受體樣本中提取dna，

34、b)基于snp基因分型計(jì)算供體cfdna分?jǐn)?shù)，以及

35、c)選擇高比例的供體cfdna。

36、在一些實(shí)施方案中，從移植前受體樣本中提取基因組dna。

37、在一些實(shí)施方案中，從移植后受體樣本中提取cfdna。

38、在一些實(shí)施方案中，在移植后的前兩周內(nèi)從移植后受體樣本中提取cfdna。例如，在移植后第1、4、7、10或13天從受體樣本中提取cfdna。

39、在一些實(shí)施方案中，該方法包括從移植受體樣本中提取的dna制備文庫(kù)的步驟。

40、在一些實(shí)施方案中，該方法包括從移植前受體樣本中提取的基因組dna制備文庫(kù)的步驟。優(yōu)選地，將基因組dna片段化為200bp-300bp大小的長(zhǎng)度，更優(yōu)選地，為～250bp大小的長(zhǎng)度。

41、在一些實(shí)施方案中，該方法包括從移植后受體樣本中提取的cfdna制備文庫(kù)的步驟。優(yōu)選地，cfdna為60bp～200bp大小的長(zhǎng)度。更優(yōu)選地，cfdna為～170bp大小的長(zhǎng)度。

42、在一些實(shí)施方案中，該方法還包括制備的文庫(kù)dna進(jìn)行測(cè)序的步驟。優(yōu)選地，將測(cè)序接頭連接到片段化的dna或cfdna上。

43、在一些實(shí)施方案中，在制備文庫(kù)的步驟中，對(duì)提取的dna進(jìn)行通用擴(kuò)增。優(yōu)選地，通過(guò)高通量測(cè)序?qū)U(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。

44、在一些實(shí)施方案中，在制備文庫(kù)的步驟中，對(duì)cfdna進(jìn)行末端修復(fù)。

45、在一些實(shí)施方案中，在制備文庫(kù)的步驟中，對(duì)片段化的dna或cfdna進(jìn)行da加尾處理。具體而言，將非模板damp添加到片段化的dna或cfdna的3'端。

46、在一些實(shí)施方案中，基于snp基因分型計(jì)算供體cfdna分?jǐn)?shù)的步驟包括將染色體分割成覆蓋100-1000kb、優(yōu)選400-600kb、更優(yōu)選500kb大小的窗口，并利用最大似然估計(jì)(maximum-likelihood-estimation，mle)計(jì)算供體cfdna分?jǐn)?shù)。

47、優(yōu)選地，22個(gè)常染色體被分割成分別覆蓋100-1000kb、優(yōu)選400-600kb、更優(yōu)選500kb大小的窗口(區(qū)域)。

48、在一些實(shí)施方案中，計(jì)算供體cfdna分?jǐn)?shù)的步驟包括基于供體cfdna分?jǐn)?shù)值的假定正態(tài)分布來(lái)計(jì)算每個(gè)窗口的p值，其中對(duì)于每個(gè)snp(表示為snpi)，pi值可按如下計(jì)算：

49、

50、對(duì)于所有snp，總概率p是每個(gè)pi的乘積：

51、

52、假設(shè)(在理想條件下)每個(gè)snp只有三個(gè)可能的野生型頻率值：受體和供體的{0,0.5,1}；

53、對(duì)于每個(gè)snp(表示為snpi)，支持野生型基因型ki的讀段(reads)數(shù)量和支持突變型基因型qi的讀段(reads)數(shù)量都是已知的；

54、如果給定供體dna分?jǐn)?shù)β，則cfdna樣品中snpi的野生型頻率wi具有32＝9個(gè)可能值：{0,0.5β,β,0.5(1-β),0.5,0.5(1+β),1-β,1-0.5β,1}。

55、對(duì)于給定snpi的給定β，找出給出最大pi的wi。對(duì)所有snp重復(fù)上述步驟，即可計(jì)算出給定β的最大log?p。不同的β值選擇會(huì)產(chǎn)生不同的最大log?p(即對(duì)數(shù)似然)。通過(guò)在可能的β值的指定區(qū)間內(nèi)迭代均勻間隔的數(shù)字，該方法可以找出產(chǎn)生最大對(duì)數(shù)似然的最佳β的最接近近似值。

56、優(yōu)選地，計(jì)算供體cfdna分?jǐn)?shù)的步驟包括校正多重檢驗(yàn)的中位p值。

57、在一些實(shí)施方案中，選擇高比例的供體cfdna的步驟包括為每個(gè)移植受體選擇具有fdr≤0.1的高比例供體cfdna。

58、在一些實(shí)施方案中，該方法還包括選擇高比例區(qū)域的步驟。

59、高比例區(qū)域定義為每個(gè)移植受體的fdr≤0.1。

60、在一些實(shí)施方案中，該方法還包括選擇每個(gè)移植受體的fdr≤0.1的高比例snp。

61、優(yōu)選地，根據(jù)第一方面的公式1計(jì)算每個(gè)選定snpi的供體分?jǐn)?shù)βi。

62、計(jì)算假設(shè)為正態(tài)分布的每個(gè)βi的p值，并校正多重檢驗(yàn)的中位p值。

63、在一些實(shí)施方案中，該方法還包括選擇富集顯著高比例snp的區(qū)域的步驟，其滿(mǎn)足：1)含有≥5個(gè)顯著snp，以及(2)每個(gè)顯著snp與其最近的顯著snp相距小于0.5m。

64、在一些實(shí)施方案中，高比例區(qū)域是與移植物-宿主免疫反應(yīng)和/或抗微生物活性相關(guān)的區(qū)域。例如，高比例區(qū)域是與hla-a/b/c、mica、ddr1相關(guān)的區(qū)域，如chr6:30782303-31426881，和/或與β防御素基因家族重疊的區(qū)域，如defb103/104/105/106，例如chr7:75883092-77138957和chr8:7237702-7978545。

