本發(fā)明涉及免疫相容性人胚干細胞，產(chǎn)生所述免疫相容性人胚干細胞的方法，以及所述免疫相容性人胚干細胞用于細胞移植、藥物篩選、組織再生和/或組織修復的用途。

背景技術：

1、人類胚胎干細胞(hesc)是細胞療法和再生醫(yī)學領域寶貴的種子資源。隨著人胚干細胞分化技術的發(fā)展，基于人胚干細胞來源功能細胞在治療多種疾病的臨床試驗中發(fā)揮越來越重要的作用。然而供體細胞表面的人類白細胞抗原(human?leukocyte?antigen,hla)與受體間的不兼容性是導致供hesc臨床應用的最主要障礙之一。

2、為了解決免疫不相容的問題，理論上可以建立一個細胞庫，儲存具有各種特定患者hla配型的多個干細胞系，但儲存如此大量的hesc系需要極高的成本投入，而且能夠招募到hla純和供體的幾率非常稀少。另一種策略是產(chǎn)生自體ipscs用于患者的個性化治療，但個性化治療存在供體差異性大、無法批次生產(chǎn)，且成本高，質量控制不穩(wěn)定等問題。在異體細胞移植中，免疫抑制藥物被用來克服免疫不相容性，但往往伴隨著很高的副作用和毒性的可能性。

3、因此，產(chǎn)生通用的低免疫原性的hesc，尤其是能大范圍覆蓋中國人群的hla配型的hesc顯得尤為重要。

技術實現(xiàn)思路

1、本技術的發(fā)明人經(jīng)過大量篩選出乎意料地獲得了一株包含純合的hla-a高頻等位基因的人胚干細胞，基于此，本發(fā)明人進一步獲得了一種免疫相容性人胚干細胞以及產(chǎn)生所述免疫相容性人胚干細胞的方法，并由此完成了本發(fā)明。

2、人胚干細胞及細胞群

3、在第一方面，本發(fā)明提供了一種經(jīng)遺傳修飾的人胚干細胞，其通過對具有純合hla-a基因的人胚干細胞進行基因組編輯獲得，其中，所述經(jīng)遺傳修飾的人胚干細胞不表達可檢測蛋白水平的hla-b、hla-c和hla-ii。

4、檢測細胞是否表達hla-b、hla-c或hla-ii的方法是本領域已知的。在一個實施方案中，該測定是通過逆轉錄酶聚合酶鏈反應(rt-pcr)檢測該基因的mrna表達水平。在另一個實施方案中，該測定包括通過電泳凝膠電泳或毛細管電泳檢測該基因的pcr擴增產(chǎn)物。

5、此外，可以測試細胞以確認hla?ii復合物是否在細胞表面上表達。同樣，該測定是本領域已知的。典型地，可以通過使用基于結合人hla?ii類hla-dr、dp和大多數(shù)dq抗原的商業(yè)抗體進行western?blot或流式細胞術(facs)分析來完成。

6、在某些實施方案中，通過facs分析確定經(jīng)遺傳修飾的人胚干細胞不表達mhc?ii/hla-ii。

7、在某些實施方案中，通過凝膠電泳分析pcr擴增產(chǎn)物確定經(jīng)遺傳修飾的人胚干細胞的hla-b和hla-c基因被敲除，從而確定不表達hla-b、hla-c。

8、在某些實施方案中，所述經(jīng)遺傳修飾的人胚干細胞的內源hla-a基因的兩個等位基因為hla-a*11:01。

9、在某些實施方案中，所述基因組編輯包括敲除內源hla-b基因、hla-c基因和ciita基因的兩個等位基因。

10、在本文中，在基因的背景下“敲除”意味著攜帶敲除的宿主細胞不產(chǎn)生該基因的功能性蛋白質產(chǎn)物。敲除可以以多種方式由去除全部或部分編碼序列、引入移碼突變使得不產(chǎn)生功能性蛋白質(截短的或無義的序列)、去除或改變調節(jié)組分(例如啟動子)使得基因不被轉錄、通過與mrna的結合阻止翻譯等來產(chǎn)生。通常，敲除在基因組dna水平上進行，使得細胞的后代也永久地攜帶敲除。

