本公開涉及包括核酸合成的方法的技術(shù)。相關(guān)申請的交叉引用本技術(shù)要求2021年12月16日提交的美國臨時專利申請第63/290,320號的優(yōu)先權(quán)和權(quán)益，所述臨時專利申請的全部內(nèi)容出于所有目的通過引用并入本文。對序列表的引用本技術(shù)含有序列表(xml文件，名為abb-006wo_sl.xml，于2022年12月13日生成，并且大小為15,606字節(jié))，所述序列表已經(jīng)以電子方式提交并且通過引用并入本文。

背景技術(shù)：

1、酶促多核苷酸合成可通過迭代數(shù)輪的模板非依賴性核酸聚合酶(例如末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶)與dna底物結(jié)合、摻入待添加的核苷酸(例如受保護的核苷酸)、隨后的脫保護步驟來實現(xiàn)，從而允許核苷酸摻入的未來輪次。酶促核酸合成可能由于添加核苷酸后的非終止而導(dǎo)致不想要的額外插入。這可能導(dǎo)致在單個延伸步驟中添加多于一個核苷酸。在每個步驟中實現(xiàn)精確的一個核苷酸添加對于產(chǎn)生寡核苷酸的準(zhǔn)確合成是至關(guān)重要的，即使是小的插入錯誤率也會導(dǎo)致較長寡核苷酸的高比例的不準(zhǔn)確序列。因此，需要開發(fā)改進的酶促核酸合成方法和/或技術(shù)，以防止導(dǎo)致每個步驟多于一個核苷酸添加的過程。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、除其它事項外，本公開提供了多核苷酸合成的方法。例如，此類方法可用于提高寡核苷酸合成的準(zhǔn)確度和精確度，包括通過提高單核苷酸添加的精確度。

2、如本文所提供，在一些方面是減少寡核苷酸合成反應(yīng)中的非終止的方法。

3、在一些方面，本公開提供了包括使綴合物試劑與磷酸酶接觸的方法。例如，在一些實施方案中，方法包括：使包含多個聚合酶-核苷酸綴合物的綴合物試劑與磷酸酶接觸，其中所述綴合物包含通過接頭共價連接至聚合酶的核苷酸或經(jīng)修飾的核苷酸，并且其中所述磷酸酶能夠去除未遮蔽的核苷酸的一個或多個末端5'磷酸。

4、在一些實施方案中，本公開的方法包括：使包含多個聚合酶-核苷酸綴合物的綴合物試劑接觸，其中所述綴合物包含通過接頭共價連接至聚合酶的核苷酸；以及使包含多核苷酸的樣品與所述綴合物試劑接觸，其中所述綴合物的所述聚合酶催化所述綴合物的核苷酸共價添加到所述多核苷酸的3'羥基上，并且其中所述綴合物試劑與或已經(jīng)與磷酸酶一起孵育，其中所述磷酸酶能夠去除未遮蔽的核苷酸的末端5'磷酸。在一些實施方案中，共價添加的核苷酸是遮蔽的核苷酸。在一些實施方案中，末端5'磷酸可以是例如未遮蔽的核苷酸的α-磷酸、β-磷酸、χ-磷酸、δ-磷酸、ε-磷酸、-磷酸或γ-磷酸。

5、在一些實施方案中，本發(fā)明的方法包括使包含聚合酶-核苷酸綴合物組合物的所述綴合物試劑與磷酸酶接觸，其中所述綴合物包含通過接頭共價連接至聚合酶的核苷酸或經(jīng)修飾的核苷酸，并且其中所述磷酸酶能夠去除未遮蔽的核苷酸的末端5’磷酸。

6、在一些實施方案中，本公開提供了核酸合成的方法，所述方法包括：(i)提供包含多個聚合酶-核苷酸綴合物的綴合物試劑，其中所述綴合物各自包含通過接頭共價連接至聚合酶的核苷酸；以及(ii)使包含多核苷酸的樣品與所述綴合物試劑接觸，其中所述綴合物的所述聚合酶催化所述聚合酶-核苷酸綴合物的核苷酸共價添加到所述多核苷酸的3'羥基上，并且其中所述綴合物試劑與或已經(jīng)與磷酸酶一起孵育，其中所述磷酸酶能夠去除未遮蔽的核苷酸的末端5'磷酸。在一些實施方案中，共價添加的核苷酸是遮蔽的核苷酸。

7、在一些實施方案中，本公開提供了方法，所述方法包括：(i)提供包含聚合酶-核苷酸綴合物的綴合物試劑；以及(ii)使所述綴合物試劑與磷酸酶接觸，其中所述綴合物包含通過接頭共價連接至聚合酶的核苷酸，并且其中所述磷酸酶能夠去除未遮蔽的核苷酸的末端5’磷酸。

8、在一些實施方案中，接頭是可裂解接頭。

9、在一些實施方案中，本公開提供了一種核酸合成的方法，所述方法包括：提供包含多個聚合酶-核苷酸綴合物的綴合物試劑，其中所述綴合物包含通過接頭共價連接至聚合酶的核苷酸或經(jīng)修飾的核苷酸；以及使包含多核苷酸的樣品與所述綴合物試劑接觸，其中所述綴合物的所述聚合酶催化所述綴合物的遮蔽的核苷酸共價添加到所述多核苷酸的3'羥基上，并且其中所述綴合物試劑與或已經(jīng)與磷酸酶一起孵育，其中所述磷酸酶能夠從未遮蔽的核苷酸去除一個或多個末端5'磷酸。在一些實施方案中，本文提供的方法包括在添加所述綴合物之后裂解所述接頭以去除(例如，通過將核苷酸栓系至聚合酶的接頭)連接至多核苷酸的聚合酶。在一些實施方案中，本文提供的方法包括重復(fù)所述方法的每個步驟一次或多次以合成多核苷酸。