65、在一些實(shí)施方案中，樣本是血液樣本、尿液樣本或體液樣本。

66、在一些實(shí)施方案中，移植受體是哺乳動(dòng)物，優(yōu)選地，是人類(lèi)。

67、在一些實(shí)施方案中，移植受體接受的移植選自器官移植、組織移植和細(xì)胞移植。

68、在一些實(shí)施方案中，移植受體接受的移植選自，但不限于，肺移植、腎移植、心臟移植、肝移植、胰腺移植、腸移植、胃移植、睪丸移植、陰莖移植、胸腺移植、子宮移植、骨移植、骨髓移植、肌腱移植、角膜移植、子宮移植、卵巢移植、神經(jīng)移植、胰島細(xì)胞移植、血管移植、心臟瓣膜移植、皮膚移植、手移植和/或腿移植。

69、第三方面，本發(fā)明涉及一種用于確定移植受體中移植排斥反應(yīng)可能性的方法，包括第一方面的方法步驟和/或第二方面的方法步驟。

70、第四方面，本發(fā)明涉及一種用于預(yù)測(cè)移植受體中移植排斥反應(yīng)預(yù)后的方法，包括第一方面的方法步驟和/或第二方面的方法步驟。

71、第五方面，本發(fā)明涉及一種用于診斷移植受體體內(nèi)移植發(fā)生急性排斥反應(yīng)的方法，包括第一方面的方法步驟和/或第二方面的方法步驟。

72、第六方面，本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)移植受體樣本中供體cfdna分?jǐn)?shù)、用于確定移植受體中移植排斥反應(yīng)的可能性、用于預(yù)測(cè)移植受體中移植排斥反應(yīng)的預(yù)后或用于診斷移植受體體內(nèi)移植發(fā)生急性排斥反應(yīng)的裝置，該裝置包括以下模塊：

73、(1)用于從移植受體樣本中提取dna的模塊，以及

74、(2)用于基于snp基因分型測(cè)量供體cfdna分?jǐn)?shù)的模塊。

75、在一些實(shí)施方案中，該裝置還包括用于從移植受體樣本中提取的dna制備文庫(kù)的模塊。

76、在一些實(shí)施方案中，該裝置還包括用于從移植前受體樣本中提取的基因組dna制備文庫(kù)的模塊。

77、在一些實(shí)施方案中，該裝置還包括用于從移植后受體樣本中提取的cfdna制備文庫(kù)的模塊。

78、在一些實(shí)施方案中，該裝置還包括用于對(duì)制備的文庫(kù)dna進(jìn)行測(cè)序的模塊。

79、在一些實(shí)施方案中，該裝置還包括用于通用擴(kuò)增的模塊。

80、在一些實(shí)施方案中，該裝置還包括用于選擇在移植前受體樣本中具有純合基因型，在移植后受體樣本中具有不同基因型的全基因組snp的模塊。

81、第七方面，本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)移植受體樣本中供體cfdna分?jǐn)?shù)、用于確定移植受體中移植排斥反應(yīng)的可能性、用于預(yù)測(cè)移植受體中移植排斥反應(yīng)的預(yù)后或用于診斷移植受體體內(nèi)移植發(fā)生急性排斥反應(yīng)的裝置，該裝置包括以下模塊：

82、(1)用于從移植受體樣本中提取dna的模塊；

83、(2)用于基于snp基因分型計(jì)算供體cfdna分?jǐn)?shù)的模塊，以及

84、(3)用于選擇高比例供體cfdna的模塊。

85、在一些實(shí)施方案中，該裝置還包括用于從移植受體樣本中提取的dna制備文庫(kù)的模塊。

86、在一些實(shí)施方案中，該裝置還包括用于從移植前受體樣本中提取的基因組dna制備文庫(kù)的模塊。

87、在一些實(shí)施方案中，該裝置還包括用于從移植后受體樣本中提取的cfdna制備文庫(kù)的模塊。

88、在一些實(shí)施方案中，該裝置還包括用于對(duì)制備的文庫(kù)dna進(jìn)行測(cè)序的模塊。

89、在一些實(shí)施方案中，該裝置還包括用于通用擴(kuò)增的模塊。

90、第八方面，本發(fā)明涉及用于檢測(cè)滿(mǎn)足以下條件之一的區(qū)域的試劑在確定移植受體中移植排斥反應(yīng)的可能性、預(yù)測(cè)移植受體中移植排斥反應(yīng)的預(yù)后或診斷移植受體體內(nèi)移植發(fā)生急性排斥反應(yīng)中的用途：

91、對(duì)于每個(gè)移植受體具有fdr≤0.1的高比例區(qū)域；

92、富集顯著高比例snp的區(qū)域，其滿(mǎn)足：1)含有≥5個(gè)顯著snp；以及(2)每個(gè)顯著snp與其最近的顯著snp相距小于0.5m；

93、與移植物-宿主免疫反應(yīng)和/或抗微生物活性相關(guān)的高比例區(qū)域；

94、與hla-a/b/c、mica、ddr1相關(guān)的高比例區(qū)域，例如chr6:30782303-31426881，和/或與β防御素基因家族重疊的區(qū)域，如defb103/104/105/106，例如chr7:75883092-77138957和chr8:7237702-7978545。

95、第九方面，本發(fā)明涉及檢測(cè)移植受體樣本中供體cfdna分?jǐn)?shù)的試劑在確定移植受體中移植排斥反應(yīng)的可能性、預(yù)測(cè)移植受體中移植排斥反應(yīng)的預(yù)后或診斷移植受體體內(nèi)移植發(fā)生急性排斥反應(yīng)中的用途。