背景技術：

1、逆轉錄病毒可以成為病毒樣顆粒(vlp)的有吸引力的支架。逆轉錄病毒衣殼通常缺乏許多無包膜二十面體病毒的嚴格對稱性要求(zhang等人,2015)，這表明其提高的結構靈活性，以摻入非天然蛋白質貨物。此外，逆轉錄病毒嗜性可以通過用不同的包膜糖蛋白對病毒體進行假型化來調節(jié)，這可以使得vlp能夠靶向至特定的細胞類型(cronin等人,2005)。先前的工作研究證明，將期望的蛋白質貨物融合至逆轉錄病毒gag多聚蛋白的c端，足以指導該貨物蛋白質在逆轉錄病毒顆粒之內的包裝(kaczmarczyk等人.,2011；voelkel等人,2010)。最近，已經(jīng)將相似的策略應用于將cas9?rnp包裝在逆轉錄病毒顆粒內(mangeot等人,2019)。然而，仍然需要具有治療性水平的體內遞送效率的vlp。

技術實現(xiàn)思路

0、發(fā)明概述

1、在一方面，本發(fā)明提供了含脂質顆粒，其包含(a)人內源性逆轉錄病毒(herv)包膜蛋白、人源化病毒包膜蛋白或非免疫原性細胞融合分子；(b)包含與核輸出序列(nes)偶聯(lián)的質膜定位蛋白的融合蛋白；以及(c)治療性貨物。

2、在另一方面，本發(fā)明提供了組合物，其包含(a)編碼人內源逆轉錄病毒(herv)包膜蛋白、人源化病毒包膜蛋白或非免疫原性細胞融合分子的第一核酸分子；(b)編碼融合蛋白的第二核酸分子，所述融合蛋白包含與核輸出序列(nes)偶聯(lián)的質膜定位蛋白和貨物，其中該貨物包含治療性貨物或治療性貨物的結合配偶體。在另一方面，本公開提供了編碼融合蛋白的核酸分子，該融合蛋白包含與核輸出序列(nes)偶聯(lián)的質膜定位蛋白和貨物，其中該貨物包含治療性貨物或治療性貨物的結合配偶體。

3、在另一方面，本說明書描述了含脂質顆粒，其包含(a)人內源性逆轉錄病毒(herv)包膜蛋白，(b)人源化病毒包膜蛋白或非免疫原性細胞融合分子；(c)融合蛋白，其包含與可切割接頭偶聯(lián)的質膜定位蛋白；以及(d)治療性貨物。在一些實施方案中，融合蛋白包含nes。

4、在另一方面，本公開提供了生產(chǎn)本文所述的含脂質顆粒的方法，其包括以下步驟：(a)提供系統(tǒng)，該系統(tǒng)表達(i)人內源性逆轉錄病毒(herv)包膜蛋白、人源化病毒包膜蛋白或非免疫原性細胞融合分子；(ii)包含與核輸出序列(nes)偶聯(lián)的質膜定位蛋白的融合蛋白；和(iii)貨物，其中該系統(tǒng)生成含脂質顆粒；以及任選地(b)收獲并純化含脂質顆粒。

5、在進一步的方面，本公開描述了生產(chǎn)本文所述的含脂質顆粒的方法，其包括：(a)提供系統(tǒng)，該系統(tǒng)表達(i)人內源性逆轉錄病毒(herv)包膜蛋白、人源化病毒包膜蛋白或非免疫原性細胞融合分子；(ii)包含與可切割接頭偶聯(lián)的質膜定位蛋白的融合蛋白；和(iii)貨物，其中該系統(tǒng)生成含脂質顆粒；以及任選地(b)收獲并純化含脂質顆粒。在一些實施方案中，融合蛋白包含nes。

6、在另一方面，本公開提供了生產(chǎn)本文所述的含脂質顆粒的方法，其包括(a)提供表達融合蛋白的系統(tǒng)，該融合蛋白包含(i)人源化逆轉錄病毒結構蛋白；人內源性逆轉錄病毒(herv)結構蛋白，任選地herv?gag；普列克底物蛋白(pleckstrin)同源(ph)結構域；或非免疫原性質膜募集蛋白；和(ii)核輸出序列(nes)，其中該系統(tǒng)產(chǎn)生含脂質顆粒；以及任選地(b)收獲并純化含脂質顆粒。

7、在又一方面，本公開提供了產(chǎn)生本文所述的含脂質顆粒的方法，其包括(a)提供表達融合蛋白的系統(tǒng)，該融合蛋白包含(i)人源化逆轉錄病毒結構蛋白；人內源性逆轉錄病毒(herv)結構蛋白，任選地herv?gag；普列克底物蛋白同源(ph)結構域；或非免疫原性質膜募集蛋白，(ii)可切割接頭，和(iii)貨物；其中該系統(tǒng)產(chǎn)生含脂質顆粒；以及任選地(b)收獲并純化含脂質顆粒。在一些實施方案中，融合蛋白進一步包含nes。

8、在各個實施方案中，質膜定位蛋白包含人內源性逆轉錄病毒(herv)結構蛋白，任選地herv?gag；人源化病毒結構蛋白；普列克底物蛋白同源(ph)結構域；或非免疫原性質膜募集蛋白。