10、在一些實施方案中，本文提供的方法包括將所述綴合物試劑與所述磷酸酶一起孵育，并且所述孵育水解至少一個未遮蔽的核苷酸的至少一個末端5'磷酸。在一些實施方案中，本文提供的方法包括將所述綴合物試劑與所述磷酸酶一起孵育。在一些實施方案中，在將所述樣品與所述綴合物試劑一起孵育之前進行所述綴合物試劑與所述磷酸酶的所述孵育。在一些實施方案中，在將所述樣品與所述綴合物試劑一起孵育之前，從所述綴合物試劑中去除所述磷酸酶。在一些實施方案中，在使所述樣品與所述綴合物試劑接觸之后進行所述綴合物試劑與所述磷酸酶的所述孵育。

11、在一些實施方案中，與使用未與磷酸酶接觸的在其它方面相同的綴合物試劑的相同合成相比，所述多核苷酸合成中的非終止率降低。

12、在一些實施方案中，所述磷酸酶不會去除所述綴合物的遮蔽的核苷酸的末端5'磷酸。

13、在一些實施方案中，所述未遮蔽的核苷酸不與聚合酶連接。在一些實施方案中，所述未遮蔽的核苷酸是綴合物的一部分：其中聚合酶是未折疊的或不正確折疊的，其中所述核苷酸連接至所述聚合酶，使得所述核苷酸不被所述磷酸酶遮蔽，或者其中多個核苷酸連接至所述聚合酶。在一些實施方案中，磷酸酶去除未遮蔽的核苷酸的末端5'磷酸。

14、在一些實施方案中，所述聚合酶包含模板非依賴性聚合酶。在一些實施方案中，所述模板非依賴性聚合酶是末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(tdt)或其變體。

15、在一些實施方案中，所述磷酸酶是堿性磷酸酶或非堿性磷酸酶。

16、在一些實施方案中，所述聚合酶包含模板依賴性聚合酶。在一些實施方案中，所述聚合酶包含dna聚合酶。在一些實施方案中，所述聚合酶包含rna聚合酶。

17、本公開提供了一種包含多個綴合物的組合物，其中每個綴合物包含連接至聚合酶的核苷酸或經(jīng)修飾的核苷酸，其中由所述組合物的連接的聚合酶遮蔽的核苷酸的純度相對于所述組合物中的核苷酸(遮蔽的和未遮蔽的核苷酸)的總量大于約80％、約85％、約90％、約95％、約97％、約98％、約99％、約99.5％、或約99.9％、或約99.9％。

18、在一些實施方案中，所述多個綴合物包含小于約5％、小于約4％、小于約3％、小于約2％、小于約1％、小于約0.5％、小于約0.1％、小于約0.05％或小于約0.01％的未遮蔽的核苷酸或經(jīng)修飾的核苷酸。

19、在一些實施方案中，本文提供的組合物包含至少一種磷酸酶。在一些實施方案中，磷酸酶是堿性磷酸酶或非堿性磷酸酶。

20、在一些實施方案中，多個綴合物能夠?qū)⒑怂岱肿友由煲粋€核苷酸。在一些實施方案中，多個綴合物能夠?qū)⒑怂岱肿友由觳怀^一個核苷酸。

21、在一些實施方案中，核酸分子是單鏈的。在一些實施方案中，核酸是雙鏈的。

22、在一些方面，本公開提供了合成包含預(yù)定序列的多核苷酸的方法，所述方法包括使核酸分子與本文提供的組合物接觸。

23、在一些實施方案中，所述方法產(chǎn)生包含預(yù)定序列的多核苷酸產(chǎn)物。在一些實施方案中，與產(chǎn)物中的所有多核苷酸相比，多核苷酸產(chǎn)物具有小于約5％、小于約4％、小于約3％、小于約2％、小于約1％、小于約0.5％、小于約0.1％、小于約0.05％或小于約0.01％的包含不是預(yù)定序列的序列的多核苷酸。

24、在一些實施方案中，核酸分子是單鏈的。在一些實施方案中，核酸分子是雙鏈的。在一些實施方案中，本文提供的方法包括處理包含聚合酶-核苷酸綴合物的組合物，包括使所述組合物與磷酸酶接觸的步驟，其中所述磷酸酶能夠去除未遮蔽的核苷酸的末端5'磷酸。

25、在一些實施方案中，本公開的方法是減少核酸分子合成中的一個或多個非終止反應(yīng)的方法，其中所述合成在包含一個或多個未遮蔽的核苷酸的環(huán)境中進行，并且其中所述減少包括使包含聚合酶-核苷酸綴合物的綴合物試劑與磷酸酶接觸，其中所述聚合酶-核苷酸綴合物包含通過接頭栓系至聚合酶的核苷酸，其中每個核苷酸包含一個或多個磷酸，并且其中每個核苷酸包含末端5'磷酸，并且其中所述磷酸酶能夠從一個或多個未遮蔽的核苷酸去除所述末端5'磷酸。

26、在一些實施方案中，與在相同條件下但不存在磷酸酶的情況下進行的合成相比，在磷酸酶存在下進行的合成反應(yīng)中發(fā)生的非終止的數(shù)量減少。

27、在一些實施方案中，核苷酸是經(jīng)修飾的核苷酸。