11、在某些實施方案中，所述內源hla-b基因的外顯子3到外顯子8的基因片段被敲除。在某些實施方案中，所述被敲除的hla-b基因具有如seq?id?no:10所示的序列。

12、在某些實施方案中，所述內源hla-c基因的外顯子1到外顯子8被敲除。在某些實施方案中，所述被敲除的hla-c基因具有如seq?id?no:11所示的序列。

13、在某些實施方案中，所述內源ciita基因的外顯子2有缺失片段，導致后續(xù)序列產(chǎn)生移碼突變，使ciita基因無法正常轉錄。在某些實施方案中，所述被敲除的ciita基因具有如seq?id?no:12、13和/或14所示的序列。

14、在某些實施方案中，所述具有純合hla-a基因的人胚干細胞保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心(cgmcc)，且具有保藏號cgmcc19667。

15、在某些實施方案中，所述的經(jīng)遺傳修飾的人胚干細胞保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心(cgmcc)，且具有保藏號cgmcc45535。

16、在某些實施方案中，所述基因組編輯還包括敲入可調控的自殺元件。

17、在某些實施方案中，所述自殺元件選自hsv-tk(單純皰疹病毒胸苷激酶)或caspase9(誘導凋亡相關基因)。

18、在某些實施方案中，所述caspase9具有如seq?id?no:17所示的序列。

19、在某些實施方案中，使所述的經(jīng)遺傳修飾的人胚干細胞與激活或誘導fkbp二聚化的小分子物質接觸，以調控所述的經(jīng)遺傳修飾的人胚干細胞凋亡。

20、在某些實施方案中，所述小分子物質選自利米多賽(rimiducid)和/或b/bhomodimerizer。

21、在某些實施方案中，所述的經(jīng)遺傳修飾的人胚干細胞保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心(cgmcc)，且具有保藏號cgmcc45536。

22、在本文中，在基因的背景下“敲入”意味是利用基因同源重組，將外源有功能基因(基因組原先不存在、或已失活的基因)，轉入細胞與基因組中的同源序列進行同源重組，插入到基因組中，在細胞內獲得表達的技術。

23、檢測細胞是否表達自殺元件(例如，caspase9)的方法是本領域已知的。在一個實施方案中，該測定是通過逆轉錄酶聚合酶鏈反應(rt-pcr)檢測該基因的mrna表達水平。在另一個實施方案中，該測定包括通過電泳凝膠電泳或毛細管電泳檢測該基因的pcr擴增產(chǎn)物。

24、在某些實施方案中，通過凝膠電泳分析pcr擴增產(chǎn)物確定經(jīng)遺傳修飾的人胚干細胞的自殺元件(例如，caspase9)被敲入，從而確定表達caspase9。

25、在第二方面，本發(fā)明提供了一種細胞群，其包含選自下列的細胞：所述經(jīng)遺傳修飾的人胚干細胞。

26、在某些實施方案中，所述細胞群中所包含的經(jīng)遺傳修飾的人胚干細胞的比例不低于90％，例如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％。在某些實施方案中，所述細胞群中所包含的經(jīng)遺傳修飾的人胚干細胞的比例為100％。

27、在第三方面，本發(fā)明還涉及第一方面所述的經(jīng)遺傳修飾的人胚干細胞或第二方面所述的經(jīng)遺傳修飾的人胚干細胞所述的細胞群，在制備藥物中的用途，所述藥物用于細胞移植、藥物篩選、組織再生和/或組織修復。