9、在各個實施方案中，治療性貨物可以包含核酸酶、堿基編輯器、先導編輯器(primeeditor)、表觀遺傳編輯器、限制性核酸內切酶(任選地iis型限制性酶)、重組酶、轉錄因子、抗體、嵌合抗原受體、t細胞受體、細胞器、核酸分子、dna、rna、逆轉錄轉座子、逆轉錄酶、寡核苷酸、適體酶、適體、核酶、小分子化合物或其任何組合。在一些實施方案中，治療性貨物不包含核酸酶、逆轉錄酶、堿基編輯器或先導編輯器。在一些實施方案中，治療性貨物是蛋白質(例如，核酸酶、堿基編輯器、先導編輯器、表觀遺傳編輯器、限制性核酸內切酶(任選地iis型限制性酶)、重組酶、轉錄因子、抗體、嵌合抗原受體、t細胞受體或逆轉錄酶)。在一些實施方案中，治療性貨物是核酸分子(例如，dna、rna、逆轉錄轉座子、適體酶、適體或核酶)。在一些實施方案中，治療性貨物是表觀遺傳編輯器、限制性核酸內切酶(任選地iis型限制性酶)、重組酶、轉錄因子、抗體、嵌合抗原受體、t細胞受體、細胞器、核酸分子、dna、rna、逆轉錄轉座子、寡核苷酸、適體酶、適體、核酶、小分子化合物或其任何組合。

10、在各個實施方案中，融合蛋白可以包含按從n端到c端順序排列的質膜定位蛋白、nes和治療性貨物。融合蛋白還可以包含可切割接頭，任選地其中可切割接頭位于質膜定位蛋白和治療性貨物之間，任選地其中可切割接頭位于nes和治療性貨物之間，任選其中融合蛋白進一步包含位于可切割接頭c端的核定位序列(nls)。在一些實施方案中，nls位于融合蛋白之內，使得其在可切割接頭切割后仍附接至治療性貨物，從而允許將治療性貨物遞送至細胞核。

11、在各個實施方案中，質膜定位蛋白可以是人內源性逆轉錄病毒(herv)結構蛋白，任選地herv?gag；人源化病毒結構蛋白；普列克底物蛋白同源(ph)結構域；或非免疫原性質膜募集蛋白。

12、在各個實施方案中，治療性貨物是核酸酶、堿基編輯器、先導編輯器、表觀遺傳編輯器、限制性核酸內切酶(任選地iis型限制性酶)、重組酶、轉錄因子、抗體、嵌合抗原受體、t細胞受體、細胞器、核酸分子、dna、rna、逆轉錄轉座子、逆轉錄酶、寡核苷酸、適體酶、適體、核酶或小分子化合物或其任何組合。

13、在另一方面，本公開提供了含脂質顆粒，其包含封裝蛋白核心的脂質膜，其中該蛋白核心包含組特異性抗原(gag)蛋白酶(pro)多聚蛋白和切割產(chǎn)物，其中該含脂質顆粒進一步包含治療性貨物，其中治療性貨物存在于蛋白核心內部，并且其中切割產(chǎn)物包含(i)gag核衣殼蛋白的序列和(ii)核輸出序列(nes)，并且缺乏治療性貨物。在一些實施方案中，治療性貨物與核定位序列(nls)融合。

14、另一方面，本發(fā)明提供了含脂質顆粒，其包含包封蛋白核心的脂質膜，其中該蛋白核心包含組特異性抗原(gag)蛋白酶(pro)多聚蛋白和融合蛋白，其中該融合蛋白包含gag核衣殼蛋白的序列、治療性貨物、可切割接頭和核輸出序列(nes)，并且其中可切割接頭位于治療性貨物和nes之間。

15、在另一方面，本公開提供了含脂質顆粒的群體，其中該群體包含含脂質顆粒，該含脂質顆粒包含封裝蛋白核心的脂質膜，其中該蛋白核心包含組特異性抗原(gag)蛋白酶(pro)多聚蛋白和融合蛋白，其中該群體包含含有治療性貨物的含脂質顆粒，其中治療性貨物存在于蛋白核心內部，其中在含脂質顆粒的群體中，存在于蛋白核心內部的治療性貨物的量與融合蛋白的量的比率是至少1.5，其中融合蛋白包含第一多肽和第二多肽，并且其中第一多肽包含gag核衣殼蛋白的序列，并且第二多肽包含治療性貨物的序列。

16、在另一方面，本發(fā)明提供了組合物，其包含(i)第一多核苷酸，其包含編碼組特異性抗原(gag)蛋白酶(pro)多聚蛋白的核酸序列；(ii)第二多核苷酸，其包含編碼融合蛋白的核酸序列，其中該融合蛋白包含：gag核衣殼蛋白的序列、治療性貨物、可切割接頭和核輸出序列(nes)，并且其中該可切割接頭位于治療性貨物和nes之間。在一些實施方案中，組合物是藥物組合物。

17、在另一方面，本公開提供了融合蛋白，其包含gag核衣殼蛋白的序列、治療性貨物、可切割接頭和核輸出序列(nes)；其中可切割接頭位于治療性貨物和nes之間。

18、另一方面，本公開提供了在例如核酸編輯方法中使用本文提供的含脂質顆粒的方法。

19、在另一方面，本公開提供了用于產(chǎn)生本文提供的含脂質顆粒的細胞。在一些實施方案中，細胞包含編碼本文提供的含脂質顆粒的組分的任何核酸。

20、在另一方面，本公開提供了包含本文提供的任何含脂質納米顆粒、核酸序列、融合蛋白和組合物的試劑盒。

21、應當理解，上述構思以及下文討論的額外的構思可以以任何合適的組合排列，因為本公開在這方面不受限制。此外，當與所附的圖結合來進行考慮時，從以下對各個非限制性實施方案的詳細描述中，本公開的其它優(yōu)點和新穎的特征將變得顯而易見。

22、援引并入

23、本說明書中提及的所有出版物、專利和專利申請均通過引用并入本文，其程度如同每個單獨的出版物、專利或專利申請具體且單獨地指示通過引用并入一樣。