28、產(chǎn)生經(jīng)遺傳修飾的人胚干細胞的方法

29、在第四方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生第一方面所述的經(jīng)遺傳修飾的人胚干細胞的方法，其包括：對第一方面所述的經(jīng)遺傳修飾的人胚干細胞進行基因組編輯，以敲除內源hla-b基因、hla-c基因和ciita基因的兩個等位基因。

30、任選地，所述方法還包括：對第一方面所述的經(jīng)遺傳修飾的人胚干細胞進行基因組編輯，以敲入可調控的自殺元件。

31、在某些實施方案中，所述自殺元件選自hsv-tk(單純皰疹病毒胸苷激酶)或caspase9(誘導凋亡相關基因)。

32、在某些實施方案中，所述caspase9具有如seq?id?no:17所示的序列。

33、檢測基因是否被敲除的測定法是本領域已知的。在一個實施方案中，該測定是通過逆轉錄酶聚合酶鏈反應(rt-pcr)檢測該基因的mrna表達水平。在另一個實施方案中，該測定包括通過電泳凝膠電泳或毛細管電泳檢測該基因的pcr擴增產(chǎn)物。

34、此外，可以測試細胞以確認hla?ii復合物不在細胞表面上表達，從而確定ciita基因被敲除。同樣，該測定是本領域已知的。典型地，可以通過使用基于結合人hla?ii類hla-dr、dp和大多數(shù)dq抗原的商業(yè)抗體進行western?blot或facs分析來完成。

35、在某些實施方案中，通過facs分析確定經(jīng)遺傳修飾的人胚干細胞不表達mhc?ii/hla-ii。

36、在某些實施方案中，通過電泳凝膠電泳分析pcr擴增產(chǎn)物確定經(jīng)遺傳修飾的人胚干細胞的hla-b和hla-c基因被敲除。

37、檢測細胞是否表達自殺元件(例如，caspase9)的方法是本領域已知的。在一個實施方案中，該測定是通過逆轉錄酶聚合酶鏈反應(rt-pcr)檢測該基因的mrna表達水平。在另一個實施方案中，該測定包括通過電泳凝膠電泳或毛細管電泳檢測該基因的pcr擴增產(chǎn)物。

38、在某些實施方案中，通過凝膠電泳分析pcr擴增產(chǎn)物確定經(jīng)遺傳修飾的人胚干細胞的自殺元件(例如，caspase9)被敲入，從而確定表達caspase9。

39、在某些實施方案中，所述基因組編輯選自zfn(鋅指核酸酶)、talen(轉錄激活因子樣效應核酸酶)或crispr(成簇規(guī)律間隔短回文重復序列)/cas系統(tǒng)。

40、在一些實施方案中，使用本領域已知的crispr/cas系統(tǒng)(或crispr/cas技術)進行基因組編輯。crispr/cas系統(tǒng)包含cas蛋白以及向導rna(guide?rna，grna)，也稱為小向導rna(small?guide?rna，sgrna)。crispr技術和試劑盒是商業(yè)銷售的。在某些實施方案中，使用crispr/cas9系統(tǒng)進行基因組編輯。

41、在另一些實施方案中，使用轉錄激活因子樣效應核酸酶(talen)技術進行基因組編輯。talen是與核酸酶結合的限制酶，其可以被改造以結合并切割幾乎任何所需的dna序列。talen試劑盒是商業(yè)銷售的。

42、在另一些實施方案中，使用zfn(鋅指核酸酶)技術進行基因組編輯。鋅指核酸酶是通過將鋅指dna結合結構域與dna切割結構域融合而產(chǎn)生的人工限制酶?？梢栽O計鋅指結構域以靶向特定的所需dna序列，這使得鋅指核酸酶能夠靶向復雜基因組內的獨特序列。通過利用內源dna修復機制，這些試劑可用于精確改變高等生物的基因組，類似于crispr和talen。

43、在某些實施方案中，使用crispr/cas9系統(tǒng)進行基因組編輯。所述crispr/cas9系統(tǒng)包含cas9蛋白以及grna。所述grna包含crrna和tracrrna，crrna包含特異于靶基因的靶向序列，該靶向序列能夠識別并結合于與其互補的靶基因，以及與tracrrna互補結合的區(qū)域。所述crrna和tracrrna通過連接結構域(例如發(fā)夾rna)連接。

44、在某些實施方案中，所述使用crispr/cas9系統(tǒng)包括將包含編碼cas9蛋白和grna的核酸的一種或多種載體導入第一方面所述的人胚干細胞。在某些實施方案中，所述載體是哺乳動物細胞表達載體，例如px330、px260、px334、px335、px458、px459、px461、px462、px551或px552。在某些示例性實施方案中，所述載體是px330。在某些示例性實施方案中，所述載體包含抗生素抗性基因，例如所述抗生素是氨芐青霉素。

45、在某些實施方案中，cas9蛋白表達通過啟動子進行表達。在某些示例性實施方案中，所述啟動子是cmv啟動子。

46、在某些實施方案中，grna通過啟動子進行表達。在某些示例性實施方案中，所述啟動子是u6啟動子。

47、在某些實施方案中，所述基因組編輯包括同時或以任何順序依次進行以下步驟：

48、(1)使用crispr/cas9系統(tǒng)敲除hla-b基因的兩個等位基因；

49、(2)使用crispr/cas9系統(tǒng)敲除hla-c基因的兩個等位基因；

50、(3)使用crispr/cas9系統(tǒng)敲除ciita基因的兩個等位基因；

51、(4)使用crispr/cas9系統(tǒng)敲入caspase9基因的兩個等位基因。

52、在某些實施方案中，步驟(1)中所述的crispr/cas9系統(tǒng)包含靶向hla-b基因的grna，所述grna具有如seq?id?no:1，seq?id?no:2和/或seq?id?no:3所示的序列。

53、在某些實施方案中，步驟(2)中所述的crispr/cas9系統(tǒng)包含靶向hla-c基因的grna，所述grna包含如seq?id?no:4，seq?id?no:5，seq?id?no:6和/或seq?id?no:7所示的靶向序列。

54、在某些實施方案中，步驟(3)中所述的crispr/cas9系統(tǒng)包含靶向ciita基因的grna，所述grna包含如seq?id?no:8和/或seq?id?no:9所示的靶向序列。

55、在某些實施方案中，步驟(4)中所述的crispr/cas9系統(tǒng)包含靶向aavs1基因的grna，所述grna包含如seq?id?no:15所示的靶向序列。

56、在某些實施方案中，所述使用crispr/cas9系統(tǒng)包括將包含編碼cas9蛋白和grna的核酸的一種或多種載體導入第一方面所述的人胚干細胞。

57、在第五方面，本發(fā)明提供了一種調控第一方面所述的經(jīng)遺傳修飾的人胚干細胞凋亡的方法，所述方法包括：使所述的經(jīng)遺傳修飾的人胚干細胞與激活或誘導fkbp二聚化的小分子物質接觸，以調控所述的經(jīng)遺傳修飾的人胚干細胞凋亡。

58、在某些實施方案中，所述小分子物質選自利米多賽(rimiducid)和/或b/bhomodimerizer。

59、檢測細胞是否凋亡的方法是本領域已知的。在一個實施方案中，通過臺盼藍染色法統(tǒng)計細胞的存活率。

60、試劑盒

61、在第六方面，本發(fā)明提供了一種試劑盒，其包含：

62、第一grna和/或編碼第一grna的核苷酸序列，所述第一grna包含如seq?id?no:1，seq?id?no:2和/或seq?id?no:3所示的靶向序列；

63、第二grna和/或編碼第二grna的核苷酸序列，所述第二grna包含如seq?id?no:seqid?no:4，seq?id?no:5，seq?id?no:6和/或seq?id?no:7所示的靶向序列；

64、第三grna和/或編碼第三grna的核苷酸序列，所述第三grna包含如seq?id?no:8和/或seq?id?no:9所示的靶向序列；以及，

65、第四grna和/或編碼第四grna的核苷酸序列，所述第四grna包含如seq?id?no:8和/或seq?id?no:9所示的靶向序列。

66、在某些實施方案中，所述試劑盒進一步包含cas9蛋白或編碼cas9蛋白的核酸分子。

67、在第七方面，本發(fā)明提供了一種試劑盒，其包含一種或多種載體，所述一種或多種載體包含：

68、編碼第一grna的核酸分子，所述第一grna包含如seq?id?no:1，seq?id?no:2和/或seq?id?no:3所示的靶向序列；

69、編碼第二grna的核酸分子，所述第二grna包含所述第二grna包含如seq?id?no:seq?id?no:4，seq?id?no:5，seq?id?no:6和/或seq?id?no:7所示的靶向序列；

70、編碼第三grna的核酸分子，所述第三grna包含如seq?id?no:8和/或seq?id?no:9所示的靶向序列；以及，

71、編碼第四grna的核酸分子，所述第四grna包含如seq?id?no:8和/或seq?id?no:9所示的靶向序列。

72、在某些實施方案中，所述一種或多種載體進一步包含編碼cas9蛋白的核酸分子。

73、在一些實施方案中，一種載體可以包含編碼不同grna的4種核酸、以及編碼cas蛋白的核酸。在另一些實施方案中，一種載體可以包含編碼不同grna中的一種或多種，另一種載體可以包含編碼cas蛋白的核酸。在另一些實施方案中，一種載體可以包含編碼不同grna7以及編碼cas蛋白的核酸中的一種或多種。

74、在某些實施方案中，編碼grna的核酸和/或編碼cas蛋白的核酸可以與調節(jié)元件如啟動子可操作地連接。在某些示例性實施方案中，編碼grna的核酸與u6啟動子(例如人u6啟動子)可操作地連接。在某些示例性實施方案中，編碼cas蛋白的核酸與cmv啟動子可操作地連接。

75、在某些實施方案中，所述載體是哺乳動物細胞表達載體。在某些實施方案中，所述載體選自px330、px260、px334、px335、px458、px459、px461、px462、px551或px552。在某些實施方案中，所述載體是px330。

76、在某些實施方案中，所述載體包含抗生素抗性基因，例如氨芐青霉素抗性基因。

77、在某些示例性實施方案中，所述cas9蛋白是獲自普雷沃菌，弗朗西斯氏菌，化膿性鏈球菌，嗜熱鏈球菌，金黃色葡萄球菌或腦膜炎奈瑟球菌的cas9蛋白。

78、在某些實施方案中，所述cas9蛋白是spcas9蛋白。

79、在某些實施方案中，所述cas9蛋白具有如seq?id?no:19所示的氨基酸序列。

80、術語定義

81、在本發(fā)明中，除非另有說明，否則本文中使用的科學和技術名詞具有本領域技術人員所通常理解的含義。并且，本文中所用的免疫學、分子遺傳學、核酸化學、細胞培養(yǎng)、生物化學、細胞生物學等操作步驟均為相應領域內廣泛使用的常規(guī)步驟。同時，為了更好地理解本發(fā)明，下面提供相關術語的定義和解釋。

82、如本文中所使用的，術語“hla”或“人白細胞抗原”具有本領域技術人員通常理解的含義，其是編碼人主要組織相容性復合物(mhc)蛋白質的基因復合體。構成hla復合體的這些細胞表面蛋白質負責調節(jié)對抗原的免疫應答。在人中，存在兩種mhc：i類和ii類，“hla-i”和“hla-ii”。hla-i包括三種典型的蛋白，hla-a、hla-b和hla-c，它們從細胞內部呈遞肽，并且hla-i復合物呈遞的抗原吸引殺傷t細胞(也稱為cd8+t細胞或細胞毒性t細胞)。hla-ii包括五種蛋白，hla-dp、hladm、hla-dob、hla-dq和hla-dr，其將來自細胞外的抗原呈遞給t淋巴細胞。這刺激cd4+細胞(也稱為t輔助細胞)。應當理解，“mhc”或“hla”的使用并不意味著限制，因為它取決于基因是來自人(hla)還是鼠(mhc)。因此，當涉及哺乳動物細胞時，這些術語在本文中可互換使用。

83、如本文中所使用的，術語“ciita基因”是指編碼mhc?ii類反式激活蛋白(ciita)的基因，其序列是本領域技術人員熟知的，例如可參見geneid:4261。

84、如本文中所使用的，術語“基因組編輯”具有本領域技術人員通常理解的含義，其是指在基因組水平上對目的基因序列進行替換、切除、增加或插入外源dna序列的基因工程技術。示例性基因組編輯技術包括zfn(鋅指核酸酶)、talen(轉錄激活因子樣效應核酸酶)、crispr(成簇規(guī)律間隔短回文重復序列)/cas以及其他位點特異性核酸酶技術。這些技術使得能夠在所需的基因座位點處進行雙鏈dna斷裂。這些受控的雙鏈斷裂促進特定基因座位點的同源重組。該過程集中于用核酸內切酶靶向核酸分子的特定序列，例如染色體，所述核酸內切酶識別并結合序列并在核酸分子中誘導雙鏈斷裂。通過易錯的非同源末端連接(nhej)或通過同源重組(hr)修復雙鏈斷裂。

85、如本文中所使用的，術語“基因敲除”是指使特定基因在其所在的宿主細胞中無活性的過程，其導致不產(chǎn)生目的蛋白質或無活性形式。如本領域技術人員所理解和下文進一步描述的，這可以通過多種不同方式實現(xiàn)，包括從基因中去除核酸序列，或用其他序列中斷序列，改變閱讀框，或改變核酸的調節(jié)成分。例如，可以去除或用“無義”序列替換目的基因的全部或部分編碼區(qū)，可以去除或替換全部或部分調節(jié)序列(例如啟動子)，可以去除或替換翻譯起始序列等。

86、如本文中所使用的，術語“受試者”包括但不限于各種動物，例如哺乳動物，例如?？苿游铩ⅠR科動物、羊科動物、豬科動物、犬科動物、貓科動物、兔科動物、嚙齒類動物(例如，小鼠或大鼠)、非人靈長類動物(例如，獼猴或食蟹猴)或人。優(yōu)選地，所述受試者是人。

87、發(fā)明的有益效果

88、本發(fā)明的免疫相容性人胚干細胞具有hla-a*11:01，并且缺乏hla-b、hla-c以及hla?ii類分子的表達。hla-a*11:01是東南亞人群(例如中國人群)中最流行的hla-a等位基因之一，其在中國人群中占比高達21％，因此單獨的本發(fā)明的免疫相容性人胚干細胞即可覆蓋至少21％的中國人群的hla配型，從而可抑制這些受試者的免疫排斥，避免免疫抑制劑的使用。

89、進一步的，本發(fā)明的免疫相容性人胚干細胞敲入并表達了可調控的自殺元件，敲入自殺元件后的免疫相容性人胚干細胞可通過小分子物質有效地誘導細胞凋亡，進一步提升了本發(fā)明的免疫相容性人胚干細胞的安全性。

90、因此，本發(fā)明的免疫相容性人胚干細胞尤其適用于細胞移植、組織再生、組織修復等細胞治療領域以及藥物篩選領域，具有重大的臨床價值。

91、下面將結合附圖和實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將理解，下列附圖和實施例僅用于說明本發(fā)明，而不是對本發(fā)明的范圍的限定。根據(jù)附圖和優(yōu)選實施方案的下列詳細描述，本發(fā)明的各種目的和有利方面對于本領域技術人員來說將變得顯然。